Miðluð áhrif gegn öldrun Cistanche þykkni

EB menning

Innþekjufrumur úr naflabláæð úr mönnum voru fengnar frá American Type Culture Collection (Manassas VA, Bandaríkjunum). Frumur voru ræktaðar við 37'C með 5% CO2 æðaþelsvaxtarmiðli-2 (EGM-2; Lonza, Walkerville, MD, Bandaríkjunum) bætt við 10% nautgripafóstursermi (FBS). ECs voru ræktuð í 48 klst við 37'C með 5 prósent CO, í EGM-2 (viðmiðunar) eða HG 30 mM miðli, með eða án þess að bæta við mismunandi styrkleika Cistanche (1040 ug/ml).

Frumulífvænleikapróf

Frumur voru ræktaðar við 37'C í 72 klst. í EGM-2 æti með 2% FBS og ýmsum styrkjum af Cistanche og voru meðhöndlaðar með MTT lausn í 4 klst. Formazan útfellingar sem mynduðust voru leystar upp með dímetýlsúlfoxíði, þar sem gleypni var mæld við 570 nm með því að nota VersaMax ELISA örplötulesara (MolecularDevices, Sunnyvale, CA, Bandaríkjunum).

Klór-sár flæði próf

Frumur voru særðar og síðan var ræktunarmiðlum skipt út fyrir ferskt efni sem innihélt mismunandi styrk af Cistanche. Frumum var haldið í 24 til 48 klst. Þegar þær voru á fullum flutningi voru frumur myndaðar með smásjá (Olympus Optical Co, Ltd., Tokyo, Japan). Fluttu frumurnar voru taldar með ljóssmásjá við 200x stækkun og magnmældar handvirkt

SA-P-gal litun

To determine the number of senescent cells, SA-B-assays were performed using the SA-P-gal kit (Abcam)according to the manufacturer's instructions. Cells were fixed for 5 min in -gal fixative, washed with PBS, and then stained using -gal fixative solution at 37°C. This process was performed until p-gal staining was visible in either the experimental or control plate. SA-B-gal positive cells were observed via microscopy, with >500 frumur taldar með því að nota þrjá sjálfstæða reiti.

Western blot greining

Frumur voru teknar og lýsaðar í próteinútdráttarlausn (Intron Biotechnology, Inc, Gyeonggi, Kóreu) sem innihélt próteasa- og fosfatasahemla (10 mín við 4°C). Heildarpróteinstyrkur í flotinu var mældur með því að nota Bradford próf. Eftir upphitun við 95 gráður í 5 mínútur voru próteinsýni (30 ug) aðskilin með 8 ~ 12 prósent natríumdódecýlsúlfat-pólýakrýlamíð hlaup rafdrætti. Prótein voru síðan flutt yfir á pólývínýlídenflúoríð himnur (MilliporeBedford, MA, USA) við 100 V í 60 mín. Himnur voru ræktaðar í 5 prósent nautgripasermi albúmíni (BSA) í Tris-buffered saltvatnslausn (TBS) bætt við 0,05 prósent TBS með Tween-20 (TBST) (30 mínútur við stofuhita), síðan ræktað í 5 prósent BSA í TBST ásamt frummótefnum (1:200 til l,000) (yfir nótt við 4'C). Því næst voru himnur sáð með annaðhvort HRP-tengdum geita- eða músamótefnum (1:5,000) í klst og próteinbönd fundust með því að nota aukið efnaljómunargreiningarsett (Intron Biotechnology, Inc. ) og LAS-1000 myndavél (Fuji Film Corp., Tókýó, Japan). Hálf megindleg greining á niðurstöðum þéttleikamælinga var framkvæmd með mynd J (National Institute of Health, Bethesda, MD USA).

Mæling á NO framleiðslu NO styrk var ákvörðuð með því að greina styrk nítríts með því að nota NO prófunarsett, samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. Ljósþéttleiki var ákvarðaður við 560 nm með því að nota örplötulesara og styrkur var reiknaður út með kvörðunarferil

tölfræðigreining

Niðurstöður eru gefnar upp sem meðaltal plús staðalfrávik (SD) Tölfræðileg marktekt var ákvörðuð með einhliða dreifigreiningu (ANOVA). Post hoc samanburður milli hópa var gerður með því að nota Bonferroni margfeldissamanburðarpróf. Allir útreikningar voru gerðir með SPSS í Windows (v.23.0; IBM Corp, Armonk, NYUSA) og P-gildum<0.05 were considered statistically significant.

NIÐURSTÖÐUR OG UMRÆÐUR

Cystanche frumueitrun

Til að ákvarða frumueiturhrif Cistanche á ECs, voru frumur ræktaðar með ýmsum styrkjum af Cistanche (0 til 100g/ml) í 72 klst. Cistanche sýndi marktæk frumudrepandi áhrif (P<0.05) at concentrations >50 ug/ml á öllum tímum meðferðar (mynd 1). Því Cistanche styrkur af<50ug/ml were considered non-toxic to ECs and were used in subsequent experiments.

Mítógenvirkjaður próteinkínasa (MAPK) ferillinn stjórnar lykilferlum sem taka þátt í þróun EC æða, svo sem frumufjölgun, innrás, meinvörp og lifun, og æðamyndun (Pišlar o.fl., 2015). MAPK felur í sér ERK, c-Jun N-enda kínasa og p38 (Kim og Choi, 2010). ERK og p38 eru mikilvæg merkjaprótein sem taka þátt í sársheilun, en ERK gegnir mikilvægu hlutverki við að stjórna frumuflutningi, fjölgun, aðgreiningu og lifun (Roskoski, 2012). Í nýlegri rannsókn var stungið upp á því að p38 MAPK boðleiðin tæki þátt í sáragræðslu (Loughlin og Artlett, 2011; Kim o.fl., 2019; Wang o.fl., 2019). Í þessari rannsókn skoðuðum við próteintjáningu ERK og p38 til að bera kennsl á boðleiðir sem taka þátt í Cistanche-stýrðum EC fólksflutningum. Cistanche meðferð (40 g/mL) jók EC flæði 1.5-föld miðað við samanburðarhópinn (P<0.05) (Fig. 2A). Western blot analysis showed that Cistanche treatment (20 to 40 g/mL) significantly increased phosphorylation of ERK in ECs (P<0.05). Furthermore, Cistanche increased phosphorylation of p38 in a concentration-dependent manner; in particular, treatment with 40 g/mL Cistanche, increased activation of p38 >2.5-falt hærra en stjórnin (Bls<0.01) (Fig. 2B). These results show that 

Mynd 1.Áhrif afCistanche(Cistanche) um lífvænleika frumna. Frumur voru meðhöndlaðar með Cistanche (0 til 100g/ml) í 72 klst. Frumulífvænleikivar reiknað sem hlutfall lífvænlegra frumna sem ræktaðar voru ífjarvera Cistanche. Niðurstöður sýna meðaltal±SD. *P<0.05.