Sjálfvirk óvirkjuð veirubólusetning móður eykur ónæmi gegn PRRSV í grísum 1. hluti

Ágrip:

Ónæmi frá móður er mikilvægur þáttur fyrir lifun og velgengni afkvæma í svínum til að vernda gegn sýkla í blóðrás eins og tegund 2 svínaæxlunar- og öndunarfæraveiru (PRRSV-2).

Tilgangur þessarar rannsóknar er að kanna flutning á and-PRRSV ónæmi til grísa frá gyltum sem fengu breytta lifandi vírus (MLV) eingöngu (meðhöndlun (TRT) 0), eða í samsettri meðferð með einum af tveimur sjálfgengum óvirkjuðum bóluefni (AIV, TRT 1 plús 2). Grísir úr þessum gylltum fengu sjálfgena PRRSV-2 stofninn við tveggja vikna aldur og aðlögunarónæmissvörun þeirra (IR) var metin þar til 4 vikum eftir sáningu (dpi).

Altækur húmor og frumu IR var greind hjá gyltum sem voru fyrir farrow, í grísum, fyrir sáningu og við 2 og 4 wpi. Bæði AIV vernduðu grísina að hluta með minni lungnasjúkdómi og aukinni þyngdaraukningu; TRT 1 lækkaði einnig vírus í grísum, sem skýrist best af AIV-framkallaðri framleiðslu hlutleysandi mótefna í gyltum og flutningi þeirra til grísanna. Hjá grísum, fyrir sáningu, voru helstu altæka IFN framleiðendur CD21 plús B frumur. Frá 0 í 4 wpi minnkaði hlutverk þessara B-frumna og CD4 T-frumur urðu aðalkerfisbundnir IFN-framleiðendur.

Góðar lifandi vírusar vísa til vírusa sem valda ekki sjúkdómum og þær hafa ákveðið samband við ónæmi mannslíkamans. Lifandi vírusar geta örvað ónæmiskerfi manna til að framleiða ónæmissvörun og þar með aukið ónæmi manna. Rannsóknir hafa sýnt að eftir að mannslíkaminn er sýktur af lifandi veiru mun hann losa um miðla og frumuefni, sem geta virkjað ónæmisfrumur, stuðlað að virkni ónæmiskerfisins og aukið getu líkamans til að standast veirur.

Að auki geta góðkynja og lífvænlegar vírusar einnig hertekið frumur í samkeppni, sem gerir það erfitt fyrir sýkla að ráðast inn og fjölga sér og vernda þannig mannslíkamann fyrir öðrum sýkingum. Þess vegna getur viðeigandi góðkynja og lifandi veirusýking bætt ónæmi manna, en óhófleg sýking getur leitt til sjúkdóms. Þess vegna ætti fólk í daglegu lífi að borga eftirtekt til að stjórna sýkingu lifandi vírusa og bæta ónæmi með heilbrigðum lífsstíl. Frá þessu sjónarhorni þurfum við að bæta friðhelgi. Cistanche getur bætt ónæmi verulega. Kjötaska inniheldur margs konar líffræðilega virk efni, svo sem fjölsykrur, tvær sveppir og Huangli o.fl. Þessi innihaldsefni geta örvað ýmsa starfsemi ónæmiskerfisins. frumulíkar frumur, auka ónæmisvirkni þeirra.

Smelltu á heilsuávinning af cistanche

Í lungum voru CD8 T frumur aðal og CD4 T frumur voru auka IFN-framleiðendur, þar á meðal nýr undirhópur af svínum CD8 -CCR7 - CD4 T frumum, hugsanlega endanlega aðgreindar CD4 TEMRA frumur. Í stuttu máli sýnir þessi rannsókn fram á að bólusetning gegn AIV hjá móður getur bætt vernd grísa fyrir frávenningu gegn PRRSV-2; það sýnir mikilvægi þess að flytja hlutleysandi mótefni til grísa, og það kynnir tvö ný ónæmisfruma undirhópa í svínum - IFN-framleiðandi CD21 plús B frumur og CD8 -CCR7 - CD4 T frumur.

Leitarorð:

bólusetning móður; sjálfvirkt óvirkt bóluefni; flutningur á friðhelgi; humoral ónæmissvörun; frumumiðlað ónæmissvörun; T frumur; PRRSV; svín; IFN-framleiðandi B frumur; CD4 TEMRA frumur.

1. Inngangur

Móðurafleitt ónæmi (MDI) hjá spendýrum er óhugnanleg sinfónía ("samræmd margbreytileiki"—[1]). Í þessu kerfi, eða sinfóníu, flytur móðir ónæmisvörn (tímabundin og/eða viðvarandi) til afkvæma sinna annað hvort á meðgöngu í gegnum fylgju, eftir fæðingu í gegnum brjóstaseytingu, eða hvort tveggja [2]: menn fá immúnóglóbúlín á meðgöngu og að lokum í gegnum brjóstamjólk. seyti [3]; hundar og nagdýr fá immúnóglóbúlín á meðgöngu og í gegnum brjóstaseytingu og svín og önnur búfé fá aðeins immúnóglóbúlín í gegnum mjólkurseyti.

Svipað og aðrar tegundir fá grísir þetta MDI í formi immúnóglóbúlína, ónæmisfrumna og annarra ónæmistengdra sameinda [4,5]. Þó að hægt sé að fá immúnóglóbúlín frá mismunandi gyltum (= í krossfóstri) geta aðeins líffræðilegar mæður flutt ónæmisfrumur til afkvæma sinna [5] og magn broddmjólkur í grísum dregur verulega úr dánartíðni og bætir árangur [6 ]. Þessar ónæmisfrumur innihalda B frumur [7], auk mismunandi T-frumu undirhópa-CD4, CD8, og aðallega T-frumuviðtaka (TCR)-δ T frumur [8].

Þessa T-frumu undirmengi er síðan hægt að greina frekar á grundvelli aðgreiningarstigs þeirra og heimkynningarmynsturs. Hjá svínum er CD8 keðjan notuð til að greina CD8 - sem eru ekki óvirk frá CD8 plús mótefnavaka-reyndum eða minni CD4 T frumum [9-11]. Tjáning chemokine viðtakans (CCR) 7 aðgreinir enn frekar CCR7 plús eitla homing frá CCR7- útlægum vef-homing T frumum [12]. Með samsettri CD8 /CCR7 greiningu getum við síðan greint á milli margra mismunandi T-frumu undirmengi: CD8 -CCR7 plús barna CD4 T frumur, CD8 plús CCR7 plús CD4 T frumur í miðminni (TCM) og CD8 plús CCR7 - áhrifaminni (TEM) ) CD4 T frumur; CCR7- og eitlar sem leita að útlægum vefjum CCR7 plús CD8 T frumur, og CD8 -CCR7-, CD8 plús CCR7- og CD8 plús CCR7 plús TCR- δ T frumur.
Þó að við höfum áður greint frá því að TCR-δ T frumur úr svínum búi yfir öfugu homingmynstri samanborið við TCR- hliðstæða þeirra, hefur enn ekki verið lýst sérstöku hlutverki þessara mismunandi undirhópa [13]. Bæði eru ónæmisfrumur undirhópar og mótefni flutt til afkvæmanna til að vernda þau gegn ýmsum sýklum [4,5].

Í áratugi hefur hörmulegasti sjúkdómsvaldurinn fyrir svín verið svínaæxlunar- og öndunarfæraheilkennisvírusar (PRRSV, [14,15]). Tvær megingerðir PRRSV eru til— tegund 1 og 2 (PRRSV-1 og 2); Mikil fjölbreytni þeirra og ónæmisbælandi getu gerir PRRSV að erfiðum sjúkdómi, sem leiðir til gríðarlegs efnahagslegs tjóns fyrir svínaiðnaðinn [16] og hingað til, á meðan bóluefni veita að hluta vernd gegn PRRSV, hafa þau ekki getað stjórnað þessum sjúkdómi að fullu.

Tvær helstu bóluefnisgerðir eru fáanlegar til að vernda gegn PRRSV-breytt lifandi veiru (MLV) bóluefni og óvirkjuð bóluefni, aðallega sjálfvirk óvirkjuð bóluefni (AIVs); þó standa báðar tegundir frammi fyrir sínum áskorunum.

Langur tími til að þróa mjög ónæmisvaldandi MLV bóluefnin þýðir að þau eru venjulega ólíkari PRRSV stofnum sem eru algengir í búum og á meðan AIV er beint gegn þessum stofnum sem eru algengir í búum, gerir óvirkt eðli þeirra þau almennt minna ónæmisvaldandi.

Þessar áskoranir leiða til skorts á vernd sérstaklega hjá ungum svínum sem má rekja til þriggja þátta: Í fyrsta lagi takmarkar há stökkbreytingartíðni PRRSV misleita vernd, þannig að það dregur úr virkni MLV bóluefnis; í öðru lagi takmarkar ónæmisbælandi getu þess veikari bóluefni (td AIVs) og seinkun þess á framkalli verndandi ónæmissvörunar gerir ung svín sérstaklega næm [17]; og í þriðja lagi er skilningur okkar á ónæmissvörun við PRRSV, sérstaklega hjá grísum, takmarkaður. Loving og Lunney gáfu góða umsögn um almennan skilning á ónæmissvörun við PRRSV [18,19].

Aðallega byggt á lengri tíma til að koma á ónæmi af völdum bóluefnis gegn PRRSV, bólusetja svínaframleiðendur oft gylta og gyltur til að gera kleift að flytja ónæmi til grísa. Rannsóknir á bólusetningu móður með því að nota MLV gegn tegund PRRSV-1 hindraði ekki bólusetningu tveggja eða 3-vikna gamalla grísa og verndaði grísina að hluta gegn misleitri áreiti [20]. Þessi bólusetningaraðferð olli einnig PRRSV-1-sértækum IgG, IgA og interferóni (IFN)-seytandi frumum í broddmjólk og mjólk bólusettra gylta. Þessar IFN-framleiðandi frumur eru mjög mikilvægar í veirueyðandi svörun, þar á meðal í PRRSV [19,21].
Þessi bólusetning olli einnig sermi and-PRRSV IgG, sem var greinanlegt eftir sex vikna aldur fyrir óbólusetta grísa og hélst stöðugt í bólusettum grísum fyrir áskorun; samt var ekki hægt að greina IFN-seytandi frumur frá bakgrunnsgildum í grísum sem vanið hafa verið frá sér [22]. Þó að notkun MLVs sé staðall í iðnaði, virðist sameinuð bólusetningaráætlun með MLV prime og AIV örvunarbólusetningu lofa góðu til að vinna bug á öllum ókostum þess að nota MLVs og AIVs sjálfstætt.

Þess vegna var meginmarkmið þessarar rannsóknar að ákvarða ekki aðeins hvort, heldur einnig hvernig, mæðrabólusetning með tveimur mismunandi AIV (meðferð (TRT) 1 plús 2) getur eflt iðnaðarstaðlaða MLV bólusetningu ein og sér (TRT 0 ), til að vernda afkvæmið betur fyrir snemma PRRSV2 áskorun. Í þessu skyni rannsökuðum við bóluefnis-framkallaða húmor- og frumumiðlaða ónæmissvörun (CMI) í þessum gyltum og við ögruðum snemma afvana ungum frá gyltum innan hvers þessara hópa við 2 vikna aldur. Fylgst var með almennu og staðbundnu ónæmissvörun þessara grísa í 2-4 vikur.

Við sýnum að AIV örvun bólusetning gæti bætt vernd grísa gegn PRRSV áskorun við 2 vikna aldur og við greinum einnig undirliggjandi ónæmiskerfi og einkennir and-PRRSV humoral og CMI svörun í þessum ungu svínum. Að auki fundum við tvær nýjar frumugerðir í svínum: (1) CD8 −CCR7− CD4 T frumur sem stuðla mjög að IFN-framleiðslu í berkju- og lungnaskolun (BAL) - hugsanlegar CD4 TEMRA frumur, og (2) stór uppspretta af and-PRRSV svörun, sérstaklega í grísum - IFN-framleiðandi B frumum.

2. Efni og aðferðir

2.1. Rannsóknarhönnun, dýr og sýnavinnslu

Tilgangur þessarar rannsóknar var að meta áhrif mismunandi PRRSV2 bólusetninga fyrir móður á verndandi ónæmi hjá grísum sem vannir eru frá sér gegn PRRSV-2. Fyrir rannsóknina var PRRSV-2 stofn (restriction fragment length polymorphism (RFLP), 1-7-4) frá svínakjötsfyrirtæki í Norður-Karólínu einangrað og dreift af tveimur óháðum líffræðifyrirtækjum; þeir framleiddu tvö aðskilin sjálfsvaldandi bóluefni. Bæði bóluefnin innihéldu mismunandi séreignarhluta en innihéldu sama óvirkjaða 1-7-4 PRRSV-2 stofninn. Hönnun þessarar rannsóknar er sýnd á mynd 1.

Báðar bólusetningarnar voru gefnar í vöðva í röð af fjórum skömmtum fyrir fæðingu: samkvæmt bólusetningaráætlun svínakjötsfyrirtækisins í Norður-Karólínu voru 46 PRRSV-2 neikvæðir gyltur í gyltubúi í atvinnuskyni bólusettir með Ingelvac PRRS MLV bóluefninu (Boehringer Ingelheim Vetmedica) GmbH, Þýskalandi) níu vikum fyrir ræktun. Til að viðhalda stöðugri hugtakanotkun í þessari rannsókn verða skráðir kynþroska kvenkyns svínin (hér skilgreind sem gyltur) nefnd gyltur jafnvel eftir að þau voru ræktuð og fædd (almennt nefnd gyltur). Fjórum vikum fyrir ræktun var blóðsýnum safnað úr öllum gyltum fyrir sermi og síðan var gyltum skipt í þrjár meðferðir: TRT 0 (aðeins MLV bólusetning); TRT 1 (MLV bólusetning auk 4 skammta af óvirku (1-7-4) óvirkju bóluefni 1); eða TRT 2 (MLV bólusetning auk 4 skammta af óvirku (1-7-4) óvirkju bóluefni 2).

Gilts that did not breed were dropped from the study. 3 weeks before farrowing, blood was collected from pregnant gilts for the isolation of serum and peripheral blood mononuclear cells (PBMC). At this point, five gilts remained in both TRT 0 and TRT 2; nine gilts remained in TRT 1. Within these gilts, we selected three gilts per group to provide the piglets for the challenge study. The selected gilts had an adequate litter size (>7) og hæsta sermi fluorescent focus neutralization (FFN) titer (aðal ónæmisviðmiðanir) og hæsta CD4 T-frumu IFN- svörun (annað ónæmisviðmiðun) gegn AIV áskorunarstofni innan þeirra hóps. Fyrir TRT 1 plús 2 voru þessir FFN titrar á bilinu 1:4 til 1:128. Þar sem TRT {{10}} var ekki með neina títra gegn AIV stofninum, völdum við gylturnar með hæstu and-MLV títrana; þessi titlar voru á bilinu 1:16 til 1:32. IFN-svörun í öllum völdum gyltum var á bilinu 0,09–0,21 prósent af heildar CD4 T frumum.

Hver af þessum gyltum gaf fjóra grísi fyrir áskorunarrannsóknina. Við 2 vikna aldur (= 0 vikur eftir sýkingu, wpi) voru grísirnir fjórir með mesta meðalþyngd gots valdir fyrir áskorunarrannsóknina og fluttir til líföryggisstigs 2 húsnæðis við North Carolina State University ( NCSU) Rannsóknadýraauðlindir (LAR) (Raleigh, Norður-Karólína). Hér var þeim úthlutað af handahófi í einn af sex pennum í sama herbergi; tveir grísir í hverri meðferð voru hýstir í hverri stíu (eitt fyrir hvern gylta). Til samanburðar voru alls 36 grísir í rannsókninni með 12 grísi í hverjum meðferðarhóp.

During the study, four piglets died before the end of the study: three piglets from one gilt (TRT 0) died within 30 h of arrival at LAR and were dropped from the study. Additionally, one pig (TRT 2) was euthanized between weeks three and four of the study due to high fever (>106◦ F) og skortur á svörun við líkamlegri örvun. Þetta svín var með í öllum greiningum í gegnum viku 3 og lungun þess voru metin með tilliti til meinafræði. Engin frumuflæðisgreining (FCM) greining átti sér stað fyrir þetta dýr við krufningu.

Einum degi eftir frávenningu og komu til NCSU voru allir grísir sáðir í nefið með 1 × 105,5 PRRSV-2 veiruögnum (eiginlegur stofn 1-7-4) í 1 ml 1X fosfat-bufferuðu saltvatni (PBS, Corning, Corning, NY, USA) (500 µL/nös), haldið í liggjandi stöðu í 30 sekúndur og sett aftur í penna sína. Helmingi dýranna var fórnað við 2 dpi og hin dýrin voru fórnuð við 4 dpi. Við krufningu var BAL, lungum og barkaberkju eitlum (TrBr LNs) safnað og unnið eins og áður hefur verið lýst [13].

Sýnataka átti sér stað fyrir sáningu (0 wpi) og síðan vikulega, eins og sýnt er á mynd 1. Sermi var safnað í Serum Separator Tubes (SST) glös (Becton Dickinson (BD) Biosciences, San Jose, CA, USA), og blóði fyrir PBMC einangrun var safnað í heparín rör (BD Biosciences). Dýrahald var af National Institute of Health leiðarvísir fyrir rannsóknardýr. Grísir höfðu ótakmarkaðan aðgang að vatni, fengu bráðabirgðafæði, síðan venjulegt fæði tvisvar á dag, og haldið við 83 ◦F með 12-klst ljós/myrkri lotu. Tilraunaaðferðirnar voru samþykktar af NC State University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ID# 17-166A (29. nóvember 2017).

2.2. Vírusfjölgun, títrun og mat

PRRSV-2 veirueinangrið (stofn, 1-7-4) var fjölgað á PRRSV-neikvæðum lungnablöðrum átfrumna (PAM) í RPMI-1640, 1× með L-glútamíni (Corning, Corning, NY , Bandaríkjunum) ásamt 10 prósent nautgripasermi (FBS) (VWR, Radnor, PA, Bandaríkjunum) og 1X sýklalyfja-sveppalyfjum (Corning) (vísað til sem RPMI-heill) í um það bil 30 klst. í T-75 flöskum (Sarstedt, Nümbrecht, Þýskalandi) þar til frumudrepandi áhrif komu fram. Flöskur voru frystar-þíðaðar einu sinni og flotið var snúið við 2200 g við 4 ◦C í 10 mín. Til að einbeita veirunni var flotið síðan flutt yfir í 36 ml Nalgene skilvinduglös (Thermo Fisher Scientific, Rochester, NY, USA) og spunnið í Sorvall 100S Ultracentrifuge (Sorvall, Thermo Fisher Scientific), Newtown, CT, Bandaríkjunum) við 73. ,000 g við 4 ◦C í 2 klst.

Vökvanum var hent og kögglan var endurleyst í miðli (RPMI heill) og geymd í 100 µL deilum við -80 ◦C. Vefræktarsmitandi skammtur 50 (TCID50) títrar af veirustofnlausnum voru ákvarðaðir með því að nota PAM eins og áður hefur verið lýst (Spearman–Karber TCID50 aðferð samkvæmt OIE handbók um greiningarprófa [World Organization for Animal Health, áður Office International des Epizooties (OIE) ), „Kafli 2.8.7 Æxlunar- og öndunarfæraheilkenni svína“, Terr. Man., nr. maí 2015, 2015].

2.3. Viremia

Einangrað sermi var greint af greiningarstofu svínakjötsfyrirtækisins í Norður-Karólínu með því að nota Reverse-Transcription quantitative polymerase chain reaction (RT qPCR) með 5X MagMAX sýkla RNA/DNA setti (Thermo Fisher Scientific) og VetMAX PRRSV qPCR setti (Thermo Fisher Scientific). Bólusett gyllt sermi var PRRSV-neikvætt (qPCR) við fæðingu eins og ákvarðað var af Iowa State University Veterinary Diagnostic Laboratory (ISU VDL, Ames, IA, Bandaríkjunum). ∆Ct gildin voru reiknuð út með því að draga Ct gildi úrtaks frá Ct gildinu sem talið er PRRSV-neikvætt (Ctneg=37) fyrir PRRSV: ∆Ct=37 − Ctx.

2.4. Hlutleysandi mótefnaprófun og ákvörðun jákvæðra sýna

Sermissýni úr gyltum og grísum voru send til dýrarannsókna- og greiningarrannsóknarstofu Suður-Dakóta State University (Brookings, SD) sem lauk PRRSV-2 hlutleysandi mótefni (NA) ákvörðun með því að nota FFN og 1-7-4 sáningarstofninn. Jákvæð niðurstaða er hæsta sermisþynningin með 90 prósentum eða meiri fækkun á fjölda flúrljómandi fókusmyndandi eininga [23].

2.5. Krufningaraðferðir, stigagjöf og einangrun vefjafrumu

Við krufningu (2 eða 4 wpi) var dýrum fórnað með banvænni inndælingu Euthasol í bláæð (Covetrus, MW, 390 mg/ml pentobarbital, 50 mg fenýtóín/ml). Síðan voru lungun, thymus og TrBr LNs safnað.

Fyrir lungun voru teknar myndir af baki og kviði; lungun voru skoluð með 1× PBS til að safna berkjublöðruskoluninni (BAL) og fimm heildarsýni voru tekin til vefjafræði: eitt hvert frá hægri og vinstri hnakkablaði, hægri og vinstri miðblaðablaði og svo eitt úr aukablaðablaði. Vefjafræðisýni voru fest í formaldehýð/Zn festiefni (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA) í 24 klst, flutt yfir í 70 prósent etanól og lituð með hematoxýlíni og eósíni (H&E). Litaðar skyggnur (vefjafræði) og lungnamyndir (alvarleg meinafræði) voru sendar til ISU VDL og skorað af dýralækni sem var blindaður fyrir meðferðum og krufningardagsetningum; stig á lungnaskemmdum og millivefslungnabólgu voru gerðar eins og áður hefur verið lýst [24].

Bak- og kviðmyndir af lungnamyndum voru metnar með tilliti til hlutfalls lungna sem var fyrir áhrifum af lungnabólgu. Nánar tiltekið var hlutfall lungnabólgu metið sjónrænt fyrir hvern lungnablað og heildarhlutfall fyrir allt lungað var reiknað út frá vegnu hlutfalli hvers lungnablaðs miðað við heildarrúmmál lungna. Hver hinna fjögurra höfuðbeinablaða stóð fyrir 10 prósent, aukablaðablaða 5 prósent og hver tveggja hnakkablaða fulltrúa 27,5 prósent af heildarlungum.

Vefjameinafræðihlutar í lungum voru skoðaðir í blindni með tilliti til smásjárskemmda og hvert blað fékk áætlað stig miðað við alvarleika millivefslungnabólgu sem hér segir: 0=engar smásjárskemmdir; 1=lágmarks millivefslungnabólga; 2=væg millivefslungnabólga; 3=miðlungs millivefslungnabólga; 4=mikil millivefslungnabólga; 5=alvarleg, fjölhreiðra millivefslungnabólga; 6=alvarleg, dreifð millivefslungnabólga. Fyrir alla safnaða vefi (lungu, hóstarkirtli og TrBr LNs) var vefurinn skorinn í litla bita og pressaður í gegnum hringlaga frárennslissíur úr ryðfríu stáli (Grainger, Lake Forest, IL, USA) í 50 ml rör með ísköldu PBS til að skola út einfrumu sviflausnir. Trefjakekkir voru síaðir með 40 µm síum (BD Biosciences, San Jose, CA, Bandaríkjunum).

2.6. Einangrun útlægra blóðs, veiruörvun og IFN-FCM litun/greining

PBMC einangrun var framkvæmd með því að nota Ficoll-Paque þéttleikaskilvindu (GE Healthcare, Uppsala, Svíþjóð) og SepMate-50 ml rör (STEMCELL Technologies, Vancouver, BC, Kanada) samkvæmt samskiptareglum framleiðanda. Talningu PBMC og einfruma sviflausnarfrumna var lokið á CASY frumutalningarkerfi (Schärfe System, nú: Roche Innovatis AG, Bielefeld, Þýskalandi). Fyrir IFN-framleiðsluprófið voru 5 × 105 PBMC og eitilfrumur úr lungum og TrBr LNs húðuð í átta endurteknum í 96-brunn hringbotna plötu (Corning) í 100 µl RPMI-heilsu og hvíld yfir nótt í hitakassa við 37◦ C og 5 prósent CO2. Morguninn eftir var 100 µL af RPMI-fullkomnum PRRSV stofni 1-7-4 (margföld sýkingar, MOI=0.1) bætt í hvern brunn; plötur voru settar aftur í hitakassa í 24 klst af veiruörvun.

Síðustu 4 klst ræktunar var mónensíni (5 µg/ml, Alfa Aesar, Haverhill, MA, Bandaríkjunum) bætt við til að hindra losun IFN frá frumunum. Þegar 24 klst. ræktuninni var lokið, voru endurtekningarnar sameinaðar og litaðar eins og fram kemur í töflu 1; að meðaltali voru 276.756 stakar lifandi eitilfrumur (SLLs) skráðar á Cytoflex með CytExpert hugbúnaðinum (Beckman Coulter, Brea, CA, Bandaríkjunum). Gagnagreining var framkvæmd með FlowJo útgáfu 10.6.1 (FLOWJO LLC). Hliðstigveldið fyrir greiningu á IFN-svöruninni er sýnt á myndum 4 og 5 fyrir PBMC og í viðbótarmynd S1 og mynd 7 fyrir BAL, lungnavef og TrBr LNs.

2.7. Tölfræðigreining

Tölfræðilegar greiningar voru gerðar með því að nota Graphpad Prism 8 (Graphpad Software, San Diego, CA, Bandaríkjunum). Gögn með fullt gagnasett voru greind með annað hvort tvíhliða (í gegnum rannsóknina) eða einhliða (við krufningu) ANOVA. Gögn þar sem gagnapunkta vantaði (aðallega vegna krufningar á 50 prósentum svína við 2 dpi) voru greind með blönduðum áhrifum líkani (Restricted Maximal likelihood, REML). Allur margfaldur samanburður var gerður með Dunnetts margfalda samanburðarprófi. Gögn myndskreyting var gerð með því að nota fiðluslóðir sem sýndu dreifingu, einstaka punkta, miðgildi (eftir því sem við á, strikuð svört lína) og 25./75. millibili (sem viðeigandi, lituð lína). Fylgnigreiningar milli nAb-gilda gyltu og grísa voru gerðar með því að nota Pearson fylgnistuðla og tvíhliða 95 prósent öryggisbil.

3. Úrslit

3.1. Rannsóknarhönnun og verkun bóluefnis - klínísk einkenni, veiruhækkun, þyngdaraukning og lungnasjúkdómur

Rannsóknin var gerð eins og sýnt er á mynd 1. Við PRRSV sáningu sýndu svín væg PRRSV einkenni sem hófust innan 3-4 daga frá sýkingu – hiti [aðallega við 1 wpi, dns], svefnhöfgi, minni fæðuneysla, vægur hósti/hnerri. Enginn marktækur munur sást á þessum einkennum og hélst þau í mismiklum mæli fram að krufningu. Mynd 2 sýnir veiruhækkun, vikulega líkamsþyngdaraukningu sem og heildar- og vefjameinafræðiskor.

Eins og sýnt er á mynd 2A voru öll svín PRRSV-2 neikvæð við frávenningu og sáning í nef með PRRSV-2 olli veiruhækkun sem náði hámarki við 2 wpi. Þó að enginn munur væri á veiruhækkun milli TRT 0 og TRT 2, hafði TRT 1 marktækt minni veiruhækkun fyrstu tvær vikurnar en viðmiðunarhópurinn TRT 0. Þyngdaraukning svína í öllum hópum var mjög svipuð fyrstu þrjár vikurnar; enn í lok rannsóknarinnar – og samanborið við TRT 0 – höfðu TRT 2 og TRT 1 marktækt meiri vikulega þyngdaraukningu – mynd 2B. Sérstaklega, á meðan lungnasjúkdómur gengur almennt til baka í PRRSV sýkingu og var því svipuð milli hópa við 4 dpi (dns), lækkuðu báðar AIV bólusetningar móður, svo TRT 1 plús 2, marktækt lungnasjúkdóminn við 2 wpi: báðar minnkuðu prósentustigið af stórsæjum sárum og/eða millivefslungnabólgu (Mynd 2C, D). Tíðni stórsæja lungnaskemmda í lungum frá TRT 0 var á bilinu 20–70 prósent; aftur á móti voru flest svín í TRT 1 plús 2 með lungnaskemmdir undir 20 prósentum — mynd 2C. Á sama hátt, á meðan miðgildi vefjameinafræðiskora fyrir millivefslungnabólgu í lungum frá TRT 0 svínum var þrjú, var það 1,8 fyrir TRT 1 og 1,2 fyrir TRT 2, í sömu röð. Í samanburði við TRT 0 sýnir þetta tilhneigingu í átt að marktækni (p=0.07) og marktæka lækkun á vefjameinafræði í lungum hjá svínum frá AIV-bólusettum gyltum—Mynd 2D. Þessar upplýsingar sýna fram á að AIV bólusetning getur dregið verulega úr veiruhimnu og lungnasjúkdómum, auk þess sýna þau einnig að AIV bólusetning móður gegn PRRSV-2 getur aukið ónæmi 2-vikugamla grísa.

3.2. Örvun hlutleysandi mótefna móður og flutning þeirra til grísa

Framleiðslu ónæmissvörunar í húmor hjá gyltum og afkvæmum þeirra var greind með því að ákvarða NA FFN títra (mynd 3).

Bólusetning allra hópa með MLV framkallaði NA títra í gyltum á milli fjögurra og 64 án marktæks munar á hópunum þremur (dns). Aftur á móti, á meðan MLV bólusetning ein (TRT 0) innihélt ekki NA gegn ólíkum 1-7-4 stofni, ollu báðar AIV örvunarbólusetningarnar NA títra allt að 1:16 (fyrir TRT 2) og jafnvel 1 :128 (fyrir TRT 1)—Mynd 3A.

Þessi NA í sermi voru flutt frá móður til grísa (Mynd 3B): Á meðan TRT 0 grísir sýndu enga NA títra við 0 wpi, höfðu TRT 1 og TRT 2 grísir sermis NA til að stofna 1-7-4 áður en sýking sem var í beinni fylgni við NA-gildi móður (Mynd 3C, r=0.886, p < 0.0001). Þessir NA títrar lækkuðu fyrstu tvær vikurnar, áður en þær urðu stöðugar um 4 wpi. Samt, samanborið við TRT 0, höfðu grísir úr AIV-bólusettum gyltum (TRT 1 plús 2) marktækt hærri NA títra í sermi þegar fyrir áskorunina og þessir auknu títrar stóðu í 2–3 wpi, svo fram að 4–5 vikna aldri—Mynd 3B.

For more information:1950477648nn@gmail.com