Samhliða ónæmismeðferð með lípósómum með TLR örva og geisladiski47-SIRP eftirlitsstöð til skilvirkrar meðferðar á ristilkrabbameini

Ágrip:

Ónæmi gegn æxlum er ómissandi þáttur í krabbameinsmeðferð og er fyrst og fremst miðlað af meðfæddu ónæmissvörun, sem gegnir mikilvægu hlutverki við að hefja og móta aðlagandi ónæmissvörun. Ný sönnunargögn hafa bent á meðfædda ónæmiseftirlitsstöðvar og mynsturþekkingarviðtaka, eins og CD47 og Toll-like receptor 7 (TLR7), sem vænleg lækningaleg markmið fyrir krabbameinsmeðferð. Byggt á samrunaprótíninu Fc-CV1, sem samanstendur af SIRP afbrigði með mikilli sækni (CV1), og Fc brotinu af IgG1 mótefni úr mönnum, nýttum við efnablöndu sem tengdi Fc-CV1 við imiquimod (TLR7 örva) hlaðinn lípósóm ( CILPs) til að miða virkan á CT26. WT syngeneic ristilæxlislíkön. In vitro rannsóknir leiddu í ljós að CILPs sýndu betri eiginleika við langvarandi losun og frumuupptöku skilvirkni samanborið við óbundið imiquimod. In vivo sönnuðu mælingar að CILP sýndu skilvirkari uppsöfnun í æxlum og marktækari æxlisbælingaráhrif en viðmiðunarhóparnir. Þessi ónæmismeðferðarblanda bjó yfir kostum lítilla skammta og lítillar eiturverkana. Þessar niðurstöður sýndu fram á að sambland af meðferð með ónæmiseftirlitsstöðvun (ICB) og meðfædda ónæmisörva, eins og Fc-CV1 og imiquimod-hlaðinn lípósóm undirbúningur sem notaður var í þessari rannsókn, gæti verið mjög áhrifarík aðferð við æxlismeðferð.

Kostir cistanche tubulosa-antitumor

Leitarorð:

imiquimod; fitukorn; Fc-CV1; ónæmismeðferð; ristilkrabbamein

1. Inngangur

Alheimstíðni krabbameina heldur áfram að aukast árlega, sem er alvarleg ógn við heilsu jarðarbúa og leggur þunga byrðar á heilbrigðiskerfi. Samkvæmt skýrslu Alþjóðaheilbrigðismálastofnunarinnar, árið 2020, áttu sér stað 19,29 milljónir nýrra krabbameinstilfella og 9,96 milljónir dauðsfalla af krabbameini um allan heim [1]. Hins vegar, með stöðugum framförum í klínískri greiningu, skurðaðgerð, geislameðferð og lyfjameðferð, hafa heildarlifun og lífsgæði krabbameinssjúklinga batnað verulega. Athyglisvert er að ónæmismeðferð, sem er upprunnin með Coley bóluefninu á tíunda áratugnum [2], er á undan bæði geislameðferð og krabbameinslyfjameðferð og hefur tekið miklum framförum á síðasta áratug og gagnast krabbameinssjúklingum.

Æxlisónæmismeðferð hefur verið viðurkennd fyrir framúrskarandi lífsamrýmanleika og mikla sérhæfni og er fær um að framkalla ónæmissvörun til að útrýma æxlisfrumum [3-5]. Tvær meginaðferðir við æxlisónæmismeðferð eru ónæmisaukning og eðlileg ónæmiskerfi [6]. Mynstur ónæmisauka samanstanda aðallega af frumulyfjameðferð, æxlismeðferðarbóluefnum og einstofna mótefnum. Toll-like receptors (TLR) eru talin hugsanleg markmið fyrir ónæmismeðferð með krabbameini vegna hlutverks þeirra í virkjun hins meðfædda ónæmiskerfis. TLR örvar hafa verið þróaðir sem ónæmishjálparefni og margs konar TLR örvar eru í klínískum rannsóknum [7]. Monophosphoryl lipid A og imiquimod, TLR4 og TLR7 örvar, í sömu röð, hafa fengið samþykki Matvæla- og lyfjaeftirlitsins fyrir klíníska notkun [7-9]. Imiquimod, TLR7 örvandi [9], virkjar ónæmissvörun og eykur virkni gegn æxli með því að kveikja á TLR7 [10,11]. Stefna ónæmiskerfisins er táknuð með ónæmiseftirlitsstöðvun (ICB) lyfjum sem stjórna gallaða aðlögunaræxlisónæmissvörun. Frá því að fyrsti stöðvunarhemillinn, ipilimumab, var samþykktur til klínískrar notkunar í Bandaríkjunum árið 2011, hafa ónæmiseftirlitshemlar, eins og PD1/PDL1 hemlar, slegið í gegn í krabbameinsónæmismeðferð [12-14]. Fyrir utan aðlöguð ónæmiseftirlit sem svipar til PD1/PDL1, hafa sumir meðfæddir ónæmiseftirlitspunktar, eins og SIRP -CD47, einnig vakið mikla athygli og orðið svæði sem hafa verulegan áhuga á þróun mótefnalyfja [15-17].

SIRP -CD47 eftirlitsstöðin var fyrst auðkennd árið 1999 [18,19]. SIRP er CD47 viðtaki sem er tjáður í taugafrumum miðtaugakerfisins [20] og mergfrumur, þar á meðal einfrumur, átfrumur, kyrningafrumur og dendritic frumur. CD47 er „sjálfmerkjandi sameind“ sem er tjáð á næstum öllum eðlilegum frumum og oftjáð á flestum æxlisfrumum [21]. Á yfirborði æxlisfrumna binst CD47 við SIRP og hindrar átfrumna-miðlaða átfrumna, sem er mikilvæg leið til að flýja æxlisónæmi [22]. Sýnt hefur verið fram á að átfrumumyndun átfrumna innan æxlismíkróumhverfis getur aukist þegar binding CD47 og SIRP er læst [20-25]. Þess vegna hafa ónæmiseftirlitshemlar sem hindra CD47/SIRP brautina verið þróaðir og notaðir í krabbameinsmeðferð [26].

cistanche tubulosa-bæta ónæmiskerfið

Smelltu hér til að skoða Cistanche Enhance Immunity vörur

【Biðja um meira】 Netfang:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Í þessari rannsókn notuðum við blöndu af imiquimodi og samrunapróteini (Fc-CV1) til að meðhöndla ristilkrabbamein. CV1 er breytt raðbrigða SIRP prótein úr mönnum sem hefur 50,000-falt meiri sækni í CD47 en upprunalega próteinið [27]. Fc-CV1 var smíðað með „Knobs-into-holes“ tækni, byggt á CV1 einliða og Fc broti úr mönnum IgG1. Til að sigrast á takmörkunum á lélegri meðferðarvirkni og almennum eiturverkunum í tengslum við imiquimod [28,29], undirbjuggum við nanólípósóm með etanólsprautunaraðferðinni. Nanólípósómin hafa einkenni lítillar eiturverkana við lyfjagjöf [30,31]. Í kjölfarið var imiquimod hjúpað í lípósóm sem tengdu Fc-CV1 yfirborðinu. Að lokum getur þessi nýja nanó-undirbúningur skilað TLR7 örvum á virkan hátt í æxlisvef og hefur tvöfalda virkni sem ICB lyf og TLR örva. Það var notað til að meðhöndla CD47+ CT26.WT syngeneic colon æxlislíkan [32].

2. Niðurstöður og umræður

2.1. Einkenni LPs (Blank Liposomes), ILPs (Non-CD47-Targeted Imiquimod-Encapsulated Liposomes), CLPs (CD47 Targeted Liposomes) og CILPs (tengd Fc-CV1 til Imiquimod (TLR7 örva)-hlaðinn lípósóm)

CILPs voru útbúin með góðum árangri með etanólsprautun og ammóníumsúlfat hallaaðferðinni. Mynd 1A sýnir nýmyndunarferli CILPs. TEM greining sýndi að CILPs voru kúlulaga og einsleit í lögun (Mynd 1B). Ennfremur leiddi DLS niðurstaðan í ljós að kornastærð lípósómanna fjögurra var unimodal dreifing (Mynd 1C). Bindingahraðinn (BR) var sannreyndur með SDS-PAGE, sem er sýnd á mynd 1D, E. Mynd 1D sýnir mólmassa Fc-CV1 og hlutfallslegt bandbirtustig skiluðu og forskiluðu CILPs. BR var reiknað til að vera 67,13 ± 37,10% með mynd J's skönnunarþéttnimælingu á rafhleðsluböndum (Mynd 1E), sem gefur möguleika á að CD47-miði á æxlisfrumur.

Mynd 1. (A) Skýringarmynd af myndun CILPs. (B) TEM mynd af CILP

HPLC var notað til að greina hjúpunarvirkni (EE) imiquimod (viðbótarmynd S1). Eins og sýnt er á viðbótarmynd S1A sýndi frjálsa imiquimodið marktækan stakan topp, en CLPs sýndu engan topp við sömu prófunarskilyrði (viðbótarmynd S1B). Þess vegna er mögulegt að greina CILPs beint við prófunarskilyrðin. Eins og búist var við var litið á greiningargildi CILPs fyrir og eftir skilun sem heildarlyfjainnihald og lyfjainnihald í fitukornum, í sömu röð (viðbótarmynd S1C, D). EE fyrir imiquimod var reiknað vera 85,44 ± 4,11%. Í samanburði við tilkynnt óvirkt hleðslukerfi fyrir lyfjagjöf [33-35], náði þessi rannsókn meiri hjúpunarvirkni og þægilegra undirbúningsferli.

DLS sýndi fram á að þvermál LPs var 111.567 ± 0.655 nm, en CLPs, ILPs og CILPs sýndu aðeins stærri stærð 117.467 ± 0.34{{10} } nm, 120.233 ± 0.776 nm og 13{{30}}.033 ± 0.974 nm, í sömu röð (tafla 1). Breytingarnar á stærð þessara lípósóma má rekja til breytinga á Fc-CV1 og imiquimodi. PDI var nálægt 0,1 (tafla 1), sem gefur til kynna að þessi lyf til lyfjagjafar hafi verið mjög einsleit í dreifingu. Að auki mældust zeta-möguleiki LPs, CLPs, ILPs og CILPs vera −2,231 ± 0,167 mV, −2,492 ± 0,033 mV, −2,383 ± 0,070 mV, og ±2,07 mV, og ±2,07 mV, og ±2,07 mV, í sömu röð. , sem bendir til þess að yfirborðs-tengda Fc-CV1 og hjúpað imiquimod hafi lítil áhrif á hleðslu lípósóma.

Tafla 1. Þvermál, zeta-möguleiki, PDI og EE á LP, CLP, ILP og CILP, í sömu röð.

2.2. Skilvirkni frumuupptöku in vitro

Upptökuskilvirkni frumna CILP var metin með flúrljómunarstyrk Cy5 sem CT26.WT frumur tóku upp með því að nota High-Content Imaging System. Eins og sýnt er á mynd 2, samanborið við frjálsa Cy5 og ILP-Cy5 hópa, sýndu CILPs-Cy5 hópar sterkari frumuupptökugetu eftir 30 mínútur af ræktun. Þessar niðurstöður leiddu til þess að Fc-CV1 jók innanfrumuflutningsgetu imiquimod-hlaðinna lípósóma vegna sértækrar sækni í Fc-CV1 viðtakann, sem leiddi til öflugri æxlishemjandi áhrifa.

Mynd 2. Myndir af CT26.WT frumum eftir ræktun með frjálsu Cy5, ILPs-Cy5 og CILPs-Cy5 (rautt) í 0,5 klst, og litun með DAPI (bláu). Kvarðarstika: 50 µm. (n {{10}}). * p < 0,05; **** p < 0,0001

2.3. Losunarferlar lípósóma

Lyfjalosunarferlar óbundinna imiquimods, ILPs og CILPs voru mældir í eftirlíkingu in vivo umhverfi. Mynd 3 sýnir að frjálsa imiquimodið losnaði að öllu leyti eftir 1 klst., en losunarhraði (RR) imiquimods sem hjúpað var ILP og CILP var aðeins 54,75 ± 4.08% og 39,70 ± 0,05% eftir 12 klst. , í sömu röð. Ennfremur væri hægt að loka hægri losun imiquimods í ILP og CILP með stýrðum lyfjalosunareiginleikum lípósóma. RR fyrir imiquimod í ILPs og CILPs sýndi engan marktækan mun eftir 96 klst., sem bendir til þess að "eftir innsetningu" hafi óveruleg áhrif á himnustöðugleika lípósóma.

mynd 3. Imiquimod losunarferlar fyrir frjálsa imiquimod, ILP og CILP í PBS við 37 ◦C. Gögn eru sett fram sem meðaltal ± staðalfrávik (n=3). * p < 0.05, ** p < 0,01

2.4. Rannsókn á frumueiturhrifum

Til að rannsaka frumueiturhrif CILPs in vitro, var CCK{{0}} prófið gert á CT26.WT frumum. Eins og sýnt er á mynd 4, sýndu CILPs í lágum styrk (0,1–1 µg/ml) ekki frumueiturhrif, sem er í samræmi við öryggi ónæmismeðferðar. Frumulífvænleiki minnkaði örlítið eftir 5 µg/mL imiquimod meðferð, líklega vegna ROS og endoplasmic reticulum-miðluðum ónæmisvaldandi frumudauða af völdum imiquimods [36]. Þar að auki leiða CILP til marktækrar minnkunar á lífvænleika frumna samanborið við samanburðarhópa, sem er rakið til samverkandi áhrifa imiquimods og Fc-CV1.

Mynd 4. Lífvænleiki frumanna sem voru meðhöndlaðar með Fc-CV1, imiquimodi, CLPs, ILPs og CILPs í 24 klst. Styrkur Fc-CV1 og imiquimods var bæði 0–10 µg/ml. * p < 0.05, ** p < 0.01, ns=enginn marktækur munur

2.5. Rannsókn á lífdreifingu

Dreifing og uppsöfnun mismunandi lyfjaforma í æxlum og helstu líffærum hefur bein áhrif á lækningaáhrifin. Eftir gjöf í bláæð var fylgst með flúrljómunarmerkjunum með því að nota nær-innrauða vivisection kerfi til að meta dreifingu og uppsöfnun mismunandi lyfjaforma í æxlum og helstu líffærum eftir 24 klst. Eins og sést á mynd 5 var heildarflúrljómunarstyrkur ILPs-Cy5 og CILPs-Cy5 hærri en frís Cy5, sem gefur til kynna að lípósómin hafi langdrepandi eiginleika in vivo. Að auki var flúrljómunarstyrkur CILPs-Cy5 meðferðarhópsins hæstur í æxlisvef, sem má rekja til æxlismiðandi áhrifa Fc-CV1 bindla og eykur þar með æxlishemjandi áhrif. Það er sláandi að flúrljómunarstyrkur lifrar og milta var öflugri en annarra líffæra, sem er líklega vegna átfrumna fituefna af netþekjukerfi (RES) í lifur og nýrum [37].

Mynd 5. Dreifing Cy5-flúrljómunar í æxlum og helstu líffærum 24 klst. eftir gjöf í bláæð. Gögn eru sýnd sem meðaltal ± staðalfrávik (n=3). **** p < 0.0001

2.6. In Vivo æxlishemlunarrannsókn

Meðferðaráætlunin (Mynd 6A) og áhrif mismunandi efnablöndur eru sýnd á mynd 6. Í samanburði við PBS og LP hópana sýndu aðrir meðferðarhópar ákveðin æxlisbælandi áhrif. Sérstaklega var æxlisrúmmálið í lágmarki eftir meðferð með CILP, sem bendir til þess að CILPs hafi haft framúrskarandi æxlisbælandi áhrif (Mynd 6B).

Mynd 6. (A) Skýringarmynd af meðferð gegn ristilkrabbameini á CT26.WT æxlislíkani. (B) Vaxtarferlar æxlisrúmmáls á meðferðartímabilinu. (C) Hlutfallslegar æxlismyndir og (D) þyngd æxlis safnað frá mismunandi meðferðarhópum á degi 17. (E) Hlutfallslegt líkamsþyngdarhlutfall líkamsþyngdar samanborið við 0 dag. Gögnin eru sett fram sem meðaltal ± staðalfrávik (n=5). * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001.

Í lok tilraunarinnar var músunum fórnað og æxli þeirra skorið út, myndað og vigtað til að ákvarða meðferðaráhrif mismunandi efnablöndur. Eins og sýnt er á mynd 6C, D var meðferðarhópur CILP með minnstu og léttustu æxlin samanborið við aðra hópa, sem sýnir að CILPs höfðu mestu æxlisbælandi áhrifin. Tafla 2 sýnir að æxlisvaxtarhömlun CILPs var reiknuð vera 84,35%. Að auki var 84,35% æxlisbælingarhlutfall marktækt hærra en hjá CLPs og ILPs hópunum, og þetta þýðir að það eru samverkandi áhrif af lokun á "ekki borða mig" ásinn og virkjun ónæmissvörunar. . Í samanburði við jafngilda blöndu in vitro (2,5–5 µg/ml) var hærri hömlunin nátengd efnablöndunarvirkjaðri ónæmissvöruninni og hindraði ónæmisflóttann in vivo, sem var ekki fáanlegur in vitro.

Tafla 2. Gögnin um æxlisþyngd og æxlisvöxtshömlun (TGI) ýmissa meðferðarhópa.

2.7. CILPs Aukin T-frumuíferð og seyting IFN

Til að kanna ónæmisfrumuumhverfi æxlanna var ónæmisfruman framkölluð af CILPs greind ónæmisvefjaefnafræðilega í lok æxlisprófsins. CD4+ og CD8+ T-frumum fjölgaði í æxlishlutum CILPs hópanna (Mynd 7). Samhliða gjöf Fc-CV1 og imiquimod meðferðar leiddi til marktækrar CD4+ og CD8+ T-frumuíferðar. Að auki var marktæk IFN seyting í æxlunum sem fóru í CILPs meðferð, sem var vegna þess að CILPs kveiktu á Toll-like viðtaka 7 og virkjaðu ónæmissvörunina.

Mynd 7. Ónæmisvefjafræði æxlisvefja músa; jákvæðar frumur eru litaðar brúnar. Kvarðarstika, 50 µm (n=5).

2.8. Líföryggismat CILPs

Líföryggi CILPs miðlaðrar meðferðar var einnig mikilvægur mælikvarði hvað varðar aðgang að meðferðarmatinu. Meðan á æxlishömlunarrannsókninni stóð in vivo ollu CILPs ekki marktækt þyngdartap á meðferðartímabilinu (Mynd 6D). Lífefnafræðilegar breytur lifrar og nýrna voru allar á eðlilegu bili samkvæmt stöðluðu viðmiðunarsviði músa (tafla 3) og líffæravefjafræði sýndi engar marktækar breytingar, sem bendir til þess að CILPs hafi framúrskarandi líföryggi (mynd 8). Þessar niðurstöður skipta sköpum við mat á möguleikum CILPs sem öruggs og áhrifaríks ónæmislækninga við krabbameinsmeðferð.

Tafla 3. Lífefnafræðilegir þættir lifrar og nýrna

Mynd 8. H&E (hematoxylin og eosin) litun á helstu líffærum. Kvarðarslá, 50 µm (n=3)

3. Efni og aðferðir

3.1. Efni

Imiquimod var keypt frá MedChem Express (Shanghai, Kína). Fc-CV1 var veitt af lykilrannsóknarstofu ríkisins í mótefnalyfjum og markvissri meðferð. Kólesteról, hert lesitín (HSPC), DSPE-PEG2000, DSPE-PEG2000-NHS og DSPE-PEGCy5 voru keypt frá Xi'an Ruixi Biological Technology Co., Ltd. (Xi'an, Kína). 40,6-diamidino-2-fenýlindólið (DAPI) var fengið frá Keygen Biotech (Nanjing, Kína). Ammóníumsúlfat var fengið frá Sinopharm (Shanghai, Kína). Metanól (skiljunareinkunn) og asetónítríl (skiljunareinkunn) voru keypt frá Aladdin Reagent Company (Shanghai, Kína). Hin hvarfefnin eru öll af innlendri greiningargráðu. Mús ristilkrabbameinsfrumulína CT26. WT var veitt af Cell Bank of the Chinese Academy of Science. Frumurnar voru ræktaðar í frumuútungunarvél í RPMI 1640 miðli sem innihélt 10% FBS (Thermo Fisher Scientific, New York, NY, USA) við 5% CO2 og 95% loft. Kvenkyns BALB/c mýs 4-6 vikna voru útvegaðar af Pengyue Laboratory Animal Breeding Co., Ltd. (Jinan, Kína).

3.2. Undirbúningur tómra lípósóma

Fyrst voru 13,455 mg af HSPC, 4,3595 mg af DSPE-PEG2000 og 4,7095 mg af kólesteróli vegin nákvæmlega og leyst upp í 0,1 ml etanóli (HSPC: DSPE-PEG2000:kólesteról.5:12} 5,05:39,3 mólhlutfall). Í öðru lagi var etanóllausninni sprautað hratt í forhitaða ammóníumsúlfatlausn (250 mM, 1 mL, 65 ◦C) með sprautu og síðan ræktuð í 30 mínútur við 65 ◦C með segulhræringu. Í kjölfarið var tilbúna lausnin pressuð í röð í gegnum polycarbonate himnurnar (Avanti, Alabaster, AL, USA); stærðin var 200 nm, 100 nm og 50 nm, í sömu röð. Að lokum var lausnin sem fékkst núll lípósóm (LPs) með lípíðstyrk upp á 22,5 mg/ml.

3.3. Undirbúningur CD47 markvissra Imiquimod-encapsulated fitusóma

Fyrst var DSPE-PEG2000-NHS leyst upp í ddH2O (60 ◦C) og síðan blandað við Fc-CV1 og ræktað í hristingarborði við stofuhita í 5 klst (Fc-CV1:DSPEPEG2000- NHS=12:1 mólhlutfall). Efnahvarfsbúnaður tengingarinnar á milli Fc-CV1 og DSPE-PEG2000-NHS fól í sér að NHS esterinn hvarfast við aðalamínið á Fc-CV1 og myndaði samtengingu borðamíntengja. Tilbúnu lausninni var blandað í hlutfallslega við LPs og ræktað við 60 ◦C í 1 klst til að setja Fc-CV1 inn í lípósóm, sem var nefnt "eftir innsetningu" [38]. Hlutföll blöndunnar voru þau að 2,25 mg Fc-CV1 var breytt fyrir hverja 22,5 mg lípósóm. CD47 miðuð lípósóm (CLP) voru síðan fengin.

Í kjölfarið var CLP sett í skilunarpoka (300 kDa) og skilað gegn HEPES (10 mM, pH=7.4) í 1 klst. til að fjarlægja ammóníumsúlfat og leifar Fc-CV1 í ytri vatnsfasanum. Skilunuðu CLP-efnin voru ræktuð með imiquimod lausn (5 mg/ml) í hlutfallinu 1 mg á móti 7 µmól heildar fosfólípíða við stofuhita í 24 klst og síðan skilað gegn PBS (300 kDa) þrisvar sinnum til að útrýma óhyljaðri imiquimod, sem vísaði til ammóníumsúlfat hallatækni [39]. CILPs voru síðan fengin. Að auki voru 47-markmiðuð imiquimod-hjúpuð lípósóm (ILP) útbúin. Lítið var á CLP og ILP sem eftirlit með CILP.

3.4. Einkenni

Formgerð þessara fitukorna var mynduð með rafeindasmásjá (TEM, Joel, Tokyo, Japan). Stærð, zeta-möguleiki og fjölliðadreifingarstuðull (PDI) þessara lípósóma voru ákvörðuð með kraftmikilli ljósdreifingu (DLS) og rafdreifingu ljósdreifingar (ELS) með Zeta sizer ZSE frá Malvern (Malvern, Bretlandi). Bindingahraði (BR) Fc-CV1 setts inn í fitukorn var mældur með 15% natríum lauryl súlfat-pólýakrýlamíð gel rafdrætti (SDS-PAGE) og Image J hugbúnaði (Bethesda, MD, Bandaríkjunum). Hjúpunarvirkni (EE) imiquimods var greind með hágæða vökvaskiljun (HPLC, Thermo Fisher Scientific, New York, NY, Bandaríkjunum).

Kostir cistanche tubulosa-antitumor

3.5. In vitro frumuupptökurannsókn

In vitro frumuupptaka þessara lípósóma var ákvörðuð af uppsöfnuðum flúrljómunarstyrk Cy5 í CT26. WT frumur. DSPE-PEG-Cy5 var ræktað með CILPs og ILPs (DSPE-PEG-Cy5: CILPs eða ILPs=1:5 massahlutfall) við 60 ◦C í 1 klst., í sömu röð, og síðan flúrljómandi lípósóm nefndir sem CILPs-Cy5 og ILPs-Cy5 fengust. CT26.WT frumum var sáð í 96-brunnsplötur og þeim skipt af handahófi í þrjá hópa (1 × 104 frumur/brunn, n=3). Eftir að frumusamruninn náði 50–70% var hver hópur ræktaður með frjálsu Cy5, ILPs-Cy5 og CILPs-Cy5, í sömu röð, í 30 mínútur við 37 ◦C, þar sem lokastyrkur Cy5 var 1 µg/ml í 0,1 ml RPMI 1640 miðlungs. Í kjölfarið voru frumurnar óhreyfðar með 4% paraformaldehýði í 15 mínútur eftir að hafa verið þvegnar tvisvar með PBS og síðan litaðar með 10 µL DAPI (1 µg/µL) í 10 mínútur eftir að hafa verið þvegnar tvisvar með PBS. Að lokum var upptaka hvers frumuhóps skráð með High-Content Imaging System (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) eftir þvott tvisvar með PBS.

3.6. Imiquimod útgáfurannsóknin

Losunarferlar ýmissa lyfjahlaðinna lípósóma voru gerðar með skilunaraðferðinni (300 kDa), og niðurstöðurnar bornar saman við ókeypis imiquimod lausnina. Í stuttu máli var 0,6 ml ILP, CILP og imiquimod lausninni pakkað sérstaklega í skilunarpokana og síðan sett í 500 ml af PBS lausn (pH=7,4, 37 ◦C). Jafnt magn af sýnum var dregið úr pokunum með fyrirfram ákveðnu millibili (0, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 48, 72 og 96 klst.), og losunarhraði (RR) af imiquimod var reiknað með því að nota eftirfarandi jöfnu:

þar sem Sund og Sd táknuðu HPLC toppflatarmál imiquimodsins í forskilun og skilun á ýmsum tímum, í sömu röð (n=3).

3.7. Frumueiturhrif CILPs

CT{{0}}.WT frumur voru sáð í 96-brunnsplötu (1 × 104/brunn, n=3) og ræktaðar í 100 µL af RPMI 1640 miðli þar til samruni nær 70%. Til að ákvarða frumueiturhrif CILPs var RPMI 1640 miðillinn fjarlægður úr hverri brunn og skipt út fyrir flókna lausn af CILPs og RPMI 1640 miðli, með styrk Fc-CV1 og imiquimod á bilinu 0 til 10 µg/mL. Frumurnar voru ræktaðar með flókinni lausn í 24 klukkustundir. Að auki voru frumurnar sem voru meðhöndlaðar með Fc-CV1, CLPs, imiquimod lausn og ILPs í svipuðum styrk taldar sem samanburðarhópar. Eftirlifandi frumur fundust með CCK-8 greiningu eftir 24 klst. og lífvænleiki ómeðhöndlaðra frumna var talinn 100%.

3.8. Rannsókn á lífdreifingu

Níu kvenkyns BALB/c mýs voru sprautaðar undir húð með CT26. WT frumum (5 × 105) í hægri kantinum og þessum æxlisberandi músum var skipt af handahófi í þrjá hópa (n=3). Rúmmál æxlis var mælt með því að nota kvarða og var reiknað með eftirfarandi formúlu:

Þegar æxlisrúmmálið náði 100 mm3 var óbundnu Cy5, ILP-Cy5 og CILPs-Cy5 sprautað í bláæð með Cy5 skammtinum 0,4 mg/kg. Tuttugu og fjórum klukkustundum eftir inndælingu í bláæð voru æxli, hjarta, lifur, milta, lunga og nýra tekin út. Flúrljómunarmerki æxla og helstu líffæra greindust með IVIS sjónmyndakerfi (IVIS Lumina LT III, PerkinElmer, Waltham, MA, Bandaríkjunum).

3.9. In Vivo æxlishemlunarrannsókn

Þrjátíu og fimm kvenkyns BALB/c músum var skipt af handahófi í sjö hópa (n=5) og 5 × 105 CT26. WT frumum var sprautað undir húð í hægri hlið hverrar músar. Þegar æxlisstærð músa var um 100 mm3 var meðferð hafin. PBS, LPs, imiquimod, Fc-CV1, ILPs, CLPs og CILPs voru sprautaðir í bláæð á dögum 0, 4, 8 og 12. Skammturinn af imiquimod var 2,5 mg/kg í fyrstu og annarri inndælingu og 5 mg/kg í þriðju og fjórðu sprautunni. Í öllum inndælingum var skammturinn af Fc-CV1 5 mg/kg. Við þennan skammt var styrkur lyfsins í líkamanum 2,5–5 µg/mL, sem hafði frumueiturhrif á frumur í in vitro tilraun. Þvermál æxlis og líkamsþyngd voru mæld á hverjum degi meðan á meðferð stóð. Á 17. degi voru æxli músanna tekin út og þyngd þeirra mæld. Æxlisvaxtarhömlun (TGI) var reiknuð út samkvæmt eftirfarandi formúlu:

3.10. Ónæmisvefjafræði

Ónæmisvefjaefnalitun á CD4, CD8 og IFN var gerð í æxlisvef samkvæmt stöðluðum samskiptareglum. Eftir afparaffínhreinsun og endurvötnun á paraffínhluta æxlisvefja var 3% BSA bætt við hringinn til að hylja vefinn og hann var síðan lokaður í 30 mínútur við stofuhita. Hlutarnir voru litaðir með CD4, CD8 og IFN mótefnum (Servicebio, Wuhan, Kína) yfir nótt við 4 ◦C og síðan ræktaðir með öðru mótefni (HRP-merkt, Servicebio, Wuhan, Kína) við stofuhita í 50 mínútur eftir tvo þvotta með PBS. Í lokin voru sneiðarnar sýndar undir smásjá (Nikon, E100, Tókýó, Japan) eftir að hafa brugðist við DAB litningsefninu.

cistanche tubulosa-bæta ónæmiskerfið

3.11. Líföryggismat CILPs

Í lok æxlishömlunarrannsóknarinnar var öllum æxlum safnað saman og þyngd þessara æxla mæld. Lífefnafræðilegu breyturnar, þar á meðal alanín transamínasi (ALT), aspartat transamínasi (AST), kreatínín (CREA) og þvagefni (urea), greindust í blóði músa. Ferskur æxlisvefur og helstu líffæri voru fest með 4% paraformaldehýði og felld inn í paraffín með því að nota innfellingarvél (Wuhan Junjie Electronics, JB-P5, Wuhan, Kína). Vefjasneiðar með þykkt 5 µm voru skornar í gegnum míkrótómið (Leica Instrument, RM2016, Shanghai, Kína) og síðan litaðar með hematoxýlíni og eósíni (H&E) samkvæmt siðareglum. Í kjölfarið voru litunarsneiðarnar skoðaðar í smásjá (Nikon, E100, Tokyo, Japan).

3.12. Tölfræðigreining

Öll gögn eru gefin upp sem meðaltal ± SD. Mikilvægisstig milli hópa var prófað með einstefnu ANOVA með Graphpad Prism 8.0.2. p < 0.05 var skilgreint sem marktækur munur.

3.13. Dýrasiðfræði

Allar verklagsreglur og ráðleggingar varðandi dýr voru samþykktar af sérnefndinni um siðareglur vísindarannsókna Liaocheng háskólans í samræmi við innlendar leiðbeiningar um umönnun og notkun tilraunadýra (Samþykkiskóði: 2022111010; Samþykktardagur: 1. nóvember 2022).

cistanche plöntuaukning ónæmiskerfi

4. Niðurstöður

Í stuttu máli, imiquimod-hjúpuð CD47-miðuð lípósóm voru þróuð með góðum árangri og in vitro niðurstöðurnar sönnuðu að CILPs höfðu betri viðvarandi losun og sértæk miðunaráhrif. Niðurstöður in vivo sýndu að æxlisfrumurnar gætu verið teknar upp á áhrifaríkan hátt og að það sýndi framúrskarandi æxlismeðferðarvirkni og líföryggi vegna tvíþættrar virkni ónæmissvörunar og meðfæddrar ónæmiseftirlitsstöðvunar. Þess vegna virðast imiquimod-hjúpuð lípósóm tengd Fc-CV1 vera vænleg ný nanólyf til að bæta meðferð með CD47 tjáningu æxlis. Ónæmismeðferð byggð á meðfæddu ónæmi getur þjónað sem almenn aðferð gegn æxlisvexti fyrir samverkandi samsetningar með ICB í framtíðinni.

Heimildir

1. Sungið, H.; Ferlay, J.; Siegel, RL; Laversanne, M.; Soerjomataram, I.; Jemal, A.; Bray, F. Global Cancer Statistics 2020: Globocan mat á nýgengi og dánartíðni á heimsvísu fyrir 36 krabbamein í 185 löndum. CA Krabbamein J. Clin. 2021, 71, 209–249. [CrossRef] [PubMed]

2. Carlson, RD; Flickinger, JC, Jr.; Snook, AE Talkin' Toxins: From Coleys to Modern Cancer Immunotherapy. Eiturefni 2020, 12, 241. [CrossRef] [PubMed]

3. Barbari, C.; Fontaine, T.; Parajuli, P.; Lamichhane, N.; Jakubski, S.; Lamichhane, P.; Deshmukh, RR ónæmismeðferðir og samsetningaraðferðir fyrir ónæmiskrabbameinslækningar. Alþj. J. Mol. Sci. 2020, 21, 5009. [Krossvísun]

4. Hegde, PS; Chen, DS Top 10 áskoranir í krabbameinsónæmismeðferð. Ónæmi 2020, 52, 17–35. [Krossvísun]

5. Jain, KK Persónuleg ónæmissjúkdómafræði. Med. Prins. Æfðu þig. 2021, 30, 1–16. [Krossvísun]

6. Sanmamed, MF; Chen, L. Paradigm Shift in Cancer Immunotherapy: From Enhancement to Normalization. Cell 2018, 175, 313-326. [Krossvísun]

7. Hussein, WM; Liu, TY; Swarczynski, M.; Toth, I. Toll-Like Receptor agonists: A Patent Review (2011–2013). Sérfræðingur álit. Þr. Pat. 2014, 24, 453–470. [Krossvísun]

8. Chi, H.; Li, C.; Zhao, FS; Zhang, L.; Ng, TB; Jin, G.; Sha, O. Anti-æxlisvirkni toll-like viðtaka 7 örva. Framan. Pharmacol. 2017, 8, 304. [CrossRef] [PubMed]

9. Wang, Y.; Zhang, S.; Li, H.; Wang, H.; Zhang, T.; Hutchinson, MR; Yin, H.; Wang, X. Lítil sameindamótara tolllíkra viðtaka. Samkv. Chem. Res. 2020, 53, 1046–1055. [CrossRef] [PubMed]

10. Le Mercier, I.; Poujol, D.; Sanlaville, A.; Sisirak, V.; Gobert, M.; Durand, I.; Dubois, B.; Treilleux, I.; Marvel, J.; Vlach, J.; o.fl. Kynning á æxli með intratumoral Plasmacytoid dendritic frumum er snúið við með Tlr7 Ligand meðferð. Cancer Res. 2013, 73, 4629–4640. [Krossvísun]

11. Ma, F.; Zhang, J.; Zhang, J.; Zhang, C. Tlr7 örvar Imiquimod og Gardiquimod bæta DC-undirstaða ónæmismeðferð fyrir sortuæxli í músum. Cell. Mol. Immunol. 2010, 7, 381–388. [Krossvísun]

12. Billan, S.; Kaidar-Person, O.; Gil, Z. Meðferð eftir framfarir á tímum ónæmismeðferðar. Lancet Oncol. 2020, 21, e463–e476. [CrossRef] [PubMed]

13. Darvin, P.; Toor, SM; Sasidharan Nair, V.; Elkord, E. Immune Checkpoint Inhibitors: Nýlegar framfarir og hugsanleg lífmerki. Exp. Mol. Med. 2018, 50, 1–11. [CrossRef] [PubMed]

14. Li, B.; Chan, HL; Chen, P. Immune Checkpoint Inhibitors: Grunnatriði og áskoranir. Curr. Med. Chem. 2019, 26, 3009–3025. [CrossRef] [PubMed]

15. Jia, X.; Yan, B.; Tian, ​​X.; Liu, Q.; Jin, J.; Shi, J.; Hou, Y. Cd47/Sirpalpha Pathway miðlar krabbameinsónæmisflótta og ónæmismeðferð. Alþj. J. Biol. Sci. 2021, 17, 3281–3287. [Krossvísun]

16. Swoboda, DM; Sallman, DA Loforð um eftirlitsstöðvahemla í mergfrumusjúkdómum. Bestu starfsvenjur og rannsóknir. Clin. Hematól. 2020, 33, 101221.

17. Lentz, RW; Colton, læknir; Mitra, SS; Messersmith, WA Meðfæddir ónæmiseftirlitshemlar: Næsta bylting í krabbameinslækningum? Mol. Krabbamein Ther. 2021, 20, 961–974. [Krossvísun]

18. Jiang, P.; Lagenaur, CF; Narayanan, V. Integrin-tengt prótein er bindill fyrir P84 taugaviðloðun sameindarinnar. J. Biol. Chem. 1999, 274, 559–562. [Krossvísun]

19. Seiffert, M.; Cant, C.; Chen, Z.; Rappold, I.; Brugger, W.; Kanz, L.; Brown, EJ; Ullrich, A.; Buhring, HJ Human Signal-Regulatory Prótein er tjáð á venjulegu, en ekki á undirhópum hvítblæðis mergfruma og miðlar frumuviðloðun sem felur í sér mótviðtaka Cd47. Blóð 1999, 94, 3633–3643. [Krossvísun]

20. Matlung, HL; Szilagyi, K.; Barclay, NA; van den Berg, TK The Cd47-Sirpalpha merkiás sem meðfædd ónæmiseftirlit í krabbameini. Immunol. 2017, 276, 145–164. [CrossRef] [PubMed]

21. Oldenborg, PA; Zheleznyak, A.; Fang, YF; Lagenaur, CF; Gresham, HD; Lindberg, FP Hlutverk Cd47 sem merki sjálfs á rauðum blóðkornum. Vísindi 2000, 288, 2051–2054. [Krossvísun]

22. Li, Z.; Li, Y.; Gao, J.; Fu, Y.; Hua, P.; Jing, Y.; Cai, M.; Wang, H.; Tong, T. Hlutverk Cd47-Sirpalpha Immune Checkpoint í æxlisónæmissvikum og meðfæddri ónæmismeðferð. Lífvísindi. 2021, 273, 119150. [Krossvísun]

23. Hayat, SMG; Bianconi, V.; Pirro, M.; Jaafari, MR; Hatamipour, M.; Sahebkar, A. Cd47: Hlutverk í ónæmiskerfinu og notkun á krabbameinsmeðferð. Cell. Oncol. 2020, 43, 19–30. [Krossvísun]

24. Huang, Y.; Ma, Y.; Gao, P.; Yao, Z. Miðað við Cd47: Afrek og áhyggjur af núverandi rannsóknum á krabbameinsónæmismeðferð. J. Thorac. Dis. 2017, 9, E168–E174. [Krossvísun]

25. Zhang, W.; Huang, Q.; Xiao, W.; Zhao, Y.; Pi, J.; Xu, H.; Zhao, H.; Xu, J.; Evans, CE; Jin, H. Framfarir í æxlismeðferðum sem miða á Cd47/Sirpalpha-ásinn. Framan. Immunol. 2020, 11, 18. [CrossRef] [PubMed]

26. Liu, X.; Pu, Y.; Cron, K.; Deng, L.; Kline, J.; Frazier, WA; Xu, H.; Peng, H.; Fu, YX; Xu, MM Cd47 blokkun kallar á T-frumumiðlaða eyðingu ónæmisvaldandi æxla. Nat. Med. 2015, 21, 1209–1215. [CrossRef] [PubMed]

27. Weiskopf, K.; Hringur, AM; Ho, CC; Volkmer, JP; Levin, AM; Volkmer, AK; Ozkan, E.; Fernhoff, NB; van de Rijn, M.; Weissman, IL; o.fl. Hannað Sirpalpha afbrigði sem ónæmismeðferðarefni gegn krabbameinsmótefnum. Vísindi 2013, 341, 88–91. [Krossvísun]

28. Xiong, Z.; Ohlfest, JR Staðbundið Imiquimod hefur meðferðar- og ónæmisbælandi áhrif gegn innankúpuæxlum. J. Immunother. 2011, 34, 264–269. [Krossvísun]

29. Kamath, P.; Darwin, E.; Arora, H.; Nouri, K. Yfirlit um Imiquimod meðferð og umræður um bestu meðferð á grunnfrumukrabbameini. Clin. Fíkniefnarannsókn. 2018, 38, 883–899. [Krossvísun]

30. Liu, Y.; Castro Bravo, KM; Liu, J. Markviss afhending fituefna: Nanóvísindi og lífeðlisfræðilegt sjónarhorn. Horiz á nanóskala. 2021, 6, 78–94. [CrossRef] [PubMed]

31. Farjadian, F.; Ghasemi, A.; Gohari, O.; Roointan, A.; Karimi, M.; Hamblin, MR Nanólyf og nanólyf sem eru á markaðnum: áskoranir og tækifæri. Nanomedicine 2019, 14, 93–126. [Krossvísun]

32. Zhou, X.; Jiao, L.; Qian, Y.; Dong, Q.; Sun, Y.; Zheng, W.; Zhao, W.; Zhai, W.; Qiu, L.; Wu, Y.; o.fl. Að staðsetja Azelnidipin sem tvíþættan hemil sem miðar að Cd47/Sirpalpha og Tigit/Pvr leiðum fyrir krabbameinsónæmismeðferð. Lífsameindir 2021, 11, 706. [CrossRef]

33. Ni, K.; Luo, T.; Culbert, A.; Kaufmann, M.; Jiang, X.; Lin, W. Nanoscale Metal-Organic Framework skilar samhliða Tlr-7 örva og and-Cd47 mótefnum til að móta átfrumur og skipuleggja krabbameinsónæmismeðferð. Sulta. Chem. Soc. 2020, 142, 12579–12584. [Krossvísun]

34. Chen, Q.; Xu, L.; Liang, C.; Wang, C.; Peng, R.; Liu, Z. Ljóshitameðferð með ónæmisbælandi nanóögnum ásamt eftirlitsstöðvum fyrir árangursríka krabbameinsónæmismeðferð. Nat. Commun. 2016, 7, 13193. [CrossRef] [PubMed]

35. Wei, J.; Long, Y.; Guo, R.; Liu, X.; Tang, X.; Rao, J.; Yin, S.; Zhang, Z.; Li, M.; He, Q. Multifunctional Polymeric Micelle-Based Chemo-Ónæmismeðferð með ónæmiseftirlitsstöðvun til skilvirkrar meðferðar á brjóstakrabbameini með beinstillingu og meinvörpum. Acta Pharm. Synd. B 2019, 9, 819–831. [Krossvísun]

36. Huang, SV; Wang, ST; Chang, SH; Chuang, KC; Wang, HY; Kao, JK; Liang, SM; Wu, CY; Kao, SH; Chen, YJ; o.fl. Imiquimod hefur æxlishemjandi áhrif með því að örva ónæmisvaldandi frumudauða og er aukið með sykursýkishemlinum 2-deoxýglúkósa. J. Rannsókn. Dermatol. 2020, 140, 1771–1783.e6. [CrossRef] [PubMed]

37. Wang, B.; Hann, X.; Zhang, Z.; Zhao, Y.; Feng, W. Umbrot nanóefna in Vivo: Blóðrás og líffæraúthreinsun. Samkv. Chem. Res. 2013, 46, 761–769. [Krossvísun]

38. Akhtari, J.; Rezayat, SM; Teymouri, M.; Alavizadeh, SH; Gheybi, F.; Badiee, A.; Jaafari, MR miðun, líffræðileg dreifing og æxlisvöxtur sem hindrar einkenni Anti-Her2 affibody tengingar við liposomal doxorubicin með því að nota Balb/C mýs sem bera pípuæxli. Alþj. J. Pharm. 2016, 505, 89–95. [Krossvísun]

39. Woodle, MC; Papahadjopoulos, D. Undirbúningur fitukorna og stærðareinkenni. Aðferðir Ensím. 1989, 171, 193–217. [PubMed]