LIMIT er ónæmisvaldandi LncRNA í krabbameinsónæmi og ónæmismeðferð

Ágrip

MHC-I kynnir æxlismótefnavaka fyrir CD8+ T-frumum og kveikir á ónæmi gegn æxli. Menn geta haft 30,000-60,000 löng ókóðunuð RNA (lncRNA). Hins vegar er enn illa skilið hvort lncRNA getur haft áhrif á æxlisónæmi. Hér auðkennum við LncRNA, sem getur framkallað MHC-I og ónæmingargetu æxlis (LIMIT) í mönnum og músum. Við fundum að IFN örvaði LIMIT, LIMIT cis-virkjað gúanýlatbindandi prótein (GBP) genaklasa og GBP trufla tengslin milli HSP90 og hitalostþáttar-1 (HSF1) - sem leiddi til HSF1 virkjunar og umritunar MHC-I vélar, en ekki PD-L1. RNA-stýrð CRISPR virkjun á LIMIT eflt GBPs og MHC-I, og eflt ónæmisvaldandi æxli og eftirlitsmeðferð.

Silencing LIMIT, GBPs og/eða HSF1 dró úr MHC-I, skert ónæmi gegn æxlum og sljóvgaði virkni ónæmismeðferðar. Klínískt voru LIMIT, GBPs- og HSF1-merkjaafrit og prótein í fylgni við MHC-I, T-frumur sem síast inn í æxli og viðbrögð við stöðvunarstöðvun hjá krabbameinssjúklingum. Á heildina litið sýnum við að LIMIT sé áður óþekkt krabbameinsónæmisvaldandi lncRNA og LIMIT-GBP-HSF1 ásinn gæti verið marktækur fyrir krabbameinsónæmismeðferð.

Leitarorð 

Langt RNA án kóða; LIMIT; MHC-I; IFN ; BRESKT PUND; HSF1; HSP90; PD-L1; PD-1; T frumu ónæmi; krabbameins ónæmismeðferð

Kynning

Blokkun eftirlitsstaða leysir úr læðingi CD8+ T-frumumiðlað ónæmisvald gegn krabbameini1. Major histocompatibility complex-I (MHC-I) gegnir lykilhlutverki í CD8+ T frumu frumun og virkjun2. Hins vegar er MHC-I oft minnkað í krabbameinsfrumum, sem leiðir til undanskots frá æxlisónæmi og ónæmismeðferðarþoli3,4. Það er mikilvægt að skilja hvernig á að endurheimta æxlis-MHC-I tjáningu og endurvekja ónæmissvörun gegn æxli5. LncRNA eru að koma fram hratt ásamt framförum í djúpri RNA raðgreiningu, sem nær yfir miklu fleiri staði í erfðamengi mannsins en gen sem kóða prótein6. LncRNA stjórna próteinkóða genum á mörgum stigum7-9 og gegna lykilhlutverki í erfðafræðilegri innprentun10, frumuaðgreiningu11 og framvindu krabbameins12. Hins vegar er deili, verkunarmáti, virkni og klínískt mikilvægi sérstakra lncRNAs í krabbameinsónæmi og ónæmismeðferð óþekkt. Hér auðkennum við LIMIT sem áður óþekkt, krabbameinsónæmisvaldandi lncRNA. LIMIT hefur áhrif á MHC-I vélar og ónæmi gegn æxlum. Við höfum komist að því að LIMIT miðar staðbundið á GBP og myndar þannig sameindafall af LIMIT-GBP-HSF1-MHC til að breyta æxlisónæmi og verkun æxlisónæmismeðferðar. Vinna okkar sýnir ekki aðeins áður óþekkta líffræði ónæmisvaldandi lncRNA, LIMIT, heldur bendir einnig til þess að LIMIT-GBP-HSF1 ásinn gæti verið marktækur fyrir krabbameinsónæmismeðferð.

LIMIT er ónæmisvaldandi lncRNA

cistanche tubulosa-bæta ónæmiskerfið

Til að kanna óþekkt eftirlitsgen í æxlisónæmi, byggt á íferð CD8+ T-frumuæxlis, skiptum við sortuæxlum (TCGA, SKCM) í mönnum í heitar og kaldar æxlisgerðir og greindum ónæmisvaldandi genafylgni. Til viðbótar við CD8A, IFN og MHC-I (HLA-ABC) afrit, komumst við að því að lncRNA frambjóðandi var auðgað í heitu æxlinu, meðal 3926 lncRNA umsækjenda sem eru merktir með GENCODE13 (mynd 1a; viðbótartafla 1). Byggt á virknirannsóknum í eftirfarandi tilraunum, tilnefndum við þennan lncRNA frambjóðanda sem LIMIT: lncRNA Inducing MHC-I og Immunogenicity of Tumor (LIMIT). Í gagnagrunni sortuæxla í mönnum var magn LIMIT jákvæða fylgni við IFN, MHC-I og CD8 (mynd 1b-d). Í samræmi við þetta sýndi Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) að LIMIT tjáning tengdist IFN viðbragðsgenum, mótefnavakakynningu með MHC-I og ónæmisvirkjun (Mynd 1e-h). Þar að auki var magn LIMIT fylgni við aukið viðmiðunarhlutfall ónæmismeðferðarsvörunar 14-17 (Mynd 1i) og tengdist lifun hjá sjúklingum með sortuæxli (Mynd 1j). Að auki hafði tjáning LIMIT fylgni við IFN , MHC-I og CD8 yfir margar krabbameinsgerðir (Útvíkkuð gögn mynd 1a-l). Þannig er LIMIT hugsanlegt ónæmisvaldandi lncRNA.

Við staðfestum hvort LIMIT er lncRNA. Northern blotting sýndi að LIMIT var um það bil 2 kb að lengd í manna A375 sortuæxlisfrumum (mynd 1k). Við beittum hraðri mögnun á cDNA endum (RACE) og einkenndum cDNA endana á LIMIT í bæði manna (A375) og músum (B16) sortuæxlisfrumum (mynd 1l, m). Næst klónuðum við LIMIT í fullri lengd bæði í mönnum og músum og stilltum það saman við samsvarandi erfðamengisraðir (Unbreidd gögn mynd 2a, b). Human LIMIT var staðsett í litningi 1, með 1967 núkleótíðum og 6 exónum (útvíkkuð gögn mynd 2a), en músamörkin voru staðsett í litningi 3, með 1634 núkleótíðum og 7 exónum (útvíkkuð gögn mynd 2b). LIMIT innihélt ekki gilda Kozak röð. Þegar við útbjuggum RNA úr kjarna- og umfrymishlutum A375 frumna, greindist LIMIT aðallega í kjarnahlutanum (mynd 1n). Þannig hefur LIMIT enga möguleika á próteinkóðun. Samanlagt uppfyllir LIMIT öll skilyrði til að vera skilgreind sem lncRNA. Sérstaklega, í LIMIT staðlinum, lncRNA frambjóðanda, fannst gerviefni GBP1 (GBP1P1) í lifrarfrumukrabbameini (HCC)18. Hins vegar sýndi LIMIT lítið líkt með GBP1P1 eða GBP1 (útvíkkuð gögn mynd. 2c, viðbótartafla 2). Þannig er LIMIT ekki GBP1P1. Mikil fylgni á milli LIMIT og IFN móttækilegra genaundirskriftar (mynd 1e) bendir til þess að IFN geti örvað LIMIT tjáningu. Reyndar, meðferð með IFN framkallaði tjáningu á LIMIT, eins og sýnt er með Northern blotting (mynd 1k) og RNA-seq í A375, HT29, Meijuso og A549 frumum (Mynd 1o). Hins vegar tókst ekki að framkalla LIMIT tjáningu, meðhöndlun með öðrum frumuefnum, eins og IFN og TNF (mynd 1k). Þar að auki tókst IFN ekki að framkalla LIMIT í STAT1 knockout (KO) A375 frumum (mynd 1p). Þess vegna er LIMIT áður óþekkt IFN - móttækilegt lncRNA í bæði manna- og músafrumum.

LIMIT eykur MHC-I tjáningu

Kostir cistanche viðbót - hvernig á að styrkja ónæmiskerfið

Smelltu hér til að skoða Cistanche Enhance Immunity vörur

【Biðja um meira】 Netfang:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Til að rannsaka virkni LIMIT í æxlisfrumum, slógum við fyrst niður LIMIT með litlum hárnála-RNA (shLIMIT). Við notuðum Blast tólið til að velja LIMIT shRNA sem hafa enga frambjóðendur utan markmiðs (viðbótartöflur 3-6). ShLIMIT miðaði ekki við GBP kóða gen (Extended Data Fig. 3a). Í A375 frumum bældi shLIMIT LIMIT tjáningu (Mynd 2a), en hafði ekki áhrif á fosfórun STAT1 (Mynd 2b) sem svar við IFN - sem bendir til þess að LIMIT hafi ekki haft áhrif á alþjóðlegt IFN gen merki. MHC-I og PD-L1 eru IFN markgen19-21. ShLIMIT leiddi til lækkunar á tjáningu MHC-I (Mynd 2c), en ekki PD-L1 (Extended Data Fig. 3b), sem svar við IFN örvun. Í samræmi við þessi gögn úr mönnum leiddi þagnarmörkin í sortuæxlafrumu músa YUMM1.7 eða ristilkrabbameinsfrumu CT26 í minni MHC-I tjáningu sem svar við IFN (mynd 2d-g). Í A375 frumum hafði shLIMIT ekki aðeins áhrif á MHC-I tjáningu (HLA-ABC, HLA-E og HLA-F) heldur einnig MHC-II tjáningu (HLA-DRA og HLA-DMA); en LIMIT breytti ekki annarri IFN merkjagenatjáningu (Extended Data Fig. 3c). Þannig tekur LIMIT þátt í stjórnun á IFN-framkölluðum MHC-I og MHC-II tjáningu án þess að breyta alþjóðlegu IFN-boðaferli.

LIMIT er trufluð gen með stórum innstungum, sem tekur um 17 kb í erfðamenginu. Okkur tókst ekki að slá út LIMIT locusið með pöruðum sgRNA og Cas9. Í ljósi þess að það eru 5 spáð STAT1/IRF1 bindisæti í LIMIT verkefnisstjóranum, hönnuðum við 4 pöruð sgRNAs til að eyða þessum bindistaði í LIMIT verkefnisstjóranum (Extended Data Fig. 3d). Við mynduðum A375 frumur með LIMIT verkefniseyðingu í öllum 4 samsetningum sgRNA. Við komumst að því að IFN var ekki lengur duglegt til að framkalla tjáningu LIMIT og MHC-I í æxlisfrumum með LIMIT verkefniseyðingu samanborið við villigerðarfrumur (mynd 2h, i). Við notuðum að auki RNA-stýrt CRISPR virkjunarkerfi til að virkja Limit tjáningu í æxlisfrumum22. Við komum á fót 4 leiðar-RNA sem miða á frumkvöðlasvæðið Limit (sgLimit), og tjáðu samhliða dCas9-VPR, þríhliða umritunarvirkja sem sameinað er núkleasa-null Cas9, inn í B16 frumur (útvíkkuð gögn mynd 4a). Öll 4 sgLimit jók tjáningu Limit, sem og MHC-I (Extended Data Fig. 4b, c). Þegar við transfected B16 frumur með sameinuðu sgLimit og non-targeting sgRNAs (sgNT), sgLimit framkallaði tjáningu Limit og MHC-I, en ekki PD-L1 (mynd 2j, k). Þess vegna miðar Limit sértækt á MHC-I, en ekki PD-L1. Á heildina litið sýna tap- og virknitilraunirnar að LIMIT getur breytt 1.5-3 falt MHC-I tjáningu í mörgum krabbameinsfrumum í músum og mönnum. Við könnuðum næst hvort LIMIT-breytt MHC-I tjáning hefur áhrif á TAA-sértæk CD8+ T-frumumiðlað æxlisdráp in vitro. Í þessu skyni slógum við fyrst erfðafræðilega niður B2M með sérstökum shRNAs í ovalbumin (OVA)--sem tjáir B16 frumur. shRNA-B2M leiddi til 1.5-faldrar minnkunar á OVA-H2Kb tjáningu (útvíkkuð gögn mynd 4d). Þegar B16-OVA frumur sem bera shFluc og shB2M voru ræktaðar með OT-I frumum, sáum við minnkun á OT-I miðluðu shB2M-B16-OVA frumudrápi samanborið við shFluc-B{{63 }}OVA frumur (Extended Data Fig. 4e-g). Gögnin benda til þess að 1.5-3-faldar breytingar á MHC-I tjáningu sem stjórnað er af LIMIT gætu haft virkni í virkni til að hafa áhrif á TAA-sértæka CTL starfsemi. Til að sannreyna þetta virkjum við LIMIT í B16-OVA frumum sem tjá skellak og shB2M. Eins og búist var við, olli CRISPR virkjun LIMIT lágmarks MHC-I tjáningu í shB2M frumum, samanborið við viðmiðunarfrumur (mynd 2l). Samkvæmt því miðluðu OT-I frumur lágmarks æxlisdráp í shB2M-OVA-B16 frumum samanborið við samanburðarfrumur (mynd 2m, n). Gögnin benda til þess að LIMIT-framkölluð MHC-I tjáning sé mikilvæg í TAA-sértækri T-frumuvirkjun og virkni. Antigen-presenting frumur (APC), þar á meðal átfrumur og dendritic frumur (DCs), tjá MHC-I, gefa mótefnavaka fyrir og virkja TAA-sértækar T frumur. Við útvíkkuðum rannsóknir okkar frá æxlisfrumum í APC. IFN örvaði kröftuglega takmarka tjáningu í beinmerg-afleiddum DCs og átfrumum (Extended Data Fig. 4h, i). Við fluttum átfrumur með 5'FAM-merktum siRNA miðunarmörkum (siLIMIT). Að slá niður LIMIT leiddi til lægri MHC-I tjáningar sem svar við IFN örvun, samanborið við viðmiðun (Unbreidd gögn mynd 4j, k). Þannig er LIMIT IFN móttækilegt lncRNA og getur stuðlað að tjáningu MHC-I bæði í æxlisfrumum og APC.

LIMIT eykur ónæmi gegn æxlum

Kostir cistanche tubulosa-antitumor

Ófullnægjandi MHC-I tjáning veitir undanskot frá æxlisónæmi og ónæmismeðferð viðnám3. Til að skilja hlutverk Limit í ónæmissvörun gegn æxli in vivo, sátum við stjórn (shFluc) og Limit-silencing (shLimit) YUMM1.7 æxlisfrumur í NOD scid c-skort (NSG, ónæmisbrest) og villigerð C57BL/6 (ónæmishæfar) mýs. Samanborið við viðmiðunaræxli, stækkuðu shLimit YUMM1.7 æxli sambærilegt í NSG músum (mynd 3a), en þróast hraðar í villigerð músum (mynd 3b). Að auki sátum við shLimit CT26 æxli í villigerð BALB/c músa. Aftur leiddi þagnarmörkin til aukins CT26 æxlisvaxtar í ónæmishæfu líkaninu (mynd 3c). Gögnin benda til þess að þagnarmörkin geti skert ónæmi gegn æxli og auðveldað æxlisvöxt á ónæmisháðan hátt. Þessu til stuðnings fundum við minnkun á CD3+, IFN+ og TNF+ T frumum í shLimit YUMM1.7 æxlunum (mynd 3d, e). Saman skerðir silencing Limit ónæmi gegn æxlum. Til að ákvarða tjáningu MHC-I og MHC-I: SIINFEKL in vivo, stofnuðum við YUMM1.7 frumur sem tjá OVA (YUMM1.7-OVA) stöðugt og umbreyttu með shRNA-markmiði eða Fluc. Eftir IFN meðferð fundum við minnkaða yfirborðs tjáningu OVA-H2Kb í shLimit-YUMM1.7 frumum (Unbreidd gögn mynd 5a). Við sáðum shLimit YUMM1.7-OVA frumur og shFluc-YUMM1.7-OVA frumur í C57BL/6 mýs. Síðan krufðum við æxlisvef og fundum tjáningu H2Db og OVA-H2Kb í æxlisfrumum. Við sáum minnkun á H2Db og OVA-H2Kb í shLimit-YUMM1.7-OVA frumum samanborið við samanburðarfrumur (útvíkkuð gögn mynd 5b-f). Gögnin benda til þess að Limit geti haft áhrif á MHC-I og MHC-I: mótefnavaka tjáningu in vivo. Við sátum að auki stjórn (sgNT) og Limit-virkjandi (sgLimit) B16 frumur í villigerð C57/BL6 mýs. Eins og búist var við dró sgLimit (takmarkavirkjun) verulega úr æxlisvexti (mynd 3f). Þessu fylgdi aukinn fjöldi T-frumna sem síast æxli og virkjun (mynd 3g, h). B16 sortuæxli er tiltölulega ónæmt æxlislíkan fyrir PD-L1 blokkun23. Í samræmi við þetta tókst PD-L1 blokkun ekki að stjórna sgNT B16 æxlisvexti í músum. Athyglisvert er að takmarka virkjun í B16 æxli með sgLimit næmdu æxlissvörun við PD-L1 blokkun, eins og sýnt er með minni æxlisframvindu (mynd 3i). Á heildina litið eykur Limit æxlisónæmi og næmir æxlisónæmismeðferðarsvörun.

LIMIT cis-virkjar GBPs til að auka MHC-I og æxlisónæmi

Við skoðuðum næst hvernig LIMIT hefur áhrif á MHC-I og æxlisónæmi. LncRNA geta staðbundið stjórnað tjáningu nálægra gena24. LIMIT er staðsett náið við genaþyrping, gúanýlatbindandi prótein (GBPs), bæði í erfðamengi manna og músa (útvíkkuð gögn mynd 2a, b). Við spurðum hvort LIMIT gæti stjórnað tjáningu GBP. Þagnartakmörk minnkaði magn forvera og þroskaðra GBP mRNAs (mynd 4a) og GBP1-5 próteina (mynd 4b) í A375 frumum úr mönnum sem svar við IFN meðferð. Gögnin benda til þess að LIMIT kunni að stuðla að umritun GBPs í cis. Þessum möguleika til stuðnings minnkaði þagnartakmörk einnig Gbp2 tjáningu í YUMM1.7 og CT26 músfrumum (útvíkkuð gögn mynd 6a, b). Ennfremur, CRISPR virkjun Limit framkallaði tjáningu Gbp2 í B16 frumum (mynd 4c). Til að prófa hvort LIMIT gæti umstýrt GBPs, þvinguðum við tjáningu á LIMIT cDNA inn í A375 frumur. Við fundum að GBP1 og margir ónæmisþættir (þar á meðal IRF1, HLA-ABC og PD-L1) voru óbreyttir af LIMIT oftjáningu (Extended Data Fig. 6c). Þannig er LIMIT cis-virkt lncRNA sem getur framkallað GBP tjáningu. Meðal Gbp fjölskyldumeðlima er Gbp2 ríkjandi Gbp fjölskyldumeðlimur í músafrumum (útvíkkuð gögn mynd 6d). Til að prófa hvort LIMIT gæti stjórnað MHC-I í gegnum GBPs, stofnuðum við stöðugar YUMM1.7 frumur sem bera skellak, shLimit, shGbp2 eða shLimit plús shGbp2. Við komumst að því að sem svar við IFN örvun leiddu shLimit og shGbp2 til sambærilegrar lækkunar á Gbp2 og MHC-I tjáningu; Samtímis þagga niður Limit og Gbp2 tókst ekki að breyta tjáningu Gbp2 og MHC-I til viðbótar (mynd 4d, e). Þar að auki veltum við því fyrir okkur hvort oftjáning GBP gæti bjargað MHC-I downregulated-MHC-I tjáningu í Limit að slá niður æxlisfrumur. Við þvinguðum fram tjáningu GBP1 í shLIMIT A375 frumum (GBP1OE) og meðhöndluðum þessar frumur með IFN. Við sáum að shLIMIT leiddi til minnkaðrar MHC-I tjáningar í viðmiðunarfrumum, en ekki í GBP1OE frumum (Extended Data Fig. 6e). Tjáning PD-L1 og IRF1 var ekki fyrir áhrifum af shLIMIT eða GBP1OE (útvíkkuð gögn mynd. 6e, f). Þess vegna getur Limit stjórnað MHC-I tjáningu á GBP-háðan hátt. Næst sátum við YUMM1.7 frumur með Limit og/eða Gbp2-hleðslu í C57BL/6 mýs. Þöggunarmörk og þöggun GBPs leiddu á sama hátt til hraðari æxlisvaxtar samanborið við viðmiðunarhópinn, en samtímis þöggun LIMIT og GBPs hafði ekki frekari áhrif á æxlisframvindu (mynd 4f). Ennfremur fundum við minnkun á fjölda T-frumna sem síast inn í æxli og virkjun í shLimit æxlum, shGbp2 æxlum og shLimit plús shGbp2 æxlum (mynd 4g og útvíkkuð gögn mynd 6g). Saman eykur LIMIT tjáningu MHC-I og æxlisónæmi á GBP-háðan hátt. GBPs eru IFN-móttækileg gen í fibroblasts25 og macrophages26 í tengslum við vörn hýsils gegn sýkla. Hins vegar er hlutverk GBPs í ónæmi gegn krabbameini óþekkt. Í ljósi þess að þöggun GBPs minnkaði MHC-I tjáningu og CD8+ T frumuvirkjun (Mynd 4g og Extended Data Mynd 6g), gerðum við tilgátu um að GBPs gætu haft áhrif á virkni ónæmismeðferðar með krabbameini. Til að prófa þessa tilgátu þagguðum við niður Gbp2 í MC38 frumum, æxlislíkani sem er næmt fyrir ónæmismeðferð23. Eins og búist var við, dró úr þöggun á Gbp2 í MC38 frumum MHC-I tjáningu við IFN meðferð (mynd 4h), og ógilti að mestu virkni PD-L1 blokkunar (mynd 4i). Þetta, ásamt fyrrgreindum gögnum, benda til þátttöku LIMIT og GBPs í að stjórna virkni ónæmismeðferðar með krabbameini. Til stuðnings þessum möguleika leiddi klínísk gagnagreining í ljós að hátt magn GBP tjáningar tengdist LIMIT, MHC-I tjáningu og ónæmismeðferðarsvörun (útvíkkuð gögn mynd 6h-j) hjá sjúklingum með sortuæxli14-17. Ennfremur var styrkur GBP tjáningar jákvætt tengdur við lifun sjúklings (Unbreidd gögn mynd 6k). Til að sannreyna hvort GBPs séu IFN-móttækileg gen í krabbameinsfrumum örvuðum við A375 frumur með IFN og öðrum frumum. GBPs var framkallað af IFN, en hafði lítil áhrif á önnur ónæmissýtókín (mynd 4j). Næst notuðum við CRISPR-Cas9 kerfið til að miða á sameiginlegar raðir meðal GBP1-5 og mynduðum GBP1-5 útsláttar (KO) A375 frumur (Mynd 4k). Við sáum að IFN örvaði illa MHC-I genavélafrit (Mynd 4l) og yfirborð HLA-ABC prótein í GBP KO A375 frumum (Mynd 4m). Þess vegna virkjar LIMIT cis GBPs til að auka MHC-I vélar og æxlisónæmi.

GBPs virkja HSF1 til að örva MHC-I og æxlisónæmi

Til að sýna fram á hvernig GBPs geta stjórnað MHC-I tjáningu og æxlisónæmi, þvinguðum við tjáningu GBPs í A375 frumum. Athyglisvert er að oftjáning GBPs jók manna MHC-I tjáningu - eins og sýnt er með qRT-PCR (mynd 5a), himnuyfirborðslitun (mynd 5b) og Western blotting (mynd 5c). Gögnin benda til þess að GBP gæti virkjað MHC-I á umritunarstigi. Yfirtjáning á Gbp2 jók stöðugt tjáningu MHC-I músa í YUMM1.7 og B16 frumum (mynd 5d). Til að bera kennsl á umritunarþætti(a) sem stjórnar MHC-I í gegnum GBPs sem svar við IFN, gerðum við lífupplýsingaspá með PROMO27. Við fundum 8 umritunarþætti sem breyttust af IFN í A375 frumum, sem gætu beint HLA-ABC, HSPA5, CALR og TAP1. Fyrir utan nokkra vel þekkta þætti var HSF1 virkni mjög framkölluð af IFN (Extended Data Fig. 7a). Með því að vinna úr ChIP-seq gagnasöfnum í ENCODE28, komumst við að því að bæði STAT1 og HSF1 voru auðguð á forvöldum MHC-I tengdra gena með mismunandi bindismynstri (Extended Data Fig. 7b). Við framkvæmdum ChIP prófun með and-HSF1 mótefni í IFN-örvuðum A375 frumum. HSF1 var auðgað á forvöldum HLA-ABC, HSPA5, CALR og TAP1, en ekki HPRT1, neikvæðri viðmiðun (mynd 5e). Niðurstöðurnar benda til þess að HSF1 sé umritunarþáttur fyrir MHC-I. HSF1 er venjulega virkjað með því að trufla proteostasis29. Til að prófa hvort virkjun HSF1 muni auka MHC-I tjáningu, meðhöndluðum við A375 frumur með lista yfir streituvalda30: hitalost, oxunarálag (Luperox), þýðingarhemlar (púrómýsín), próteasóm (MG-132) og aðstoðarmaður (17-AAG). Athyglisvert er að þessir streituvaldar örvuðu MHC-I tjáningu almennt - en KRIBB11, HSF1 hemill, dró úr þessum áhrifum (mynd 5f og útvíkkuð gögn mynd 7c). Þannig veldur virkjun HSF1 almennt MHC-I tjáningu. Næst spurðum við hvort GBP gæti virkjað HSF1. Þvinguð tjáning GBPs framkallaði lúsiferasavirkni HSF1 fréttaritarans HSE-Luc (mynd 5g), auk fosfórunar á HSF1 (mynd 5h). Þetta bendir til þess að GBP gæti virkjað HSF1. IFN tókst ekki að örva HSPA5 tjáningu í GBP-KO A375 frumum (mynd 5i). Þannig virkjar IFN HSF1 með því að örva GBP tjáningu. Ennfremur, meðhöndlun með KRIBB11, HSF1 hemli, stöðvaði uppstýringu MHC-I sem miðlaði af GBP1 oftjáningu (mynd 5j). Þess vegna örva GBPs MHC-I tjáningu á HSF1-háðan hátt. Til að styrkja vélræna sambandið milli GBPs og HSF1, þögguðum við Gbp2 og/eða Hsf1 í MC38 frumum (mynd 5k). Við IFN meðferð, þöggun á Gbp2 eða Hsf1 einum og sér dró úr MHC-I tjáningu, en samtímis þöggun Gbp2 og Hsf1 tókst ekki að stilla MHC-I tjáningu til viðbótar (mynd 5l). Til að sýna fram á virkni samspils GBPs og HSF1 í æxlisónæmi, sátum við MC38 æxlisfrumur sem tjáðu skellak, shGbp2, shHSF1 eða shGbp2 plús shHSF1 í C57BL/6 mýs. Í samanburði við shFluc stýringar, þagga niður Gbp2 og þagga Hsf1 hraða æxlisvexti tiltölulega (mynd 5m), og minnkaði æxlisíferð T frumufjölda og virkjun (mynd 5n og útvíkkuð gögn mynd 7d). Þar að auki, samtímis þöggun Gbp2 og Hsf1 tókst ekki að hafa frekari áhrif á æxlisvöxt og æxlisíferð T-frumur (mynd 5m, n og útbreidd gögn mynd 7d). Alls örva GBPs tjáningu MHC-I og ónæmi gegn æxlum með því að virkja HSF1.

LIMIT-GBP-HSF1 ásinn knýr MHC-I og æxlisónæmi

cistanche ávinningur fyrir karla styrkir ónæmiskerfið

Við skoðuðum næst hvernig GBPs virkja HSF1 til að breyta MHC-I tjáningu og æxlisónæmi. Undir venjulegum kringumstæðum er einliða HSF1 tengt við og bælt af aðstoðarmönnum, svo sem HSP9031. Truflun á víxlverkun þeirra leyfir trimerization og uppsöfnun HSF1 í kjarnanum, sem leiðir til umritunarvirkjunar á markgenum þess32. Við gerðum þá tilgátu að GBPs gætu truflað tengslin milli HSP90 og HSF1, sem leiðir til virkjunar HSF1. Til að prófa þennan möguleika meðhöndluðum við A375 frumur með IFN og gerðum Co-IP með HSP90 mótefni. Við fundum IFN-framkallaða innræna GBPs tengdust HSP90 (mynd 6a). Að auki transfjótum við A375 frumur með utanaðkomandi Flag-GBP1 og framkvæmdum Co-IP tilraunina með Flag-mótefni. HSP90 greindist í IP vörunni frá Flag-GBP1 transfected frumum, en ekki vektor-transfected stjórn frumum (mynd 6b). Ónæmisflúrljómun litun sýndi fram á að GBPs og HSP90 voru að mestu leyti sambyggð í umfryminu (mynd 6c). Þegar við fluttum 293T frumur með vaxandi skömmtum af GBP1 plasmíðum, minnkaði HSP90-tengt HSF1 á skammtaháðan hátt (mynd 6d). Gögnin benda til þess að GBP hafi víxlverkun við HSP90 og þessi víxlverkun hafi truflað tengslin milli HSF1 og HSP90. HSP90 er aðstoðarmaður fyrir margfalda próteinbrjótingu og stöðugleika, við spurðum hvort GBPs gætu breytt chaperone virkni HSP90. Þrátt fyrir að HSP90 hemill bæli tjáningu HSP90 viðskiptavinapróteina (eins og RAF1, BCL2 og CDK433), tókst oftjáning GBPs ekki að gera það (mynd 6e). Þannig hafa GBP samskipti við HSP90 og losa HSP90-tengt HSF1, en breyta ekki HSP90 virkni. Síðan skoðuðum við beint hlutverk HSF1 í MHC-I tjáningu. Við meðhöndluðum A375 frumur með IFN í viðurvist HSF1 hemils KRIBB11. Eins og búist var við dró meðferð með KRIBB11 úr IFN-örvuðum mRNA tjáningu MHC-I tengdra gena, þar á meðal HLA-ABC, TAP1, HSPA5 og CALR, en ekki IRF1 (mynd 6f). Athyglisvert er að KRIBB11 minnkaði IFN-framkallaða MHC-I tjáningu, en hafði lágmarks áhrif á PD-L1 tjáningu (mynd 6g). Þannig getur HSF1 stjórnað IFN-framkölluðum MHC-I tjáningu án þess að breyta alþjóðlegu IFN merkinu. Til að kanna hvort HSF1-stýrður MHC-I væri virkur, ræktuðum við B16-OVA með OT-I frumum í viðurvist KRIBB11 og IFN. KRIBB11 hindraði IFN-framkallaða tjáningu á OVA-bundnu MHC-I (útvíkkuð gögn mynd 8a). Í samræmi við þetta, bældi KRIBB11 einnig OT-I frumumiðluð frumudrepandi áhrif á B16-OVA (útvíkkuð gögn mynd 8b). Til að auka athuganir okkar á fleiri æxli, þögguðum við Hsf1 með shHsf1 í YUMM1.7 og CT26 frumum. Þöggun Hsf1 leiddi til minnkunar á MHC-I tjáningu í YUMM1.7 (Mynd 6h, i) og CT26 frumum (Extended Data Fig. 8c) sem svar við IFN örvun. Í YUMM1.7 frumum tókst þöggun HSF1 ekki að hafa áhrif á tjáningu Gbp2 sem svar við IFN (mynd 6h), sem gefur til kynna að Gbp2 sé ekki HSF1 markgen. Í shHsf1 YUMM1.7 frumum tókst KRIBB11 ekki að bæla IFN-örvaða MHC-I tjáningu (Extended Data Fig. 8d). Gögnin benda til þess að HSF1 hafi aukið MHC-I tjáningu sem svar við IFN , og Hsf1 er vélrænt markmið KRIBB11 til að stjórna MHC-I. Í ljósi þess að HSF1 hafði áhrif á MHC-I tjáningu, gerðum við tilgátu um að HSF1 stjórnaði ónæmi gegn æxli in vivo. Til að prófa þessa tilgátu sátum við samanburðarfrumur og shHsf1 YUMM1.7 æxlisfrumur í NSG og C57BL/6 mýs. Við sáum að þöggun HSF1 hægði að hluta til á YUMM1.7 æxlisframvindu í NSG músum (mynd 6j), sem styður að Hsf1 hjálpaði til við að viðhalda próteinjafnvægi og æxlisframvindu í líkaninu með ónæmisbrest. Hins vegar, þöggun Hsf1 verulega hraða YUMM1.7 æxlisvöxt í villigerð C57BL / 6 músum (mynd 6k). Gögnin benda til þess að Hsf1 gæti á óvart stuðlað að öflugu ónæmi gegn æxli í ónæmishæfa líkaninu. Þessu til stuðnings fundum við lækkun á hlutfalli æxlisíferðar CD3+, Ki67+, IFN+ og TNF+ T frumna (mynd 6l og útvíkkuð gögn mynd 8e) í shHsf1 YUMM1.7 æxlin samanborið við shFluc spænuviðmið. Að auki sátum við shHsf1 CT26 frumur í villigerð BALB/c músa. Aftur leiddi þöggun Hsf1 til aukins CT26 æxlisvaxtar (útvíkkuð gögn mynd 8f). Þessu fylgdi lækkun á hlutfalli af æxlisíferð CD3+, Ki67+, IFN+ og TNF+ T frumum (útvíkkuð gögn mynd 8g, h). Alls benda gögnin til þess að GBP-HSF1 ásinn knýi MHC-I tjáningu og ónæmi gegn æxlum. Til að tengja Hsf1 og LIMIT vélrænt, þögguðum við LIMIT í A375 frumum. Þagnartakmörk minnkaði umritunarvirkni HSF1 sem svar við IFN, eins og ákvarðað var með luciferasa reporter assay (HSE-luc) (mynd 6m). Gögnin benda til þess að LIMIT stuðli að HSF1 virkjun sem svar við IFN. Til að prófa hugsanlega þátttöku HSF1 í LIMIT-miðlaðri örvun MHC-I, örvuðum við LIMIT með CRISPR virkjun í B16 frumum, í viðurvist KRIBB11. Við sáum að MHC-I uppstjórnun, framkölluð af LIMIT-virkjun, var aflétt af HSF1 hemli (mynd 6n). Gögnin benda til þess að LIMIT eykur MHC-I tjáningu á HSF1-háðan hátt. Að lokum greindum við tengsl milli LIMIT, GBPs og HSF1 í samhengi við MHC-I tjáningu, æxlisónæmi og ónæmismeðferð hjá sjúklingum með krabbamein. Klínísk greining sýndi að HSF1-merkjagen tengdust MHC-I tjáningu, CD8+ T-frumuíferð og lifun sjúklinga (útvíkkuð gögn mynd 9a-c). Í rannsókn á blokkun á ónæmiseftirliti hjá sjúklingum með grunnfrumukrabbamein34, sýndu einfrumu RNA-raðgreiningu 2 æxlisþyrpingar; einn æxlishópur var næmari fyrir and-PD-1 meðferð eins og sýnt er af að miklu leyti minnkaðri æxlisþýði (útvíkkuð gögn mynd 9d). Athyglisvert er að þessi ónæmiseftirlitsnæmi æxlisþyrping tjáði hærra magn HSF1-merkjagena sem og MHC-I genavélar (útvíkkuð gögn mynd 9e). Ennfremur, í rannsókn á blokkun á ónæmiseftirlitsstöðvum hjá sjúklingum með sortuæxli35, sýndi próteingreining að próteintjáning GBPs, HSF1 merkjagena og MHC-I var hærri hjá klínískum svöruðum en hjá þeim sem ekki svöruðu (útvíkkuð gögn mynd 9f). Að auki sáum við jákvæða fylgni milli GBP1 og HSF1-merkjagena í krabbameinum í mönnum (útvíkkuð gögn mynd 9g). Gögnin styðja að LIMIT-GBP-HSF1 ásinn geti virkjað MHC-I tjáningu og stuðlað að ónæmi gegn æxli (Unbreidd gögn mynd 10).

Umræða

Kínversk jurt cistanche planta - Antitumor

Menn hafa 30,000-60,000 lncRNA. Hins vegar eru auðkenni og líffræðileg virkni mikils meirihluta þessara hugsanlegu lncRNAs enn illa skilin. Á sviði krabbameinslíffræði hafa lncRNAs að mestu verið rannsökuð í líkaninu með ónæmisbrest, sem skilur eftir þekkingarbil á lncRNAs í samhengi við ónæmiskerfið. Greint er frá því að handfylli lncRNAs hafi áhrif á starfsemi ónæmisfrumna36,37, framvindu krabbameins og virkni krabbameinslyfjameðferðar38,39. Hins vegar er enn ósvarað hvort sértæk lncRNAs taka þátt í ónæmi gegn æxli og ónæmismeðferðarsvörun. Í þessari rannsókn höfum við greint að LIMIT er áður óeinkennt IFN-svarandi lncRNA í bæði manna- og músafrumum. LIMIT getur framkallað MHC-I og MHC-II tjáningu, stuðlað að T-frumumiðlaðri æxlisónæmissvörun og aukið virkni ónæmismeðferðar. Þannig er LIMIT áður óþekkt æxlisónæmisvaldandi lncRNA. IFN merkjaleið gegnir lykilhlutverki við að ákvarða meðferðarsvörun við krabbameinsónæmismeðferð40 með mörgum aðferðum19,20,41,42. Erfðafræðilegar stökkbreytingar í IFN merkjagenum stuðla að ónæmi fyrir eftirlitsstöðvum hjá sjúklingum með krabbamein43-48. Hins vegar geta IFN merkingar framkallað hamlandi PD-L1 tjáningu49. Þess vegna er tilvalið að bera kennsl á og miða á lykil IFN-merkjagen sem miðlar sértækt ónæmi gegn æxli, frekar en undanskot frá æxlisónæmi. Í samræmi við þessa hugmynd sýnum við fram á að LIMIT miðlar MHC-I og MHC-II uppstjórnun, en hefur ekki áhrif á PD-L1 tjáningu sem svar við IFN. Þannig getur LIMIT verið einstaklega í stakk búið til að vera ónæmisvaldandi markmið fyrir ónæmismeðferð með krabbameini. Nokkrar aðferðir hafa verið lagðar til til að miða á sjúkdómsvaldandi lncRNAs50. Hins vegar er enn krefjandi hvernig á að hækka magn gagnlegra lncRNAs. Þar sem cis-virkandi lncRNAs virka staðbundið getur þvinguð tjáning þessara lncRNAs verið ófær um að staðsetja nákvæmlega51. Þó að transvirkandi lncRNAs geti virkað í gegnum sérstakar aukabyggingar, getur oftjáning þessara lncRNAs ekki myndað náttúrulega uppbyggingu þeirra vegna þess að viðeigandi RNA-foringjar vantar52. Með því að nota RNA-stýrða CRISPR virkjunarstefnu22, virkjuðum við beint LIMIT tjáningu í æxlisfrumum í forklínískum gerðum. RNA-stýrð CRISPR LIMIT virkjun getur knúið æxlis-MHC-I tjáningu og aukið meðferð með eftirlitsstöðvum. Í ljósi þess að tap á MHC-I og IFN genamerkjum kemur oft fram í æxlum í mönnum, mælum við með að CRISPR virkjun gagnlegra lncRNAs, eins og LIMIT, geti bjargað æxlis-MHC-I tjáningu og verið möguleg meðferðaraðferð. Þegar við vorum að leita að því hvernig LIMIT hefur áhrif á ónæmi fyrir æxlum, komumst við að því að LIMIT miðar á GBP á cis hátt. GBPs gegna hlutverki í meðfæddu ónæmi26,53,54. Mýs sem skortir allan Gbps þyrpinguna sýna lélega and-Toxoplasma gondii svörun55. Hins vegar, fyrir vinnu okkar, voru vélræn tengsl milli LIMIT og GBPs og líffræðileg virkni GBPs í æxlisónæmi og ónæmismeðferð óákveðin. Við höfum uppgötvað að GBPs eru nauðsynlegar fyrir IFN-framkallaða æxlis MHC-I tjáningu, CD8+ T-frumudrepandi skilvirkni og árangursríka eftirlitsmeðferð. Gögnin benda til þess að GBPs séu hugsanleg markgen til að auka ónæmisvaldandi æxli. Við höfum óvænt uppgötvað að GBPs virkja HSF1 til að örva MHC-I og MHC-I tengda genatjáningu. HSF1 virkjun miðlað af HSP90 hemlum tengist æxlisstjórnun í ónæmishæfum líkönum. Hins vegar, þrátt fyrir margar klínískar rannsóknir með HSP90 hemlum, hefur enginn af metnum HSP90 hemlum verið samþykktur af FDA fyrir krabbameinsmeðferð, hingað til. Þessi svekkjandi staðreynd vekur upp möguleikann á því að HSP90 hemlar geti verið skaðleg æxlisónæmi. Eiturverkanir þessara HSP90 hemla geta stuðlað að eyðingu nokkurra HSP90 viðskiptavinapróteina, eins og RAF1 og BCL2, sem getur verið mikilvægt fyrir áhrifavirka T frumufjölgun og lifun59,60. Í ljósi þess að GBPs hafa samskipti við HSP90 og losa HSP90-tælt HSF1, en breyta ekki HSP90 virkni, benda gögn okkar til þess að miða á GBPs gæti verið áður ómetin og örugg aðferð til að virkja HSF1 fyrir krabbameinsónæmismeðferð. Í stuttu máli greinum við LIMIT sem áður óþekkt krabbameinsónæmisvaldandi lncRNA. Vinna okkar bendir til þess að miðun á LIMIT-GBP-HSF1 merkjaásinn geti bjargað tjáningu og virkni MHC-I, sem býður upp á efnilega krabbameinsónæmismeðferðaraðferð.

Aðferðir

Dýratilraunir

Sex til átta vikna kvenkyns NSG (NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl/SzJ, Stock# 005557), C57BL/6 (C57BL/6J, Stock# 000664), BALB/c (BALB /cJ, Stock# 000651), og OT-1 (C57BL/6-Tg(TcraTcrb)1100Mjb/J, Stock# 003831) mýs voru fengnar frá Jackson Laboratory. Öllum músum var haldið við aðstæður án sjúkdómsvalda. Dýraherbergið hefur stjórnað hitastig (18-23 gráður), rakastig (40-60%) og 12 ljós/12 dimm hringrás. YUMM1.7 (1 × 105), CT26 (1 × 105), MC38 (2.5 × 106), og B16 (1 × 105) frumur voru sprautaðar undir húð í hægri hlið músanna. Fyrir and-PD-L1 meðferð í MC38 líkaninu voru 5 mg/kg and-PD-L1 (InVivoMAb, 10F.9G2) og samanburðarmótefni (InVivoMAb, LTF-2) gefin í kviðarhol á dögum 6, 9, og 12 eftir æxlisbólusetningu. Fyrir and-PD-L1 meðferð í B16 líkaninu voru 5 mg/kg and-PD-L1 (InVivoMAb, 10F.9G2) og samanburðarmótefni (InVivoMAb, LTF-2) gefin í kviðarhol á degi 0, 3, 6, 9, 12 og 15 eftir æxlisbólusetningu. Þvermál æxlis var mæld með þvermáli. Rúmmál æxlis var reiknað með lengd × breidd × breidd/2. Dýrarannsóknir voru gerðar undir samþykki dýraverndar- og notkunarnefndar stofnana við háskólann í Michigan (PRO00008278). Rannsóknin er í samræmi við allar viðeigandi siðareglur varðandi dýrarannsóknir. Í engum tilraununum fór stærð xenograft æxlis yfir 2 cm í neinum stærðum og ekkert dýr var með alvarlega kviðþenslu (meira en eða jafnt og 10% upphaflegri líkamsþyngdaraukning). Úrtaksstærðin var valin á grundvelli bráðabirgðagagna. Eftir æxlisbólusetningu var músum slembiraðað og þeim skipt í mismunandi hópa til meðferðar.

Hvarfefni

KRIBB11 og 17-AAG voru keypt frá Cayman Chemical. MG-132, Puromycin og Luperox voru frá Sigma-Aldrich. Raðbrigða manna IFN (285-IF), IFN (8499-IF), TNF (210-TA), IL-1 (201-LB), IL{{ 9}} (206-IL) og mús IFN (485-MI) voru frá R&D.

Plasmíð

Til að mynda HSE-LUC voru DNA raðir sem samsvara hitaáfallsþáttum (HSE) smíðaðar, glóðar og bundnar inn í PGL3-basic (Promega) plasmíð. FLAG-HSF1 var gjöf frá Stuart Calderwood (Addgene #32537). Fyrir þvingaða tjáningu GBP1, GBP2, GBP5 og músa Gbp2 úr mönnum, voru viðkomandi kóðaraðir PCR magnaðar úr cDNA myndað úr IFN formeðhöndluðum A375 frumum eða B16 frumum og síðan settar inn í PCI-Flag plasmíð. PCI-Flag plasmíð var útbúið með því að setja eftirfarandi Kozak röð plús Flag tag plús 5 × Glycine röð í PCI-neo (Promega) plasmíðið á milli NheI og XhoI. Til að slá niður LIMIT manna og músa LIMIT voru shRNA hönnuð og sett í PLKO.1 plasmíð (Addgene #10879). shRNA sem miðar á eldflugulúsiferasa (shFluc) þjónaði sem neikvæð stjórn. Til að miða á verkefnissvæðið Limit fyrir CRISPR virkjun voru sgRNA (sgLimit) hönnuð og sett inn í phU6- sgRNA plasmíð (Addgene #53188). SgRNA (sgNT) sem ekki miðar á þjónaði sem neikvæð viðmiðun. Til að eyða STAT1/IRF1 bindistöðum í LIMIT verkefnisstjóranum voru pöruð sgRNA (psgLIMIT) hönnuð og sett inn í PX459 plasmíðið (Addgene #48139). Til að slá niður mús Hsf1 og Gbp2, voru shRNAs hönnuð og sett inn í PLKO.1 plasmíð (Addgene #10879). Til að slá út GBP1-5 var sgRNA hannað og sett inn í PX459 plasmíðið (Addgene #48139). Markraðirnar eru skráðar í viðbótartöflu 7. Grunnraðirnar eru skráðar í viðbótartöflu 8.

Frumumenning

Sortuæxlafrumulína A375 (CRL-1619), sortuæxlisfrumulínur úr músum, B16-F0 (CRL-6322) og YUMM1.7 (CRL-3362 ), ristilkrabbameinsfrumulína músa CT26 (CRL-2638) og 293T (CRL-3216) voru keyptar frá American Type Culture Collection (ATCC). Mús ristilkrabbameinsfrumulína MC38 var áður notuð á Zou rannsóknarstofunni23,48. B16- OVA frumur voru stofnaðar eins og áður hefur verið greint frá42. A375 STAT1 KO, A375 GBP1-5 KO og A375 LIMIT frumueyðingar frumulínur voru búnar til í þessari rannsókn. Allar frumulínur voru prófaðar fyrir mycoplasma-mengun reglulega og staðfestar neikvæðar fyrir mycoplasma. Frumur voru ræktaðar í RMPI miðli (Gibco #11875) bætt við 10% FBS, nema A375 og 293T frumur, síðarnefndu 2 línurnar voru ræktaðar í DMEM (Gibco #11965) bætt við 10% FBS. Öllum frumum var haldið við 37 gráður og 5% CO2. Fyrir hitalost voru frumur settar í hitakassa við 43 gráður og 5% CO2 í 2 klukkustundir. Til að búa til niðurbrotsfrumulínur voru lentiveiruagnir framleiddar með transfection á PLKO.1 shRNA plasmíði með psPAX2 (Addgene #12260) og pMD2.G (Addgene #12259) (4:3:1) í 293T frumur og síðan umbreytt í æxli frumur með polybrene (Sigma-Aldrich, 8 ug/ml) yfir nótt. 48 tímum eftir transfæðingu voru frumur valdar með púrómýsíni (1-2 ug/ml) í 2 vikur til viðbótar. Til að koma á útsláttarfrumulínum voru PX459- sgRNA plasmíð færð inn í æxlisfrumur í 2 daga og valin með púrómýsíni (1-2 ug/ml) í 2 daga til viðbótar. Frumurnar voru síðan raðþynntar og sáð í 96 brunna plötur. Eftir 2-3 vikur voru einfrumuþyrpingar sundraðar og endurhúðaðar í 6 brunna plötur. Við samruna frumna var helmingur frumanna safnað og staðfestur fyrir útsláttarvirkni (KO) með Western blotting. Til að beita CRISPR virkjunarkerfinu til að virkja músamörk, voru phU6-sgRNA transsectuð ásamt SP-dCas9-VPR (Addgene #63798) inn í B16 frumur. Allar transfections voru framkvæmdar með lipofectamine 2000 (Thermofisher) í hlutfallinu 1 ug plasmíð: 2 ul transfection regent. Skammturinn fyrir transfíknina var ákvarðaður með títrun.

Lúsiferasavirkniprófun

A375 frumur voru umbreyttar með HSE-LUC og PRL-SV40P (Addgene #27163) í 24 klukkustundir, ásamt PCI-neo (vektor) eða GBP1, GBP2 í 48 klukkustundir. A375 shFluc eða A375 shLIMIT frumur voru færðar með HSE-LUC og PRL-SV40P (Addgene #27163) í 24 klukkustundir og síðan meðhöndlaðar með IFN í 48 klukkustundir til viðbótar. Lúsiferasavirkni fyrir eldflugulúsiferasa (HSE-LUC) og renillulúsiferasa (PRL-SV40P) var mæld með Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega). Hlutfallsleg virkni eldflugulúsiferasa var eðlileg með renilla lúsiferasavirkni.

Yfirborðslitun og flæðifrumugreining (FACS)

Frumur voru trypsínaðar og skolaðar með MACS jafnalausn (PBS, 2%FBS, 1 mM EDTA). Yfirborðslitun var framkvæmd með því að bæta eftirfarandi mótefnum við frumusviflausnina í 50 ul MACS biðminni: and-HLA-ABC (G46-2.6, BD Biosciences), and-H2-Db (KH95, BD Biosciences), and-H2-Dd (34-2-12, BD Biosciences), and-OVA-H2-Kb (eBio25-D1.16, eBioscience) og and-PD-L1 (MIH1, BD Biosciences). Eftir ræktun í 30 mínútur voru frumur þvegnar með MACS jafnalausn og greindar á BD Fortessa flæðifrumumæli.

Magn PCR (qPCR) greining

Heildar-RNA var einangrað úr frumum með súluhreinsun (Direct-zol RNA Miniprep Kit, Zymo Research) með DNase meðferð. cDNA var búið til með því að nota RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific) með handahófskenndum hexamer grunnum. Megindleg PCR (qPCR) var framkvæmd á cDNA með því að nota Fast SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher Scientific) á StepOnePlus rauntíma PCR kerfi (Thermo Fisher Scientific). Genatjáning var magngreind með því að nota primerana sem taldir eru upp í viðbótartöflu 8. Foldar breytingar á mRNA tjáningu voru reiknaðar út með ΔΔCt aðferðinni með því að nota ACTB sem innræna stjórn. Niðurstöður eru gefnar upp sem faltbreytingar með því að staðla í stýringar.

Northern blotting

Northern blot greining var framkvæmd með 10 ug af heildar RNA sem búið var til úr IFN, IFN og TNF formeðhöndluðum A375 frumum. RNA voru leyst upp með afnáttúru agarósa gel rafdrætti (Ambion) og flutt yfir á Hybond-XL himnur (GE Healthcare). LIMIT greindist með því að nota digoxín merkta DNA rannsaka með DIG Northern Starter Kit (Roche). Rannsakaraðirnar sem miða á LIMIT eru skráðar í viðbótartöflu 7.

Hröð mögnun cDNA-enda (RACE)

RACE var framkvæmt til að bera kennsl á cDNA-enda manna LIMIT eða músa Limit með SMARTer RACE cDNA mögnunarsetti (Clontech). Grunnefnin fyrir RACE eru skráð í viðbótartöflu 8.

Klón af LIMIT í fullri lengd

Eftir að hafa fengið cDNA endaröðina var LIMIT í fullri lengd PCR magnað og sett inn í PCI-neo plasmíð á milli XhoI og NotI. Klóna primers fyrir manna LIMIT og músa Limit eru skráðir í viðbótartöflu 8.

Frumuhlutun fyrir RT-PCR

IFN formeðhöndluðum A375 frumum var safnað af 15 cm plötum með því að skafa og skolaðar einu sinni með köldu PBS. Frumur voru pelaðar með skilvindu við 700 g í 5 mínútur og leystar með lágþrýstingslausnarbuffi (10 mM Tris (pH 7,5), 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0,3% (rúmmál/rúmmál) NP{{ 12}}, 10% (rúmmál/rúmmál) glýseróls) til að safna umfrymishlutanum. Umfrymis-RNA var fengið með etanólútfellingu yfir nótt við -20 gráður, fylgt eftir með endurútdrætti með því að nota TRIZOL hvarfefni. Kjarnakúllan sem eftir var var þvegin þrisvar sinnum með lágþrýstingsleysisbuffi, fylgt eftir með útdrætti með TRIZOL hvarfefni samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. RNA einangruð úr kjarna- eða umfrymisbrotum voru öfug umrituð og RT-PCR fyrir LIMIT með tilgreindum frumurum. Ósplæst eða þroskað ACTB var notað sem viðmið fyrir kjarna- eða umfrymis-RNA. Grunnefnin fyrir ACTB eru skráð í viðbótartöflu 8.

Western blotting

Frumur voru þvegnar í köldu PBS og ljósaðar í 1 × RIPA lýsisbuffi (Pierce) með 1 × próteasahemli (Pierce). Lýsöt voru ræktuð á ís í 10 mínútur og hreinsuð með skilvindu við 15,000g í 15 mínútur. Próteinstyrkur var magnmældur með því að nota BCA próteingreiningarsett (Thermo Fisher). Þrjátíu míkrógrömmum próteini var blandað saman við sýnislausn (Thermo Fisher) með -ME og eðlissvipt við 95 gráður í 5 mínútur. Sýnið var aðskilið með SDS-PAGE og flutt í nítrósellulósahimnu (Bio-Rad). Himnur voru stíflaðar með 5% m/v fitulausri þurrmjólk og ræktaðar með frummótefnum yfir nótt við 4 gráður og HRP-samsett aukamótefni (CST) í 1 klukkustund við stofuhita. Merkið var greint með því að nota Clarity og Clarity Max Western ECL Blotting Substrates (Bio-Rad) og fangað með ChemiDoc myndgreiningarkerfinu (Bio-Rad). Mótefni voru sem hér segir: and-manna GBP1-5 (Santa Cruz, 166960, 1: 500), and-HSF1 (CST, 12972, 1: 1,000), and-Phospho HSF1 (Abcam , 76076, 1: 1000), andstæðingur-GBP1 (Proteintech, 15303, 1: 1,000), andstæðingur-Gbp2 (Proteintech, 11854, 1: 1,000) , andstæðingur-HSP90 (CST, 4877, 1: 1,000), andstæðingur-HSPA5 (CST, 3177, 1: 1,000), andstæðingur-STAT1 (CST, 9172, 1: 1 ,000), and-Phospho-STAT1 (CST, 9167, 1: 1000), and-RAF1 (CST, 9422, 1: 1000), and-BCL2 (CST, 2870, 1 : 1000), and-CDK4 (CST, 12790, 1: 1000) og and-GAPDH (Proteintech, 60004, 1: 5.000). Fyrir MHC-I Western blotting úr mönnum, voru heildarfrumulýsöt eðlislögð í sýnislausninni án -ME (ekki afoxandi) til að viðhalda tvísúlfíðbrúnum og sköpulag próteina sem á að greina með and-HLA-ABC mótefni (W6/32) , Novus Biologicals, 64775, 1: 1.000).

Co-immunoprecipitation (Co-IP)

Frumum var safnað með IP lysisbuffi (Pierce, 87787) auk próteasahemils. Próteinstyrkur var ákvarðaður með BCA próteingreiningarsetti. 200-500 ug próteinsýnum var bætt við 1-3 ug aðal mótefni and-HSP90 (Proteintech, 13171) eða and-HSF1 (CST, 12972), og ræktað með varlega rokkið við 4 gráður yfir nótt. Síðan voru sýni ræktuð frekar með 20 ul Protein A/G PLUS-Agarose (Santa Cruz, sc-2003) í 2 klukkustundir við 4 gráður; og skilið í skilvindu við 7500 × g í 30 sekúndur við 4 gráður. Frumukúlur voru þvegnar 4 sinnum með IP-lýsisjafnalausn, endursviflausnar með 40 ul 2x sýnisbuffa með -ME og hitaðar í 5 mínútur við 95 gráður. Afeitruðu próteinsýnin voru greind með Western blot. Fyrir Flag IP voru frumulýsöt ræktuð með 20 ul EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel (Sigma Aldrich) og þvegin, eðlisvötnuð og greind eins og lýst er hér að ofan.

Ónæmisflúrljómun litun

A375 frumur festar á hyljara voru meðhöndlaðar með IFN í 24 klukkustundir. Eftir þvott 2 sinnum með PBS voru frumur festar með 4% PFA í 15 mínútur og þvegnar 2 sinnum með PBS í 5 mínútur hver. Síðan voru frumurnar gegndræpnar með 0.5% triton x-100 í PBS í 10 mínútur og skolaðar 2 sinnum með PBS í 5 mínútur hver. Mótefnavakar voru lokaðir með 10% eðlilegu geitasermi í PBS í 30 mínútur. Síðan var aðalmótefnum bætt við í 1:50 þynningum af músa and-manna GBP1-5 mótefni (Santa Cruz, 166960) eða kanínu-and-manneskju HSP90 mótefni (CST, 4877), og ræktað við 4 gráður yfir nótt. Að því loknu voru frumurnar þvegnar og ræktaðar með 1:500 þynningum af Qdot 605 merktu aukageitamótefni gegn músum (Thermo Fisher, Q11002) eða AF488-merktu aukageitamótefni gegn kanínu (Thermo Fisher, A11034), og síðan sett á glerskyggnur með ProLong Gold hvarfefni sem inniheldur DAPI. Confocal flúrljómun myndum var safnað með því að nota 63X olíu-ídýfi hlutlægt (Leica SP5 Inverted 2-Photon FLIM confocal).

Chromatin immunoprecipitation (ChIP)

ChIPs voru gerðar með krosstengdu litningi frá IFN meðhöndluðum A375 frumum og annað hvort HSF1 mótefni (CST, 12972) eða Normal Rabbit IgG (CST, 2729), með því að nota Simple ChIP Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) (CST, 9005). Auðgað DNA var magnmælt með rauntíma PCR með því að nota primerana sem taldir eru upp í viðbótartöflu 8. Magn ónæmisútfellds DNA í hverju sýni var táknað sem merki miðað við heildarmagn inntaks litnings, sem jafngildir 1.

OT-I frumueinangrun og samræktun með OVA+ æxlisfrumum

C57BL/6-Tg(TcraTcrb)1100Mjb/J (OT-I) mýs (JAX lager #003831) voru keyptar frá Jackson Laboratory. Miltað var einsleitt og stakar frumur voru sviflausnar í 2 ml rauðum blóðkorna lýsisbuffi (Sigma-Aldrich) í 1 mínútu. Miltfrumurnar voru kögglaðar, þvegnar og endursviflausnar við 2 × 106 frumur á ml í RPMI ræktunaræti sem innihélt 1 ug/ml OVA257-264 peptíð, 5 ug/ml músarraðbrigða IL-2 og 40 μM { {15}} merkaptóetanól. Frumurnar voru ræktaðar við 37 gráður í 5 daga. Til að setja upp samræktun OT-I og OVA+ æxlisfrumna var miltisfrumum safnað eftir 5-dagsvirkjun. OT-I frumur voru hreinsaðar með EasySep mús CD8+ T Cell Isolation Kit (Stemcell). B16-OVA frumum var sáð yfir nótt. OT-I frumum var síðan bætt inn í ræktunina í mismunandi hlutföllum. Öllum frumum var safnað með trypsínvæðingu og greindar með frumuflæðismælingu (FACS).

Beinmergsafleiddar dendritic frumur (BMDC) og átfrumur (BMDM)

Beinmergur var einangraður úr C57BL/6 músarlærleggjum og ræktaður í RPMI1640 heilum miðli með 20 ng/ml GM-CSF (R & D). Frumur voru ræktaðar við 37 gráður og 5% CO2. 10 ml æti til viðbótar með 20 ng/ml GM-CSF var bætt við á 3. degi. Á degi 7 voru frumur sem ekki festu og lauslega festar í ræktunarfljótandi vökvanum safnað með varlega þvotti með PBS og taldar BMDC. Viðloðandi frumurnar voru taldar BMDM.

Intratumoral ónæmisfrumusnið

Til að mæla T-frumur í æxli og tjáningu frumuáhrifa frumu í T-frumu, voru einfrumu sviflausnir búnar til úr ferskum æxlisvef með því að fara líkamlega í gegnum 100 μm frumusíum. Ónæmisfrumur voru auðgaðar með miðflótta með þéttleikahalla. Fyrir cýtókínlitun voru ónæmisfrumur í æxli ræktaðar í RPMI ræktunaræti sem innihélt PMA (5 ng/ml), jónómýsín (500 ng/ml), brefeldín A (1: 1, 000) og Monessen (1: 1) ,000) við 37 gráður í 4 klukkustundir. 2-3 úl af Anti-CD45 (30-F11, BD Biosciences), and-CD90 (53-2.1, BD Biosciences), and-CD3 (145-2C11, BD Lífvísindum), and-CD4 (RM4-5, BD Biosciences), og and-CD8 (53-6.7, BD Biosciences) mótefnum var bætt við í 20 mínútur fyrir yfirborðslitun. Frumurnar voru síðan þvegnar og endurleysaðar í 1 ml af nýútbúinni Fix/Perm lausn (BD Biosciences) við 4 gráður yfir nótt. Eftir að hafa verið þvegið með Perm/Wash buffer (BD Biosciences) voru frumurnar litaðar með 2-3ul anti-Ki67 (B56, BD Biosciences), and-TNF (MP6-XT22, BD Biosciences), og and-IFN (XMG1.2, BD Biosciences) í 30 mínútur, þvegið og fest í 4% formaldehýði (Sigma Aldrich). Öll sýni voru lesin á LSR Fortessa frumumæli og greind með FACS DIVA hugbúnaði v. 8.0 (BD Biosciences).

Útreikningur undirskriftarstigs

Við notuðum eðlilega tjáningu gena til að skilgreina eftirfarandi einkenni: CD8+ T frumuíferð (CD8A, CD8B, PRF1 og GZMB), MHC-I tjáning (HLA-A, HLA-B og HLA-C) , og HSF1 merki (HSPA1A, HSPA1B, HSPA5 og HSP90B1).

tölfræðigreining

Fyrir frumutilraunir voru líffræðilegar þrítekningar framkvæmdar í hverri einustu tilraun almennt, nema annað sé tekið fram. Fyrir dýrarannsóknir voru ekki færri en 5 endurtekningar í hverjum hópi notaðar. Dýrum var slembiraðað í mismunandi hópa eftir æxlisfrumu sáningu. Rannsakendur voru ekki blindaðir á úthlutun meðan á tilraunum og niðurstöðumati stóð. Gögnin eru sýnd sem meðalgildi með staðlaðri afleiðslu. Tölfræðileg greining var gerð með GraphPad Prism8 hugbúnaði (GraphPad Software, Inc.). Tvíhliða 2-hliða t-próf ​​var notað til að bera meðferðarhópa saman við samanburðarhópa; Lifunarvirkni var metin með Kaplan-Meier aðferðum og log-rank prófið var notað til að reikna út tölfræðilegan mun.

Aðgengi gagna

RNA-seq gögnin (GSE99299) og unnin einfrumugögn (GSE123814) voru fengin frá Gene Expression Omnibus (GEO). MS proteomics gögnin (PXD006003) voru fengin úr PRIDE geymslunni. TCGA krabbameinsgagnasettin voru fengin frá UCSC Xena (http://xena.ucsc.edu/). RNA-seq gögnin og klínískar upplýsingar fyrir ICB klínískar rannsóknir voru veittar af viðkomandi samsvarandi höfundum. Öll óunnin gögn sem styðja niðurstöður þessarar rannsóknar eru fáanlegar hjá samsvarandi höfundi sé þess óskað. Heimildargögn eru veitt í þessari grein.

Kóði framboð

Allar greiningar sem notaðar voru í þessari rannsókn voru gerðar í samræmi við handbækur Prism Graphpad útgáfu 8.0 og netvefsíðuna á http://xena.ucsc.edu/. Enginn nýr kóða eða reiknirit voru þróaðir á meðan á þessari rannsókn stóð.

Útvíkkuð gögn

Útvíkkuð gögn Mynd 1:

LIMIT tengist áhrifaónæmisgenum í mörgum krabbameinstegundum.

Útvíkkuð gögn Mynd 2:

Erfðafræðilegar staðsetningar og raðir LIMIT manna og músatakmarka.

Aukin gögn Mynd 3: LIMIT eykur MHC-1 tjáningu

Útvíkkuð gögn Mynd 5:

LIMIT eykur mótefnavakahlaðna MHC-1 tjáningu in vivo.

Útvíkkuð gögn Mynd 6:

LIMIT cis-virkjar GBPs til að auka MHC-1 og æxlisónæmi.

Útvíkkuð gögn Mynd 7:

GBPs virkja HSF1 til að örva MHC-I tjáningu.

Útvíkkuð gögn Mynd 8:

HSF1 knýr MHC-I tjáningu og æxlisónæmi.

Útvíkkuð gögn Mynd 9:

HSF1 merkjagen tengdust MHC-I og æxlisónæmi.

Útvíkkuð gögn Mynd 10: Skema sem sýnir hvernig LIMIT-GBP-HSF1 ás hefur áhrif á MHC-I og æxlisónæmi

Viðbótarefni

Skoðaðu vefútgáfuna á PubMed Central fyrir viðbótarefni.

Viðurkenningar

Við þökkum meðlimum Zou rannsóknarstofu fyrir vitsmunalegt inntak þeirra. Þessi vinna var að hluta til studd af rannsóknarstyrkjum frá bandarísku NIH/NCI R01 styrkjunum (CA217648, CA123088, CA099985, CA193136, CA152470) (WZ), og (CA216919, CA213566, CA12045, og háskólanum 8) frá Michigan Rogel Cancer Center Grant (CA46592).

Heimildir

1. Zou W, Wolchok JD & Chen L PD-L1 (B7-H1) og PD-1 leiðarlokun fyrir krabbameinsmeðferð: Aðgerðir, lífvísar fyrir svörun og samsetningar. Sci Transl Med 8, 328rv324, doi:10.1126/ scitranslmed.aad7118 (2016).

2. Schumacher TN & Schreiber RD Neoantigens í krabbameinsónæmismeðferð. Science 348, 69–74, doi:10.1126/science.aaa4971 (2015). [PubMed: 25838375]

3. Garcia-Lora A, Algarra I og Garrido F MHC flokki I mótefnavaka, ónæmiseftirlit og æxlisónæmisflótti. J Cell Physiol 195, 346–355, doi:10.1002/jcp.10290 (2003). [PubMed: 12704644]

4. Festenstein H & Garrido F MHC mótefnavaka og illkynja sjúkdómur. Nature 322, 502–503, doi:10.1038/322502a0 (1986). [PubMed: 3461283]

5. Garrido F, Aptsiauri N, Doorduijn EM, Garcia Lora AM & van Hall T. Brýn þörf á að endurheimta MHC flokk I í krabbameinum fyrir árangursríka ónæmismeðferð. Curr Opin Immunol 39, 44–51, doi:10.1016/ j.coi.2015.12.007 (2016). [PubMed: 26796069]

6. Hon CC o.fl. Atlas af löngum RNA sem ekki er kóðað úr mönnum með nákvæmum 5' endum. Nature 543, 199– 204, doi:10.1038/nature21374 (2017). [PubMed: 28241135]

7. Mercer TR, Dinger ME & Mattick JS Löng non-kóðun RNA: innsýn í aðgerðir. Nat Rev Genet 10, 155–159, doi:10.1038/nrg2521 (2009). [PubMed: 19188922]

8. Ponting CP, Oliver PL & Reik W Þróun og virkni langra RNA sem ekki eru kóðaðar. Cell 136, 629– 641, doi:10.1016/j.cell.2009.02.006 (2009). [PubMed: 19239885]

9. Wilusz JE, Sunwoo H & Spector DL ​​Löng noncoding RNA: hagnýtur óvart frá RNA heiminum. Genes Dev 23, 1494–1504, doi:10.1101/gad.1800909 (2009). [PubMed: 19571179]

10. Kung JT, Colognori D & Lee JT Löng noncoding RNA: fortíð, nútíð og framtíð. Genetics 193, 651–669, doi:10.1534/genetics.112.146704 (2013). [PubMed: 23463798]

11. Flynn RA & Chang HY Löng noncoding RNAs í frumu-örlög forritun og endurforritun. Cell Stem Cell 14, 752–761, doi:10.1016/j.stem.2014.05.014 (2014). [PubMed: 24905165]

12. Huarte M. Nýtt hlutverk lncRNAs í krabbameini. Nat Med 21, 1253–1261, doi:10.1038/nm.3981 (2015). [PubMed: 26540387]

13. Frankish A o.fl. GENCODE tilvísunarskýring fyrir erfðamengi manna og músa. Nucleic Acids Res 47, D766–D773, doi:10.1093/nar/gky955 (2019). [PubMed: 30357393]

14. Riaz N o.fl. Þróun æxla og örumhverfis meðan á ónæmismeðferð með Nivolumab stendur. Cell 171, 934–949 e916, doi:10.1016/j.cell.2017.09.028 (2017). [PubMed: 29033130]

15. Hugo W o.fl. Erfðafræðilegir og umrita eiginleikar svörunar við and-PD-1 meðferð við sortuæxli með meinvörpum. Cell 168, 542, doi:10.1016/j.cell.2017.01.010 (2017).

16. Van Allen EM o.fl. Erfðafræðileg fylgni við svörun við CTLA-4 blokkun í sortuæxlum með meinvörpum. Science 350, 207–211, doi:10.1126/science.aad0095 (2015). [PubMed: 26359337]

17. Nathanson T o.fl. Sómatískar stökkbreytingar og nýæxlislíkur í sortuæxlum meðhöndluð með CTLA-4 blokkun. Cancer Immunol Res 5, 84–91, doi:10.1158/2326-6066.CIR-16-0019 (2017). [PubMed: 27956380]

18. Sui J o.fl. Kerfisbundnar greiningar á nýrri lncRNA-tengdri undirskrift sem forspár lífmerki fyrir lifrarfrumukrabbamein. Cancer Med, doi:10.1002/cam4.1541 (2018).

19. Kaplan DH o.fl. Sýning á interferón gamma-háð æxliseftirlitskerfi í ónæmishæfum músum. Proc Natl Acad Sci USA 95, 7556–7561, doi:10.1073/pnas.95.13.7556 (1998). [PubMed: 9636188]

20. Fruh K & Yang Y mótefnavaka framsetning með MHC flokki I og stjórnun þess með interferón-gamma. Curr Opin Immunol 11, 76-81 (1999). [PubMed: 10047537]

21. Dong H o.fl. Æxlistengd B7-H1 ýtir undir frumudauða T-frumu: hugsanlegur aðferð til að komast hjá ónæmiskerfi. Nat Med 8, 793–800, doi:10.1038/nm730 (2002). [PubMed: 12091876]

22. Perez-Pinera P o.fl. RNA-stýrð genavirkjun með CRISPR-Cas9-undirrituðum umritunarþáttum. Nat Methods 10, 973–976, doi:10.1038/nmeth.2600 (2013). [PubMed: 23892895]

23. Lin H o.fl. Tjáning hýsils á PD-L1 ákvarðar virkni PD-L1 ferlalokunarmiðlaðrar æxlishvarfs. J Clin Invest 128, 1708, doi:10.1172/JCI120803 (2018). [PubMed: 29608143]

24. Sun Q, Hao Q & Prasanth KV Nuclear Long Noncoding RNA: Key Regulators of Gene Expression. Trends Genet 34, 142–157, doi:10.1016/j.tig.2017.11.005 (2018). [PubMed: 29249332]

25. Cheng YS, Colonno RJ & Yin FH Interferon örvun fibroblast próteina með gúanýlat bindandi virkni. J Biol Chem 258, 7746-7750 (1983). [PubMed: 6305951]

26. Kim BH o.fl. Interferon-framkallað gúanýlatbindandi prótein í bólgueyðandi virkjun og vörn hýsils. Nat Immunol 17, 481–489, doi:10.1038/ni.3440 (2016). [PubMed: 27092805]

27. Messeguer X o.fl. PROMO: uppgötvun þekktra umritunarstjórnunarþátta með því að nota tegundasniðna leit. Lífupplýsingafræði 18, 333–334, doi:10.1093/lífupplýsingafræði/18.2.333 (2002). [PubMed: 11847087]

28. Consortium, EP Samþætt alfræðiorðabók um DNA frumefni í erfðamengi mannsins. Nature 489, 57–74, doi:10.1038/nature11247 (2012). [PubMed: 22955616]

29. Dai C & Sampson SB HSF1: Guardian of Proteostasis in Cancer. Trends Cell Biol 26, 17–28, doi:10.1016/j.tcb.2015.10.011 (2016). [PubMed: 26597576]

30. West JD, Wang Y & Morano KA Smásameindavirkjar hitalostsviðbragðsins: efnafræðilegir eiginleikar, sameindamarkmið og lækningaleg loforð. Chem Res Toxicol 25, 2036–2053, doi:10.1021/tx300264x (2012). [PubMed: 22799889]

31. Zou J, Guo Y, Guettouche T, Smith DF & Voellmy R Bæling á hitalost umritunarstuðli HSF1 virkjun með HSP90 (HSP90 complex) sem myndar streitunæma flókið með HSF1. Cell 94, 471-480 (1998). [PubMed: 9727490]

32. Dayalan Naidu S & Dinkova-Kostova AT Reglugerð spendýra hitaáfallsþáttarins 1. FEBS J 284, 1606–1627, doi:10.1111/febs.13999 (2017). [PubMed: 28052564]

33. Whitesell L & Lindquist SL HSP90 and the chaperoning of cancer. Nat Rev Cancer 5, 761–772, doi:10.1038/nrc1716 (2005). [PubMed: 16175177]

34. Yost KE o.fl. Klónaskipti á æxlissértækum T-frumum eftir PD-1 blokkun. Nat Med 25, 1251–1259, doi:10.1038/s41591-019-0522-3 (2019). [PubMed: 31359002]

35. Harel M o.fl. Proteomics sortuæxla svörun við ónæmismeðferð sýnir hvatberaháð. Cell 179, 236–250 e218, doi:10.1016/j.cell.2019.08.012 (2019). [PubMed: 31495571]

36. Heward JA & Lindsay MA Löng non-kóðun RNA í stjórnun ónæmissvörunar. Trends Immunol 35, 408–419, doi:10.1016/j.it.2014.07.005 (2014). [PubMed: 25113636]

37. Flores-Concha M & Onate AA Long Non-kóðun RNAs í reglugerð um ónæmissvörun og þjálfað ónæmi. Front Genet 11, 718, doi:10.3389/fgene.2020.00718 (2020). [PubMed: 32793280]

38. Schmitt AM & Chang HY Long Noncoding RNAs in Cancer Pathways. Cancer Cell 29, 452–463, doi:10.1016/j.ccell.2016.03.010 (2016). [PubMed: 27070700]

39. Sun TT o.fl. LncRNA GClnc1 stuðlar að krabbameinsmyndun í maga og getur virkað sem einingaskiptur af WDR5 og KAT2A fléttum til að tilgreina histónbreytingamynstur. Cancer Discov 6, 784–801, doi:10.1158/2159-8290.CD-15-0921 (2016). [PubMed: 27147598]

40. Sharma P, Hu-Lieskovan S, Wargo JA & Ribas A Primary, Adaptive, and Acquired Resistance to Cancer Immunotherapy. Cell 168, 707–723, doi:10.1016/j.cell.2017.01.017 (2017). [PubMed: 28187290]

41. Peng D o.fl. Eðlisfræðileg þöggun TH1-lyfjalyfja mótar æxlisónæmi og ónæmismeðferð. Nature 527, 249–253, doi:10.1038/nature15520 (2015). [PubMed: 26503055]

42. Wang W o.fl. CD8(+) T frumur stjórna æxlismyndun meðan á ónæmismeðferð með krabbameini stendur. Nature 569, 270–274, doi:10.1038/s41586-019-1170-y (2019). [PubMed: 31043744]

43. Gao J o.fl. Tap á IFN-gamma Pathway genum í æxlisfrumum sem kerfi viðnám gegn anti-CTLA-4 meðferð. Cell 167, 397–404 e399, doi:10.1016/j.cell.2016.08.069 (2016). [PubMed: 27667683]

44. Zaretsky JM o.fl. Stökkbreytingar tengdar áunninni mótstöðu gegn PD-1 blokkun í sortuæxlum. N Engl J Med 375, 819–829, doi:10.1056/NEJMoa1604958 (2016). [PubMed: 27433843]

45. Manguso RT o.fl. In vivo CRISPR skimun auðkennir Ptpn2 sem krabbameinsónæmismeðferðarmarkmið. Nature 547, 413–418, doi:10.1038/nature23270 (2017). [PubMed: 28723893]

46. ​​Shin DS o.fl. Aðalviðnám gegn PD-1 blokkun miðlað af JAK1/2 stökkbreytingum. Cancer Discov 7, 188–201, doi:10.1158/2159-8290.CD-16-1223 (2017). [PubMed: 27903500]

47. Sucker A o.fl. Áunnið IFNgamma ónæmi skerðir ónæmi gegn æxli og veldur T frumuþolnum sortuæxlum. Nat Commun 8, 15440, doi:10.1038/ncomms15440 (2017). [PubMed: 28561041]

48. Li J o.fl. Stökkbreytingar í ARID1A móta krabbameinsónæmissvipgerð og ónæmismeðferð. J Clin Invest, doi:10.1172/JCI134402 (2020).

49. Benci JL o.fl. Æxlisinterferónmerki stjórnar fjölgena mótstöðuáætlun fyrir blokkun ónæmiseftirlitsstaða. Cell 167, 1540–1554 e1512, doi:10.1016/j.cell.2016.11.022 (2016). [PubMed: 27912061]

50. Arun G, Diermeier SD & Spector DL ​​Therapeutic Targeting of Long Non-Coding RNAs in Cancer. Trends Mol Med 24, 257–277, doi:10.1016/j.molmed.2018.01.001 (2018). [PubMed: 29449148]

51. Gil N & Ulitsky I Reglugerð um tjáningu gena með cis-verkandi löngum RNA sem ekki eru kóðaðar. Nat Rev Genet 21, 102–117, doi:10.1038/s41576-019-0184-5 (2020). [PubMed: 31729473]

52. Jones AN & Sattler M Áskoranir og sjónarhorn fyrir burðarlíffræði lncRNAs - dæmið um Xist lncRNA A-endurtekningar. J Mol Cell Biol 11, 845–859, doi:10.1093/jmcb/mjz086 (2019). [PubMed: 31336384]

53. Shenoy AR o.fl. GBP5 stuðlar að NLRP3 bólgueyðandi samsetningu og ónæmi hjá spendýrum. Science 336, 481–485, doi:10.1126/science.1217141 (2012). [PubMed: 22461501]

54. Tretina K, Park ES, Maminska A & MacMicking JD Interferon-framkölluð gúanýlatbindandi prótein: Forráðamenn hýsilvarna í heilsu og sjúkdómum. J Exp Med 216, 482–500, doi:10.1084/ jem.20182031 (2019). [PubMed: 30755454]

55. Yamamoto M o.fl. Þyrping af interferón-gamma-örvandi p65 GTPasa gegnir mikilvægu hlutverki í vörn hýsils gegn Toxoplasma gondii. Immunity 37, 302–313, doi:10.1016/ j.immuni.2012.06.009 (2012). [PubMed: 22795875]

56. Mbofung RM o.fl. HSP90 hömlun eykur ónæmismeðferð með krabbameini með því að hækka interferónsvörunargenin. Nat Commun 8, 451, doi:10.1038/s41467-017-00449-z (2017). [PubMed: 28878208]

57. Proia DA & Kaufmann GF miða á hitastuðprótein 90 (HSP90) sem viðbótaráætlun við blokkun ónæmiseftirlits fyrir krabbameinsmeðferð. Cancer Immunol Res 3, 583–589, doi:10.1158/2326-6066.CIR-15-0057 (2015). [PubMed: 25948551]

58. Yuno A o.fl. Klínískt mat og lífmerkjasnið á Hsp90 hemlum. Aðferðir Mol Biol 1709, 423–441, doi:10.1007/978-1-4939-7477-1_29 (2018). [PubMed: 29177675]

59. Charo J o.fl. Bcl-2 oftjáning eykur lifun æxlissértækra T-frumna. Cancer Res 65, 2001– 2008, doi:10.1158/0008-5472.CAN-04-2006 (2005). [PubMed: 15753400]

60. Owaki H o.fl. Raf-1 er krafist fyrir T-frumu IL2 framleiðslu. EMBO J 12, 4367–4373 (1993). [PubMed: 8223446]