Kv1.3 hömlun dregur úr taugabólgu með truflun á örveru kalsíumboðum

ÁSTANDUR

Á síðustu 5 árum hefur verið sýnt fram á að hemlar á kalíumrásinni KV1.3 dragi úr taugabólgu í nagdýralíkönum af heilablóðþurrð, Alzheimerssjúkdómi, Parkinsonsveiki og heilaskaða. Á kerfisbundnu stigi eru þessar jákvæðu aðgerðir miðlar af minnkun á örveruvirkjun og bælingu á bólgueyðandi cýtókín- og nituroxíðframleiðslu.

Samt sem áður voru sameindaaðferðir fyrir bælandi verkun KV1.3 blokka á bólgueyðandi virkni örvera ekki þekktar fyrr en hópurinn okkar sýndi nýlega fram á að KV1.3 rásir stjórna ekki aðeins himnugetu, eins og búast mætti ​​við af spennustýrðri kalíumrás. , en gegna einnig mikilvægu hlutverki við að gera microglia kleift að standast afskautun framleidd af hættumerkinu ATP og stjórnar þannig kalsíuminnstreymi í gegnum P2X4 viðtaka. Við skoðum hér hlutverk KV1.3 í örmerkjaboðum og sýnum að, svipað og hlutverk þeirra í T-frumum, stjórnuðu KV1.3 rásir einnig innstreymi kalsíums í verslunum í örveru.

Kalíumrás KV1.3 er jónaganga sem er víða tjáð í ónæmisfrumum, sem gegnir mikilvægu hlutverki í stjórnun frumuhimnugetu, frumuflutnings og starfsemi ónæmisfrumna. Nýlegar rannsóknir benda til þess að efnasambönd sem hamla kalíumrásinni KV1.3 geti hjálpað til við að auka ónæmi líkamans.

Stjórnun ónæmiskerfisins er mikilvægur þáttur í að viðhalda góðri heilsu. Hins vegar, margir sjúkdómar, eins og sjálfsofnæmissjúkdómar, krabbamein og smitsjúkdómar, leiða til óvirkrar ónæmiskerfis. Þess vegna hafa vísindamenn verið að leita leiða til að auka ónæmi. Nýlegar rannsóknir benda til þess að hemlar á kalíumrásinni KV1.3 geti verið vænlegur kostur.

Í ónæmisfrumum stjórnar kalíumrásin KV1.3 himnugetu og hefur þar með áhrif á starfsemi frumna. Rannsóknin leiddi í ljós að með því að hindra kalíumrásina KV1.3 var hægt að draga úr flutningi T-frumna og koma enn frekar í veg fyrir að þær réðust á heilbrigðar frumur og vernda þannig ónæmiskerfið fyrir óþarfa eyðileggingu.

Að auki hafa sumar tilraunir komist að því að hindrun á kalíumrásinni KV1.3 getur einnig stuðlað að öðrum þáttum ónæmiskerfisins. Til dæmis hafa rannsóknir sýnt að með því að hindra þessa rás er hægt að auka gæði og magn ónæmisfrumna og auka þannig viðnám líkamans gegn sýkla og öðrum utanaðkomandi ógnum. Því getur hömlun á kalíumrásinni KV1.3 verið áhrifarík leið til að auka ónæmi.

Að lokum bendir núverandi rannsókn til þess að hömlun á kalíumrásinni KV1.3 geti verið vænleg aðferð til að bæta virkni ónæmiskerfisins og auka heildarónæmi líkamans. En þó þessar niðurstöður séu efnilegar, er þörf á frekari rannsóknum til að ákvarða öryggi og hagkvæmni þess að nota þessa aðferð. Frá þessu sjónarhorni þurfum við að bæta friðhelgi okkar. Cistanche getur bætt ónæmi verulega. Kjötaska inniheldur margs konar líffræðilega virk efni, eins og fjölsykrur, tvo sveppi og Huang Li, sem geta örvað ónæmiskerfið. ýmsar tegundir frumna, auka ónæmisvirkni þeirra.

Smelltu á heilsuávinning af cistanche

Kynning

Spennustýrðu kalíumrásinni KV1.3 var upphaflega lýst í T-frumum [1] og í kjölfarið fylgt eftir sem skotmark til að meðhöndla T-frumumiðlaða sjálfsofnæmissjúkdóma eins og MS, iktsýki og psoriasis [2-4]. Nýlega hefur KV1.3 komið fram sem aðlaðandi lyfjafræðilegt markmið til að draga úr svokallaðri "taugabólgu" með því að stilla örvun örvera. Í bæði músa- og rottumlíkönum af heilablóðþurrð, hefur verið sýnt fram á að KV1.3 blokkarar, af okkur og öðrum, draga úr svæði á hjartadrepi og bæta taugasjúkdóma [5,6]. Í erfðabreyttum múslíkönum af Alzheimerssjúkdómi minnkaði KV1.3 blokkun amyloid í heila, jók mýkt í taugafrumum hippocampus og bætti hegðunarbrest [7].

Á sama hátt, í mörgum dýralíkönum af Parkinsonsveiki hamlaði gjöf litlu sameindarinnar KV1.3 blokkarans PAP-1 hrörnun dópamínvirkra taugafrumna og bætti hegðunarútkomu [8]. Sýnt hefur verið fram á að KV1.3 hömlun eða erfðaeyðing bæti meinafræði hvíta efnisins eftir heilaskaða [9], vitræna hnignun eftir aðgerð [10] og heilaskaða af völdum geislunar [11]. Í öllum þessum dýralíkönum af taugasjúkdómum kom fram aukin KV1.3 tjáning á meinafræðitengdum örverum og meðferð með KV1.3 blokkum leiddi til minni örvunar örvunar og minnkaðs bólgusýtókína í heila dýranna.

Sjúkdómstengd aukin KV1.3 tjáning virðist skila sér í menn þar sem sterk KV 1.3 tjáning hefur einnig fundist í heila eftir slátrun á míkróglium á svæðum með infarct eftir heilablóðþurrð [5,12], á míkróglum umhverfis amyloid plaques í Alzheimerssjúkdómi [ 7,13], og á microglia í prefrontal cortex og substantia nigra í Parkinsonsveiki [8]. Samanlagt benda þessar uppörvandi niðurstöður í líkönum manna og dýra eindregið til KV1.3 rása í örveru sem lækningalegt markmið til að draga úr skaðlegum bólguviðbrögðum í heilanum. En hvernig virka KV1.3 blokkarar? Hvernig dregur blokkun á spennustýrðri kalíumrás í örverum, og væntanlega einnig heila-íferð í einfrumuafleiddum átfrumum, úr bólgueyðandi frumumyndun og bólgumiðluðum vefskemmdum?

Áhrif KV1.3 blokka á virkni microglia

Sýnt hefur verið fram á að ræktaðar nýburamúsar- og rotturmúsar, sem og bráðeinangraðar öreiginleikar úr músarheila eða vefjaprentaðar örgrýtur úr rottuheila, tjá KV1.3 strauma með heilfrumuklemmu sem aukast verulega eftir in vitro örvun eða in vivo inndæling í heila með TLR-4 bindil lípópólýsykru (LPS) [14-18]. Örvun með gram-neikvæðum frumuveggþáttinum LPS er mikið notuð til að framkalla „klassískt“ virkjað „M1-líkt“ ástand örveru sem líkir eftir almennri bólgu sem myndi tengjast bakteríusýkingu [19,20]. Á sviði taugaónæmisfræði ætti LPS örvuð örgjörva helst að vera kölluð M(LPS) míkróglía byggt á áreiti sem notað er til að framkalla skautun til að forðast að nota M1/M2 hugtökin, sem er talin of einfölduð [21], en mikið notuð vegna lækninga. aðdráttarafl.

Eftir örvun með LPS má sjá aukna KV1.3 tjáningu á mRNA stigi og próteinstigi með Western blotting, ónæmisvefjafræði og auknum straumþéttleika mældur með heilfrumu patch-clamp [15-18]. Svipuð, en örlítið minni aukning á Kv1.3 tjáningu á sér stað þegar ræktuð nýburaörvun er örvuð með oligomeric amyloid- (AO) eða -synuclein [7,8], tveimur próteinum sem eru misbrotin og safnast saman í Alzheimer eða Parkinsonsveiki, og sem eru oft notuð til að búa til in vitro líkan af örveruviðbrögðum sem tengjast viðkomandi sjúkdómi.

Í þessum tegundum in vitro kerfa dregur KV1.3 hömlun eða erfðaeyðing úr tjáningu og framleiðslu margra bólgumiðla sem mældir eru 24- eða 48-klst. eftir örvun örveru. Fyrir um það bil 20 árum síðan greindi rannsóknarstofa Lyanne Schlichter frá því að KV1.3 hemlar bæli niður phorbol ester-örvaðan öndunarlos [22] og NO framleiðslu í ræktuðum nýbura rottum microglia, þannig að draga úr microglia-miðluðu taugafrumudrep í transwell ræktunarkerfi [16].

Í nýrri rannsókn frá rannsóknarstofu okkar [17], þar sem áhrif KV1.3 og KCa3.1 blokka voru borin saman við mikið notaða microglia hemlann minocycline á misskautaða nýbura músa microglia, sáum við að Kv1.3 hömlun minnkaði tjáningu og framleiðslu af bólgueyðandi frumudrepunum IL-1 og TNF- eftir 24 og 28 klst. og kom í veg fyrir uppstjórnun á bólgutengdu ensímunum cyclooxygenase2 (COX-2) og framkallanlegum nituroxíðsyntasa (iNOS). Síðarnefndu áhrifin voru líklega ábyrg fyrir minni NO framleiðslu sem sást í örveru sem var meðhöndluð með KV1.3 hemlum 24 og 48 klukkustundum eftir LPS örvun. Svipað og í fyrri vinnu, sáum við einnig að KV1.3 hemlar koma í veg fyrir dráp á taugafrumum í lífrænum tegundum af hippocampus sneiðum 3 dögum eftir að microglia var virkjað annað hvort í gegnum 1-klukkutíma súrefnisskorts/blóðsykurs til að líkja eftir blóðþurrðarslagi [5] eða með meðferð með óligómerískum amyloid- til að líkja eftir örvunarörvun í AD [7].

Auk þess að draga úr örvunarörvun af völdum AO, fyrirbæri sem hægt er að sýna greinilega með því að lita microglia fyrir CD11b eða Iba-1 og meta styrk flúrljómunar, hefur KV1.3 hemillinn PAP-1 einnig reynst koma í veg fyrir O-framkallað, míkróglía-miðlað skerðing á langtímastyrkingu (LPT) í hippocampus sneiðum og til að draga úr A O-framkölluðum framleiðslu á IL-1, TNF- og NO í ræktuðum músamiklum [7], mjög svipuð til þess sem fundist hafði fyrir KV1.3 hemla með LPS örvuðum örverum [17,18]. Í tilraunum þar sem ræktuð nýbura mús microglia frá villigerð og KV1.3-/- músum voru örvuð með samanlagðri -synuclein (SynAgg), sem virkjar microglia með því að bindast mynsturþekkingarviðtaka TLR2 og CD36 [23], bæði lyfjafræðileg KV1. 3 hömlun með PAP-1 og erfðafræðileg eyðing á rásinni leiddu til minnkaðrar IL-1, IL-6, IL-12 og TNF-framleiðslu og komu í veg fyrir uppstjórnun NLRP3 bólgueyðandi prótein við 24. klukkustundum eftir örvun örverunnar [8]. Aftur á móti jók oftjáning á KV 1.3 í míkróglial frumulínu SynAgginduced tjáningu eða seytingu IL-1, TNF-, IL-6 og IL-12 24 klukkustundum eftir örvun [8].

Ýmsar rannsóknir annarra hópa staðfestu að KV1.3 blokkarar draga úr bólgueyðandi virkni örvera þegar svipað áreiti eða áreiti sem tengjast öðrum bólgusjúkdómum eru notuð. Til dæmis, hjá ræktuðum rottum sem virkjaðar voru með HIV Tat próteini eða með glýkópróteini 120 (gp120) til að líkja eftir HIV1-tengdri taugavitrænum röskun, kom í ljós að KV1.3 hömlun eða niðurfelling með siRNA dregur úr IL-1 , TNF- og NO framleiðslu og bæla taugaeiturhrif [24,25]. Með því að nota líkan af heilablóðþurrð og súrefnis-/glúkósaskorti á ræktuðum örverum Ma o.fl. greint frá því að KV1.3 hömlun breytti smáglíumlíki úr bólgueyðandi M1-líkri svörun í M2-líka svörun og minnkaði NLRP3 bólgueyðandi virkjun [5,6], svipað og ofangreindar rannsóknir í líkönum af Parkinsonsveiki [8].

Notkun nýeinangraðra CD11b plús frumna, sem samanstanda af bæði átfrumum sem síast inn í miðtaugakerfið og heilabúnar örverur úr heila músa sem höfðu verið meðhöndlaðar með LPS í kerfisbundinni meðferð í nærveru og fjarveru KV1.3 blokkandi peptíðsins ShK-223, Rangaraju o.fl. staðfest að KV 1.3 hömlun dregur úr tjáningu bólgusýtókína eins og IL-1 en sýndi að KV1.3 hömlun minnkaði einnig tjáningu á TAP1 og kom í veg fyrir uppstýringu EHD1 í CD11b ásamt CD45low microglia eins og mæld er með flæðifrumumælingum [26]. Bæði TAP1 og EDH1 eru prótein sem taka þátt í MHC flokki I samsetningu og flutningi á frumuyfirborðið. Höfundarnir rannsökuðu því næst áhrif ShK-223 meðferðar á tjáningu MHC flokks-1 á bráð einangruðum örverum, og byggðu á minni MHC tjáningu, að LPS framkallaði aukningu á getu mótefnavaka microglia eru KV 1.3-háð ferli, sem bendir til þess að KV1.3 hömlun gæti dregið úr kynningu mótefnavaka fyrir CD8 auk frumudrepandi T-frumna.

Í síðari veginni samtjáningarnetsgreiningu sem beitt var á örritauppskriftargagnasöfn úr taugabólgu- og taugahrörnunarsjúkdómum múslíkönum greindi sami hópur KV1.3 sem hluta af bólgueyðandi genamerki sem einnig innihélt Tlr2, Ptgs2, Il12b, Il1b, CD44, NFκB, Stat1 og RelA [27]. KV1.3 blokkun með ShK-223 gæti fært þessa bólgueyðandi undirskrift yfir í eina með aukinni tjáningu bólgueyðandi gena í sjúkdómstengdri örveru. Það sem er áhugavert í þessu samhengi er að í öðrum rannsóknum hefur verið greint frá því að Kv1.3 hemlar eykur enn frekar flæði ræktaðra örvera sem örvaðar eru með bólgueyðandi frumudrepunum IL-4 og IL-10 [28] og til að hafa ekki áhrif á átfrumumyndun í örperlum [26] eða jafnvel auka átfrumu á amyloid- [7].

Samanlagt eru því nægar vísbendingar um að microglia tjái KV1.3 og að KV1.3 blokkar bæli bólgueyðandi, taugaeitrandi microglia aðgerðir og gætu jafnvel fært microglia í átt að taugaverndandi svipgerð. Við einbeittum okkur hér að mestu að því að draga saman gögn sem fengin eru með ræktuðum örglíum- eða sneiðræktum vegna þess að í þessum minnkunarkerfum er enginn vafi á því að útsláttur, útsláttur eða lyfjafræðileg blokkun hefur áhrif sín beint með hömlun á KV1.3 örgöngum en ekki óbeint með áhrifum KV1.3 rásir í T-frumum, B-frumum, dendritic frumum eða monocytes, sem allar tjá KV1.3 [29], og gætu þannig stuðlað að in vivo áhrifum KV1.3 blokka eða niðurstöður sem gerðar eru með KV1.3−/- mýs. Hins vegar viljum við benda hér á að auk fjölmargra rannsókna sem sýna KV1.3 tjáningu á microglia í nagdýrum og mönnum með ónæmisvefjaefnafræði, hafa Kettenmann rannsóknarstofan og hópur okkar ítrekað sýnt fram á að aukin KV1.3 tjáning á virkjaðri microglia er ekki bara vefjaræktunarfyrirbæri og að Kv1.3 strauma sé hægt að skrá frá míkróglum í bráðum sneiðum [30,31] og frá bráðeinangruðum míkróglíum úr heila 5xFAD músa [7] eða frá infarct svæðinu eftir miðheilaslagæðastíflu [5, 12], líkan fyrir heilablóðþurrð.

Merkjaleiðir sem hafa áhrif á KV1.3 hömlun eða mótandi Kv1.3 tjáningu

Rannsóknir sem rannsakað hafa verið merkjaleiðir (Mynd 1) sem verða fyrir áhrifum af KV1.3 blokkum til að framkalla þessar jákvæðu lækkun á bólgueyðandi örveruvirkni 24 eða 48 klukkustundum síðar hafa gefið nokkuð misvísandi niðurstöður, sem benda til þess að áhrif KV1.3 blokka séu háð á áreitinu og kannski tegundinni. Á meðan Fordyce o.fl. greint frá því að KV1.3 blokkarar hafi ekki áhrif á p38MAPK fosfórun í LPS-meðhöndluðum nýbura rottum microglia [16], nokkrar aðrar rannsóknir sem nota mús microglia hafa komist að því að KV1.3 blokkar draga mjög úr p38MAPK fosfórun sem og virkjun NF-kB í kjölfar örvunar með LPS, AO, SynAgg eða HIV-1 glýkóprótein 120 [7,8,24]. Í microglial frumulínunni hefur einnig verið sýnt fram á að BV2 KV1.3 stjórnar S727 fosfórun STAT1 [26]. Athyglisvert er að hvort KV1.3 blokkar hamli NFAT umfærslu, hefur ekki verið rannsökuð ein best rannsakaða áhrif KV1.3 blokka í T frumum [2,32,33] í microglia hingað til.

Aukningin á KV1.3 tjáningu í kjölfar örvunar á microglia með LPS, AO eða SynAgg virðist fela í sér mörg af sömu merkjaföllum sem verða fyrir áhrifum af KV1.3 hömlun og KV1.3 blokkar koma venjulega í veg fyrir aukningu á Kv1.3 tjáningu. KV1.3 hvatarinn inniheldur marga NF-kB og SP1 bindistaði og hemlar NF-kB eða p38MAPK draga sjálfstætt úr SynAgg örvaðri Kv1.3 uppstjórnun í örveru [8], sem sýnir að bæði p38MAPK og klassíska NF-kB ferlið. miðla umritunarreglugerð KV1.3 (Mynd 1). Src fjölskyldu kínasinn Fyn vinnur andstreymis NF-KB umritunarþáttarins með því að stjórna kjarnaflutningi p65 þáttarins hans [34] og með því að fosfóra PKC ísóformið PKCδ. Sarkar o.fl. greint frá því að útsláttur á Fyn dregur úr bæði LPS og SynAgg völdum aukningu á KV1.3 straumþéttleika í ræktuðum míkróglíum, áhrifum sem hægt er að líkja eftir með meðferð á míkrógljáa með Fyn hemlinum saracatinibi eða með skort á PKCδ, sem bendir til þess að Fyn/PKCδ kínasa merki Cascade tekur þátt í að miðla KV1.3 uppstjórnun sem svar við bólguáreiti [8]. Eins og sýnt er fram á í Duolink nálægðargreiningu, hefur Fyn bein samskipti við Kv1.3 og er að fosfóra rásina við Y135 til að auka virkni þess.

Kv1.3 stjórnar himnugetu og þolir afskautun'

Þrátt fyrir ofangreindar vel skjalfestar bætandi áhrif KV1.3 blokka á taugabólgu in vivo og á boðefnaflæði örvera og tjáningu og seytingu bólgumiðlara in vitro, voru grundvallarsameindaleiðir þess hvernig KV1.3 blokkarar hafa áhrif á virkni örvera lengi óljósar. Margir rannsakendur, þar á meðal rannsóknarstofan okkar, gerðu einfaldlega ráð fyrir að KV1.3 gegndi sömu hlutverki í míkróglum og það gegndi í T-frumum, nefnilega að stjórna himnugetu og kalsíumflæði [29,32,33].

Í T-frumum leiðir KV1.3 hömlun til himnuafskautunar og dregur úr kalsíumflæði í gegnum kalsíumlosunarvirkjaðar kalsíumgöng (CRAC) í kjölfar örvunar T-frumnaviðtaka [33,35,36]. Kalsíuminnstreymi um CRAC rásir er bráðnauðsynlegt fyrir affosfórun og síðari kjarnaflutning á kalsíum/calmodulin háða umritunarþættinum NFAT [29], sem kveikir á umritun cýtókínsins IL-2 [29,33]. IL-2 losnar úr virkum T-frumum við nýmyndun og örvar T-frumuklónaþenslu á sjálfs- og paracrine hátt. Með því að hindra mótvægisútstreymi kalíums sem er nauðsynlegt til að viðhalda innstreymi kalsíums í gegnum CRAC rásir trufla KV1.3 blokkar virkjun T-frumna, koma í veg fyrir NFAT-affosfórun og kjarnaflutning [32] sem leiðir til minni útbreiðslu T-frumna og minni bólgumyndunar og seytingar cýtókína eftir 48 klst. [5,33,35,36].

Hins vegar hafði það aldrei verið prófað í microglia, sem ólíkt T-frumum tjá einnig innleiðréttinguna Kir2.1 [17,37,38] og tveggja pora kalíumrásina THIK-1 (K2P 13.1) [39], hvort KV1.3 blokkar myndu hafa sömu sameindaáhrif eða hvort hlutverk KV1.3 væri tekið yfir af þessum öðrum kalíumgöngum. Í nýlegri rannsókn tók hópurinn okkar til samræmis við þessa spurningu með því að endurskoða fyrst grundvallarþýðingu KV1.3 við að viðhalda hvíldarhimnugetu og standast afskautun [40]. Eins og búist var við lækkaði oftjáning á KV1.3 í CHO frumum venjulega mjög afskautaða hvíldarhimnugetu þessara frumna úr -20 mV í -50 mV, en KV1.3 hömlun með ShK-223 afskautuðum örverum, sem í eðli sínu viðheldur meira ofskautað hvíldarhimnugeta, sem í okkar höndum var að meðaltali um -90 mV í ógreindum míkróglum sem tjáðu aðallega Kir2.1 og um -65 mV í LPS örvuðum míkróglum sem tjáðu hærri KV1.3 og lægri Kir2.1 straumþéttleika [40].

Þótt KV1.3 stuðli þannig að því að stjórna hvíldarhimnumöguleika í míkróglíum (Mynd 2), teljum við mikilvægara hlutverk þess, og ástæðan fyrir því hvers vegna Kv1.3 tjáning eykst í virkjuð míkróglum, vera hæfni rásarinnar til að vega upp á móti öfgafullum og langvarandi himnuafskautun sem hugsanlega getur haft neikvæð áhrif á heilsu og lífeðlisfræði örvera eins og fram kemur í núverandi inndælingartilraunum. Þó að núverandi inndælingar upp á 25 pA geti ekki afskautað KV 1.3 sem tjáir microglia umfram -30 mV í fjarveru blokka, þá afskautast microglia sem formeðhöndluð eru með KV 1.3 blokkum upp í plús 50 mV sem svar við sömu 25 pA strauminnsprautunum [40] , sem bendir til þess að KV1.3 geti "klemt" himnugetu nálægt virkjunarþröskuldsgetu rásarinnar til að koma í veg fyrir of mikla himnuafskautun (Mynd 2).

Staðan í lífeðlisfræði míkróglíum þar sem þessi afkastageta er mikilvæg er þegar míkróglíur verða fyrir utanfrumu ATP, hættumerki sem getur náð styrk á háu míkrómolar bili vegna losunar frumusýru-ATP frá skemmdum taugafrumum eða ATP sem inniheldur taugamótablöðrur [41], sem virkja P2X viðtakarásir sem leiða til mikillar afskautunar [42]. Í okkar eigin höndum sýndu núverandi klemmutilraunir sem gerðar voru á ósérgreindum og LPS-örvuðum míkróglum að bráð útsetning fyrir 100 μM ATP, sem af P2X viðtökum sem tjáð eru í míkróglíum virkjar fyrst og fremst P2X4, leiðir til áberandi afskautunar í óaðgreindum míkróglum, þrátt fyrir meiri ofskautað hvíldarhimnugeta en í KV1.3high LPS-örvuðum microglia, sem afskautaði ekki yfir -40 mV. KV1.3 blokkar skertu þessa hæfni til að standast afskautun af völdum ATP og örgljáa afskautuðust í návist þeirra [40].

KV1.3 stjórnar P2X4 viðtaka-miðluðu kalsíumflæði í microglia

Kalsíummyndatilraunir leiddu í ljós að þessi hæfni KV1.3 rása til að standast ATP-framkallaða P2X4- miðlaða afskautun eykur Ca2 plús inngöngu í microglia í gegnum P2X4 viðtaka örvaða með 100 μM af ATP [40]. Til dæmis sáum við að KV1.3 blokkararnir ShK-223 og PAP-1 drógu úr ATP-völdum Ca2 plús innstreymi í gegnum P2X4 viðtaka í LPS-aðgreindum microglia sem tjá mikinn KV1.3 straumþéttleika, miklu meira sterklega en í óörvuðum míkróglum jafnvel þó LPS örvun lækki tjáningu P2X4 viðtaka í ræktuðum míkróglum. Aftur á móti hafði KV1.3 blokkun engin áhrif á ATP-framkallaða kalsíumskammta tíma í IL-4 örvuðum örverum, sem tjá mjög lágt magn KV1.3. Athyglisvert er að á meðan LPS eykur einnig KV1.3 og dregur úr tjáningu P2X4 á microglia in vivo, þá eykst bæði KV1.3 og P2X4 tjáning samhliða blóðþurrðarslagi eins og sýnt er af rannsóknarstofu okkar á bráðeinangruðum örverum frá heilahveli músa með æðadrep. orðið fyrir heilablóðþurrð og af öðrum hópum á nagdýrum og mönnum með ónæmisvefjaefnafræði eða qPCR [5,12,43-46]. Þetta bendir til þess að í kjölfar blóðþurrðaráfalls gæti KV1.3 verið að stjórna flóknari kalsíumboðum úr hreinni örglíum sem koma af stað með hættumerkinu ATP sterkari en in vitro. ATP og önnur taugafrumuafgangur í heiladrepinu virkjar microglia, sem síðan framleiðir og losar stöðugt fleiri bólgumiðla innan 24 til 72 klukkustunda og skemmir og drepur þannig fleiri taugafrumur í penumbra sem leiðir til bólguútþenslu í infarctinu.

Aukin KV1.3 tjáning sem sést á míkróglium í innfaramörkum innan 2-5 daga [5] gerir væntanlega virkjaðri míkróglía kleift að viðhalda sterkari kalsíumboðum með auknum fjölda P2X4 viðtaka og mynda þannig fleiri bólgumiðla sem skemma fleiri taugafrumur og virkja meira microglia. Þessi tilgáta væri í samræmi við niðurstöðuna um að KV1.3 blokkarinn PAP-1 minnkaði örvun örvera og heilaþéttni IL-1 og IFN- , sem leiddi til um það bil 40 prósenta minni infarctsvæða og bætts taugasjúkdóms. skora bæði í músa- og rottumlíkönum af heilablóðþurrð [5]. Með því að afskautun microglia draga Kv1.3 blokkar kalsíuminnstreymi í gegnum P2X4 viðtaka sem koma af stað af ATP sem losnar úr skemmdum taugafrumum og draga þannig úr frekari kalsíumháðri virkjun NLRP3 bólgusjúkdómsins, NF-KB og annarra umritunarþátta sem leiða til minnkaðrar framleiðslu bólgumiðlara (Mynd 1) og minni meinafræði.

Hvaða aðrar kalsíumflæðisleiðir í microglia eru stjórnaðar af KV1.3?

Þó að KV1.3 blokkun hafi greinilega dregið úr innstreymi kalsíums af völdum ATP í gegnum P2X4 viðtaka [40] og sé þar með mikilvægur eftirlitsaðili þessarar kalsíuminnstreymisleiðar í örveru (Mynd 2), er þetta ekki eina KV1.3 eða ATP-háða kalsíumboðin. ferli í microglia. Til viðbótar við P2X viðtakarásir tjá microglia einnig metabotropic P2Y purinergic viðtaka sem eftir virkjun með ATP eða UTP geta framkallað kalsíumlosun úr innri geymslum [47] og virkjað verslunarstýrt Ca2 plús inngang (SOCE) eftir að tiltölulega litlar kalsíumbirgðir innan frumu tæmast. í microglia [38]. Það er því vissulega mögulegt að viðbótar SOCE hafi stuðlað að ATP-framkölluðum Ca2 plús merkjum sem við höfðum myndað og að sumum KV1.3 blokkaráhrifa hafi verið miðlað með því að minnka SOCE til viðbótar.

Þetta er mjög líkleg tilgáta þar sem „klassíski“ sameindabúnaðurinn fyrir KV1.3 blokka í T-frumum er minnkun SOCE í gegnum CRAC rásir í kjölfar virkjunar T-frumuviðtaka og í kjölfarið minnkað virkjun umritunarþáttar og frumumyndunar og losunar [29,33, 36,48]. Ítrekað hefur verið greint frá straumum með lífeðlisfræðilegum eiginleikum sem eru dæmigerðir fyrir CRAC strauma [49,50] og tjá sameindaþætti CRAC rása, Orai og STIM [51,52] ítrekað hefur verið greint frá því að míkróglur úr rottum og músum. Ennfremur eru vísbendingar um að erfðafræðileg eyðing á Orai1, STIM1 og STIM2 dragi úr CRAC straumi og/eða SOCE og hamli flutningi og átfrumum í ræktuðum músum [52], á meðan litla sameindin CRAC rásalokarinn CM-EX-137 hefur Nýlega hefur verið greint frá því að minnka örvun örveru og stærð skemmda í múslíkani af heilaskaða áverka [53].

Blokkun á KV1.3 rásum dregur úr kalsíuminngangi í verslunum í LPS-örvuðum örverum

Í framhaldi af fyrri ritgerð okkar um hlutverk KV1.3 við að stjórna P2X4 miðluðu kalsíuminnstreymi, spurðum við hér sérstaklega spurningarinnar hvort KV1.3 blokkarinn ShK-223 myndi einnig draga úr SOCE í LPS aðgreindum microglia , sama örvunarástand, þar sem við höfðum séð hæsta KV1.3 straumþéttleika og mestu áhrif KV1.3 hömlunar á ATP framkallað kalsíumboð [40]. Með því að nota hlutfallsmælanlega kalsíumvísirinn Fura-2 til að fylgjast með breytingum á styrkleika frís innanfrumu kalsíums ([Ca2 plús ]i) komumst við að því að LPS aðgreindar örverur voru með kalsíumstyrk í hvíld [Ca2 plús ] I sem var á milli 60 nM og 370 nM, að meðaltali 150 ± 8,8 nM (n=50; mynd 3a,c,g), sem er í samræmi við fyrri skýrslu [54]. Til að kalla fram SOCE voru kalsíumbirgðir innanfrumu fyrst tæmdar með thapsigargini (Tg), blokkara fyrir endoplasmic reticulum Ca2 plús -ATPasa, sem borið var á í nafnlausri Ca2 plús -lausri baðlausn.

Removal of extracellular calcium produced a roughly 25 nM decrease in [Ca2+] I (Figure 3a) indicating the presence of a calcium influx at rest. Subsequent application of Tg (1 μM) elicited small amplitude (>25 nM) ósamstilltar hækkanir á [Ca2 plús ] I vegna óvirkrar kalsíumlosunar úr birgðum. Þegar kalsíum var bætt inn í baðlausnina kom fram hröð hækkun á [Ca2 plús] I yfir hvíldargildi af völdum SOCE. Stærð SOCE-framkallaðra [Ca2 plús ] I skammvinnra tímabundinna („hámark SOCE“) mæld sem munurinn á [Ca2 plús ] I magni í Ca2 plús-lausu baðlausninni og hámarkshækkunar [Ca2 plús ] I eftir endurbætt kalsíum var mismunandi marktækt meðal einstakra frumna með hámarks SOCE dreifingu sem sýnir hámark við 120 nM og hala allt að 1800 nM (Mynd 1b). Þessi misleitni í styrk SOCE stafar líklega af breytileika í hvíldarhimnugetu, sem veitir drifkraftinn fyrir innkomu kalsíums meðan á SOCE stendur. Í ljós hefur komið að hvíldarhimnugeta LPS-aðgreindra örvera sé breytilegt á milli -90 mV og -40 mV í einstökum frumum [40,55] og gæti því skýrt þann mun sem sést á SOCE.

Fyrri rannsókn greindi frá því að hækkun á [Ca2 plús ] I í hvíld tengdist skertri getu ytri áreita eins og P2Y viðtakaörva UTP eða complement factor 5a til að framkalla [Ca2 plús ] I skammvinn í LPS-virkjaðri örveru [54]. Vegna þess að í rannsókn okkar voru bæði hvíldar [Ca2 plús ]i gildi og hámarks SOCE gildi mismunandi milli einstakra frumna, könnuðum við hvort breytileiki í hvíldar [Ca2 plús ]i gæti skýrt misleitni í hámarks SOCE gildi. Að teikna hámarks SOCE gildi samanborið við hvíldar [Ca2 plús] I, sýndi jákvæða fylgni milli hámarks SOCE og hvíldar [Ca2 plús] I (Mynd 3c). Þegar við skiptum gögnunum í tvo hópa með 600 nM afmörkunargildi fyrir hámark SOCE, voru tengslin milli hvíldar [Ca2 plús ] I og hámarks SOCE í hverjum hópi sterkari en í öllu þýðinu, sem gefur til kynna að minnsta kosti tvær frumur séu til staðar. íbúa, sem eru mismunandi bæði hvað varðar stærð SOCE og styrk fylgni milli hvíldar [Ca2 plús ] I og hámarks SOCE. Þannig, innan þýðis LPS-meðhöndlaðra frumna, er hækkun á hvíldar [Ca2 plús ]i ekki orsakatengt minni getu virkjaðra örvera til að bregðast við utanaðkomandi áreiti með [Ca 2 plús ] I skammvinnri, eins og áður var lagt til. eftir Hoffman o.fl. Gögnin okkar benda til þess að algeng áhrif, eins og magn himnugetu, sem er stjórnað af ýmsum rásum, þar á meðal KV1.3, Kir2.1 og THIK-1, gæti verið ábyrgur fyrir jákvæðri fylgni milli hvíld [Ca2 plús ] I og hámark SOCE sem sást í rannsókn okkar. Til dæmis gæti oftjáning eða virkni uppstýring á ofskautunarrásum ofskautað himnuna og aukið drifkraftinn fyrir bæði kalsíuminngang um virkar kalsíumgegndræpar rásir eins og efnaskiptavirkjaðar skammtímaviðtakagetu (TRP) rásir og geymslustýrðar rásir sem eru virkjaðar í kjölfar eyðingar á geymslu. eins og CRAC rásir.

Pre-incubation of cells with the KV1.3 inhibitor ShK-223 did not significantly affect resting [Ca2+] I (Figure 3d,g), but eliminated peak SOCE responses larger than 300 nM and shifted the maximum of the distribution of peak SOCE values from 130 nM (Figure 3b, control) to 70 nM (Figure 3e, ShK223). The difference between the values of peak SOCE in control cells and cells preincubated with ShK-223 was significant (Figure 3h). The relationship between resting [Ca2+] I and peak SOCE still displayed a mild positive correlation (figure 3f). Taken together, our data indicate that similarly to T lymphocytes, blockade of KV1.3 channels significantly reduces SOCE in LPS differentiated microglia. The extent of the inhibition varied among cells with a greater effect on cells expressing large magnitude (>300 nM) SOCE. Á eftir að ákvarða sértæka eiginleika frumanna með háan og lágan hámark SOCE.

Við lífeðlisfræðilegar aðstæður er hægt að kveikja á SOCE í kjölfarið til að geyma eyðingu í kjölfar virkjunar á G-prótein tengdum P2Y viðtökum og stuðlar að samsettri [Ca2 plús ] I hækkun við virkjun P2Y og P2X viðtaka framkallað af algengum hreingerandi örvum, eins og ATP. Stærð SOCE er verulega breytileg milli LPS sérhæfðra fruma, sem getur verið fall af einstakri samsetningu mismunatjáningar verslunarstýrðra rása og rása sem stjórna himnugetu, eins og KV1.3. Minnkun á hámarki SOCE um ShK-223 gefur til kynna að KV1.3 rásir séu öflugir eftirlitsaðilar SOCE og afhjúpa viðbótarkerfi þar sem KV1.3 blokkar draga úr kalsíumboðum og síðari virknisvörun (td frumumyndun) í kjölfar kalsíumháðrar umritunar þáttarvirkjun í microglia.

Ályktanir

Þó að það sé vissulega krefjandi að greina áhrif framlagsins á frumur útlæga ónæmiskerfisins, sérstaklega á T minnisfrumur og átfrumur unnin af einfrumuefnum, hafa jákvæð áhrif KV1.3 blokka á bólgu í miðtaugakerfi. ljóst að KV1.3 gegnir mikilvægu hlutverki við að stjórna himnugetu, koma í veg fyrir afskautun og stjórna kalsíumboðatilvikum sem leiða í kjölfarið til örvunar örvunar og bólgumiðlunarframleiðslu. Við viljum benda á að frá lækningalegu sjónarmiði sé líklega æskilegt að hindra KV1.3 í mörgum frumugerðum ónæmiskerfisins. Hins vegar væri það vitsmunalega mjög ánægjulegt og gagnlegt fyrir þróun meðferðar að skýra hvert aðal frumumarkmið KV1.3 hemla er og hvort meðferðarlyf þurfi að vera í gegnum heila til að hafa sem best bætandi áhrif á miðtaugakerfissjúkdóma. Þessum spurningum ætti helst að bregðast við lyfjafræðilega með því að prófa litlar sameindir sem komast í gegnum heila hlið við hlið með útlægum peptíðum KV1.3 hemlum eða and-KV1.3 mótefnum [58,59] í dýralíkönum Alzheimers og Parkinsons sjúkdóms. Það væri ennfremur mjög upplýsandi að bera saman áhrif skilyrtrar KV1.3 eyðingar í míkróglum, átfrumna sem eru unnin af einstofum og mismunandi undirhópum T-frumna við áhrif lyfjameðferðar til að öðlast ítarlegri skilning á hlutverki KV1.3 í taugabólgu. og frumumarkmið KV1.3 hemla. Hins vegar teljum við að á frumustigi muni grundvallarhlutverk KV1.3 alltaf vera það sem fyrst var lýst í T-frumum, nefnilega stjórnun á himnugetu og kalsíumflæði og síðari virkjun kalsíumháðra umritunarþátta. Það sem stundum er ekki nógu stressað í þessum efnum er líklega að lífeðlisfræðilegir eiginleikar KV1.3 eins og hálfvirkjunarspenna hans og tiltölulega hægur óvirkjun [60,61], „hæfa“ rásina fullkomlega til að standast himnuafskautun og gera þannig KV1 kleift. .3 til að stjórna ekki aðeins SOCE, eins og lýst var fyrir 30 árum í T-frumum, heldur einnig P2X viðtakamiðlað kalsíumflæði.

Yfirlýsing um upplýsingagjöf

Ekki var greint frá hugsanlegum hagsmunaárekstrum af höfundum.

Fjármögnun

Þessi vinna var studd af National Institute of Neurological Disease and Stroke verðlaunum NS100294 (til HW) og UC Davis School of Medicine Research Partnership Grant (til AFF).

Heimildir

[1] DeCoursey TE, Chandy KG, Gupta S, o.fl. Spennustýrðar K plús rásir í T eitilfrumum manna: hlutverk í mítógenmyndun? Náttúran. 1984;307(5950):465–468.

[2] Beeton C, Wulff H, Standifer NE, o.fl. Kv1.3 rásir eru meðferðarmarkmið fyrir T-frumumiðlaða sjálfsofnæmissjúkdóma. Proc Natl Acad Sci USA. 2006;103 (46):17414–17419.

[3] Tarcha EJ, Chi V, Munoz-Elias EJ, et al. Varanleg lyfjafræðileg svörun frá peptíðinu ShK-186, sérstakur Kv1.3 rás hemill sem bælir T frumumiðlara sjálfsofnæmissjúkdóms. J Pharmacol Exp Ther. 2012;342(3):642–653.

[4] Chandy KG, Norton RS. Peptíðblokkarar á Kv1.3 rásum í T-frumum sem meðferð við sjálfsofnæmissjúkdómum. Curr Opin Chem Biol. 2017;38:97–107.

[5] Chen YJ, Nguyen HM, Maezawa I, et al. Hömlun á kalíumrásinni Kv1.3 dregur úr hjartadrepi og bólgu í heilablóðfalli. Ann Clin Transl Neurol. 2018;5(2):147–161.

[6] Ma DC, Zhang NN, Zhang YN, o.fl. Kv1.3 rásblokkun dregur úr blóðþurrð/endurflæðisskaða í heila með því að endurmóta M1/M2 svipgerðir og koma í veg fyrir virkjun NLRP3 inflammasome í microglia. Exp Neurol. 2020;332:113399.

[7] Maezawa I, Nguyen HM, Di Lucente J, o.fl. Kv1.3 hömlun sem hugsanleg microglia-miðuð meðferð við Alzheimerssjúkdómi: forklínísk sönnun á hugmyndinni. Heili. 2018;141(2):596–612.

[8] Sarkar S, Nguyen HM, Malovic E, et al. Kv1.3 stjórnar taugabólgu og taugahrörnun í Parkinsonsveiki. J Clin Invest. 2020;130 (8):4195–4212.

[9] Reeves TM, Trimmer PA, Colley BS, o.fl. Miða á Kv1.3 rásir til að draga úr hvítefnissjúkdómi eftir heilaáverka. Exp Neurol. 2016;283(PtA):188–203.

[10] Lai IK, Valdearcos M, Morioka K, et al. Lokun Kv1.3 kalíumganga kemur í veg fyrir taugabólgu eftir aðgerð og vitræna hnignun án þess að skerða sáragræðslu í músum. Br J Anaesth. 2020;125 (3):298–307.

[11] Peng Y, Lu K, Li Z, o.fl. Blokkun á Kv1.3 rásum bætir heilaskaða af völdum geislunar. Neuro Oncol. 2014;16(4):528–539.

[12] Chen YJ, Nguyen HM, Maezawa I, et al. Kalíumrásin KCa3.1 er lyfjafræðilegt markmið fyrir taugabólgu í tengslum við blóðþurrð/endurflæðisslag. J Cereb blóðflæði Metab. 2016;36 (12):2146–2161.

[13] Rangaraju S, Gearing M, Jin LW, o.fl. Kalíumrás Kv1.3 er mjög tjáð af microglia í Alzheimerssjúkdómi manna. J Alzheimer Dis. 2015;44 (3):797–808.

[14] Norenberg W, Gebicke-Haerter PJ, Illes P. Bólgueyðandi áreiti framkalla nýjan K plús ytra straum í ræktuðum rottum microglia. Neurosci Lett. 1992;147 (2):171–174.

[15] Kotecha SA, Schlichter LC. Kv1.5 til Kv1.3 skipti í innrænum hippocampal microglia og hlutverk í útbreiðslu. J Neurosci. 1999;19(24):10680–10693. [16] Fordyce CB, Jagasia R, Zhu X, o.fl. Microglia Kv1.3 rásir stuðla að getu þeirra til að drepa taugafrumur. J Neurosci. 2005;25(31):7139–7149.

[17] Nguyen HM, Grossinger EM, Horiuchi M, et al. Mismunandi Kv1.3, KCa3.1, og Kir2.1 tjáning í „klassískt“ og „að öðrum kosti“ virkjaðri örveru. Glia. 2017;65(1):106–121.

For more information:1950477648nn@gmail.com