Samþætt Omics-greining afhjúpar ör-æðabólgutengdar leiðir í nýrna-ígræðsluvefjasýni
Mar 24, 2022
Í líffæraígræðslu á föstu formi hafa míkróRNA (miRNA) komið fram sem lykilaðilar í stjórnun á starfsemi ósamgena frumu sem bregðast við meiðslum. Til að öðlast innsýn í hlutverk miRNAs í mótefnamiðlaðri höfnun, höfnunarsvipgerð sem er vefjafræðilega skilgreind af smáæðabólgu,nýru ósamgena vefjasýni voru gefin fyrir miRNA en einnig boðbera RNA (mRNA) prófílgreiningu. Með því að nota einstakt fjölþrepa valferli sem er sérstakt fyrir BIOMARGIN rannsóknina (uppgötvunarhópur, N=86;valhópur, N=99; staðfestingarhópur, N=298), sex mismunagreind miRNA voru greind:miR-139-5p (niður) og miR-142-3p/150-5p/155-5p/{ {7}}p/223-3p (upp). Tjáningarstig þeirra hafði smám saman fylgni við styrkleika öreindabólgu. Frumusérhæfni miRNA markgena var rannsökuð með því að samþætta in vivo mRNA markmið þeirra við einfrumu RNA raðgreiningu frá óháðum óháðum vefjasýnishópi. Tjáning miR-139-5p úr æðaþelsi hafði neikvæða fylgni við tjáningu gena sem tengjast MHC. Aftur á móti var oftjáning miR-222-3p úr þekjuvef sterklega tengd við niðurbrotið blóðsaltajafnvægi í nýrum og bældar ónæmistengdar leiðir. Í ónæmisfrumum stýrði miR-150-5p NF-kB virkjun í T eitilfrumum á meðan miR-155-5p stjórnaði mRNA-skerðingu í frumum sem sýna mótefnavaka. Á heildina litið gerðu samþættar umics okkur kleift að afhjúpa nýjar leiðir sem taka þátt í smáæðabólgu og benda til þess að breytingar á efnaskiptum í pípulaga þekjufrumum eigi sér stað sem afleiðing af mótefnamiðlaðri höfnun, fyrir utan nærliggjandi æðaþelshólf.
Leitarorð:nýrnaígræðsla, microRNA, multi-omics, smáæðabólga, mótefnamiðluð höfnun
CISTANCHE mun bæta nýrna-/nýrnasjúkdóm
KYNNINGÍnýrnaígræðsla(KT), ónæmisskaða er venjulega skipt í tvenns konar höfnun ónæmisgræðslu í samræmi við staðbundna dreifingu ónæmisíferðar og upplýsingar um tilvist eða fjarveru gjafasértækra and-HLA mótefna. Greiningin byggir á vefjasýni úr vefjagræðslu með flokkun vefjaskemmda samkvæmt Banff International Consensus flokkun(1). Tubulitis ("t" meinsemd) og millivefsbólga ("I" meinsemd) eru aðal vefjafræðileg einkenni T-frumumiðlaðrar höfnunar (TCMR) og tengjast beinni frumueiturhrifum á milli tubulointerstitial hólfið. Mótefnamiðluð höfnun (ABMR) tengist oftast and-HLA mótefnum í blóðrás með bólgu sem miðar að smáæðahólfinu. Virkar ABMR vefjaskemmdir fela í sér nærveru einkjarna frumna í gauklaháræðum ("g"skemmdum) og í peritubular capillaries ("ptc" skemmdum), samanlagt nefnt "microvascular inflammation" (MVI). Í langvarandi virkum ABMR bæta langvinnir vefjaskaðar eins og ígræðslu glomerulopathy eða arterial intimal fibrosis þessar bráðu skemmdir (1). Með því að nota núverandi T'-frumu-miðaða ónæmisbælandi lyf, er TCMR talið hafa takmörkuð forspáráhrif, en ABMR er aðalorsök græðlingabilunar, sem tengist skorti á árangursríkum meðferðaraðferðum (2).
Til þess að finna betri meðferðir fyrir MVI og ABMR er þörf á betri innsýn í líffræðilegu ferli sem liggur að baki þessum áverkaferlum. Umics tækni með mikilli afköst virðist vera hentugur fyrir tilganginn þar sem hún gerir nákvæma og samtímis skimun á þúsundum gena, próteina og umbrotsefna(3). Heilt transcriptome yfirheyrslu ánýruósamgena vefjasýni hafa sýnt fram á djúpstæðar breytingar á mRNA genatjáningu í særðum frumum eða í frumustofnum sem síast inn í ABMR(4). Á sama tíma hafa míkróRNA (miRNA) komið fram sem lykilaðilar í umbrotum frumna, með því að stjórna boðbera RNA (mRNA) á stigi eftir umritun. Reyndar gjörbreyttu miRNA skilningi okkar á fínstillingu lífeðlisfræðilegra ferla líkamans sem taka þátt í útbreiðslu, frumudauða, aðgreiningu og þroska(5). Það kemur ekki á óvart að óregluleg tjáning miRNA leiðir til þróunar margra meinafræði, þar á meðalnýrnasjúkdómur(6). Þar sem tjáningarsnið miRNA er mismunandi á milli sjúkra og heilbrigðra ríkja, hafa margar rannsóknir greint miRNA annaðhvort eitt sér eða ásamt öðrum hefðbundnari merkjum, ekki aðeins til að greina sjúkdóm og spá fyrir um framvindu sjúkdóms heldur einnig til að hanna hugsanlega lækningafræðilega notkun (7).
Í samhengi við líffæraígræðslu á föstu formi geta miRNAs tekið þátt í höfnun með hlutverki sínu í stjórnun á starfsemi ónæmisfrumna og í viðbrögðum óviðskipta frumna við áverka (6,8). Nokkrar rannsóknir hafa rannsakað allograft miRNA sem lífmerki og/eða áhrifavalda í stillingum TCMR (8,9), en engin hefur hingað til einbeitt sér að MVI og ABMR. Í þessari rannsókn var stefnt að því að samþætta mismunandi omics stig fránýruósamþykkt vefjasýni, til að fá innsýn í hlutverk miRNAs í þessari skaðlegu höfnunarsvipgerð.
EFNI OG AÐFERÐIR Hönnun námsÞessi rannsókn er hluti af FP7-fjármögnuðum BIOMArkers ofNýruRannsóknaráætlun um graft Injuries (BIOMARGIN, https://cordis.europa. eu/project/id/305499, ClinicalTrials.goy, númer NCT02832661), undir forystu evrópsks rannsóknarsamtaks í leit að lífmerkjum ónæmisskemmda í ónæmisgræðslu ínýrnaígræðslaviðtakendur, með greiningar- og/eða forspárgildi. BIOMARGIN er fjölsetra, framsýn, fjölfasa rannsókn, gerð á fjórumnýrnaígræðslamiðstöðvar í Evrópu (Necker sjúkrahúsið, París, Frakklandi; háskólasjúkrahús, Leuven, Belgíu; læknaskólinn í Hannover, Hannover, Þýskalandi; og háskólasjúkrahúsið, Limoges, Frakklandi). Sýnum var safnað framvirkt við skimun og vísbendingasýni á tímabilinu apríl 2013 til júní 2015 (mynd IA). Allar ígræðslur voru gerðar með neikvæðum samsvörun sem var háð frumueiturhrifum. Á þessum fjórum klínísku stöðvum voru vefjasýni framkvæmdar 3,12 og stundum 24 mánuðum eftir ígræðslu, samkvæmt venju á staðnum, auk ábendingalífsýna. Endurskoðunarnefnd stofnana á hverjum stað samþykkti rannsóknina og allir sjúklingar veittu skriflegt upplýst samþykki.
NámsárgangarRannsókninni var skipt í þrjá áfanga (Mynd 1A). Í fyrsta áfanga-viðmiðunaruppgötvunarfasa voru N=88 vefjasýnissýni notuð fyrir alþjóðlega miRNA tjáningargreiningu (N=754 miRNA, að undanskildum mögulegum eðlilegum miRNA) . Við völdum sýni á grundvelli framboðs og vefjafræðilegra viðmiðana (að undanskildum tilfellum með greiningu á glomerulonephritis eða fjölómaveiru-tengdum nýrnakvilla og tilfellum með óljósa greiningu). Á grundvelli staðbundinna vefjasýnislestra var fyrsta valið, sem var betrumbætt frekar með miðlægum lestri af hópi meinafræðinga, óháð upprunalegu stöðinni. Tölfræðileg greining (sjá miRNA val) var notuð til að velja útbreiddan lista yfir miRNA, sem eru mest mismunandi á milli vefjafræðilegra svipgerða, sem síðan voru magngreind í 2. áfanga.
Svipuð tilviksviðmiðunarrannsóknarhönnun var notuð fyrir annan (val) áfanga, þar sem markviss miRNA tjáningargreining (N=143) var gerð á N=99 vefjasýni. Sama tölfræðileiðsla var beitt til að velja enn takmarkaðri lista yfir miRNA, sem síðan var magngreind í 3. áfanga. Að lokum, í þriðja (fullgildingar) hópnum, var öllum sýnum safnað framvirkt og í röð samkvæmt BIOMARGIN siðareglum á milli 24. júní 2014 og 2. júlí 2015, og með fullnægjandinýrugæði ósamgena vefjasýnis, voru metin fyrir 38 miRNA sem valin voru sem afleiðing af öðrum valfasa. Í þessum raunveruleikahópi var ekkert val gert út frá vefjafræði, lýðfræði, tíma eða öðrum þáttum en aðgengi að sýnum og gæðaeftirlitsviðmiðum (nægjandi vefjasýni og RNA ávöxtun).
miRNA valÖflug tölfræðileiðsla var sérstaklega þróuð fyrir BIOMARGIN rannsóknina í R(R Core Team(10), útgáfu 1.0.44), sem framlenging á biosignal R pakkanum(1l). Í stuttu máli, í uppgötvunarfasanum, framkvæmdum við aðgerðavalstefnu, þar á meðal ein- og fjölbreytuaðferðir. Fyrir einbreytilegt val notuðum við próf sem ekki er parametrisk (Wilcoxon-Mann-Whitney próf) og parametrisk próf (T-próf nemenda) og Discovery árgang (BIOS-03-0023, BIOS-06-0238). Spáskor fyrir hverja afrit af miRNA í hverju fjölbreytu líkani voru samþætt til að gefa „fjölþátta skor“. Með því að sameina niðurstöður þessara einþátta og fjölþátta greininga gátum við raðað og valið undirmengi miRNA umsækjenda til að vera hluti af auknum lista sem á að mæla í næsta áfanga.Fyrir þessa posthoc greiningu með áherslu á VMI ferla, var miðgildi staðlaðrar tjáningar hvers miRNA borið saman milli tilvika og viðmiða með því að nota Wilcoxon prófið í öllum þremur hópunum. Við stjórnuðum fyrir mörgum prófunum með því að nota Benjamini & Hochberg falskan uppgötvunarhraða (FDR) aðferðina.
Klínískt meinafræðilegt matEinstaklingsstig vefjaskemmda var metið hálf-megindlega samkvæmt Banff 2019 viðmiðunum(16). Hugtakið „öræðabólga“ (MVI) var notað til að vísa til hvers kyns samsetningar gauklabólgu (g) og/eða peritubular capillaritis (ptc). Öll ABMR tilfelli uppfylltu fyrstu 2 skilyrðin í Banf 2015 eða Banff 2017 flokkuninni (vefjafræðilega vísbendingar um bráðan vefjaskaða og vísbendingar um núverandi/nýlega mótefnasamskipti við æðaþekju), en ekki uppfylltu allar þriðju viðmiðunina [sérfræðilegar vísbendingar um gjafasértæk mótefni (DSA) og/eða CAd-litun]. DSAs eftir ígræðslu voru ákvörðuð samkvæmt staðbundnum stöðvum, með DSA jákvæðni skilgreind sem greinanleg gjafasértæk and-HLA mótefni í sermi með meðalgildi flúrljómunarstyrks (MFI) 500 við vefjasýni eða einhvern tíma áður.
RNA útdráttur úr lífsýnissýnum fyrir mRNA og miRNA prófílgreininguTveggja nála kjarna voru teknir við hvernnýruvefjasýni úr ósamgena. Önnur var notuð til hefðbundinnar vefjafræðilegrar flokkunar og að minnsta kosti helmingur hins var strax geymdur í Allprotect Tissue Reagent (Qiagen Benelux BV, Venlo, Hollandi). Allprotect glösin voru geymd við 4C (lágmark 24 klst. að hámarki 72 klst.) , og síðan geymt við -20 gráðu gráðu þar til RNA útdráttur. Heildar-RNA var einangrað úrnýruósamgengd vefjasýnissýni með Allprep DNA/RNA/miRNA Universal Kit (Qiagen Benelux BV) á QIAcube tæki (Qiagen Benelux BV). Magn (gleypni við 26{{20}} nm) og hreinleiki (hlutfall gleypni við 230.260 og 280 nm) einangraðs RNA var mælt með NanoDrop ND-1000 litrófsmælinum (Thermo) Fisher Scientific/Life Technologies Europe BV, Gent, Belgíu). RNA heilleikanúmer (RIN) var metið með Eukaryote nano/pico RNA Kit (Agilent Technologies Belgium NV, Diegem, Belgíu) á Bioanalyzer 2100 tækinu (Agilent Technologies BelgiumNV). Gæðastýringarvísitölur voru ekki marktækur mismunandi milli VMI og No. MVIgroups [RIN(meðal±SD):5,6±1,96 á móti 5,4±1,97,P=0.66;260/280 hlutfall (meðaltal±SD):1,87±0,06 á móti 1,87±0,1l,P{{26 }}.40]. Fyrir RNA sýni með lágt RIN(<6.5), we="" excluded="" samples="" with="" a="" 260/280=""><1.6. the="" extracted="" rna="" was="" subsequently="" split="" and="" stored="" at="" -80℃℃.half="" of="" the="" rna="" extract="" was="" used="" for="" mirna="" profiling="" and="" the="" other="" half="" for="" mrna="" transcriptomic="" analysis.="" the="" associated="" data="" are="" available="" from="" the="" gene="" expression="">
CISTANCHE MUN BÆTA NÝRA/NÝRASKILUN
miRNA prófílgreiningSpecific reverse transcription of 150ngof total RNA was performed using Megaplex"RT Primers Human Pool A v2.1(Step 1)or Custom RT Primers Human Pool (Step 2 and 3)(Thermo Fisher Scientific, Les Ulis, France), on a Veriti Thermal Cycler (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific). No complementary(c)DNA preamplification was required. miRNA expression was assessed by qPCR, using TaqManArray Cards (Applied Biosystems", Thermo Fisher Scientific), where the primers and probe of each miRNA were spottedanddried in duplicate wells of a microfluidic card. We used TaqMan"Array Human MicroRNA A +B Card Sets v3.0 for the discovery cohort(a two-card set enabling quantitation of 754 unselected human miRNAs)and Custom TaqManArray MicroRNA Cards for the selection and validation cohorts. Data analysis was performed by using Expression Suite software version 1.0.3. Assays with a cycle threshold(CT) values >35 voru taldir ekki tjáðir. RNU44 og RNU48 sýndu samræmda tjáningu í öllum sýnunum að meðaltali (RNU44 plús RNU48) breytileikastuðull var 3,73 prósent í fylkiskorti A og 3,79 prósent á fylkiskorti B] og voru notuð sem heimilisgen fyrir staðlað gagna í öllum undirrannsóknum.
mRNA umritunargreiningTranscriptomic greining var framkvæmd með microarray eins og þegar hefur verið lýst (17). Í stuttu máli, heildar-RNA sem dregið var úr vefjasýnissýnunum var fyrst magnað og lífrænt í viðbót RNA(cRNA) með því að nota GeneChip 39 IVT PLUS hvarfefnissettið (Affymetrix) og blandað við Affymetrix GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 fylki( Affymetrix), sem samanstóð af 54.675 rannsakasettum sem ná yfir allt erfðamengið. Við notuðum Robust Multichip Average (RMA) normalization. Miðgildi staðlaðrar tjáningar hvers mRNA var borið saman milli tilvika og viðmiðunar með Wilcoxon prófinu. Við stjórnuðum verðbólgu á alfa áhættu vegna margra prófana með því að beita Benjamini & Hochberg aðferðinni við falskan uppgötvun (FDR). Meðhöndlað var með örfylkisgögnin í samræmi við leiðbeiningar um lágmarksupplýsingar um örfylkitilraunir.
Í Silico AnalysesLíffræðileg túlkun Multiomics EXperiments(BIOMEX) hugbúnaðar var notaður fyrir mismunagreiningu á umrituðum gögnum með því að nota Ensembl ID skýringu(18). Hugvitsbrautargreining (IPA, smíði: 478438M Efnisútgáfa: 44691306, Qiagen) og OMICSnet(19) voru notuð til að ákvarða genasettið sem stjórnað er af völdum miRNA. OMICSnet var notað til að framkvæma Gene Ontology greiningu með Reactome ferla gagnagrunninum, með því að nota heildarferlið (20). Uppbygging genakerfa var algjörlega án eftirlits og byggðist á fjölda tilkynntra sameindasamskipta hvers einasta gena við öll önnur gen í netinu. Gen sem sýndu mestan fjölda víxlverkana voru sjálfkrafa staðsett í miðju netsins, en genin með lægri fjölda víxlverkana dreifðust út í jaðar. Frumuppruni valinna miRNAs var rannsakaður með Fantom5 verkefninu(21), sem veitir greiningu á genatjáningu í frumum og vefjum manna. Fyrir miRNA tjáningargreiningu töldum við öllnýru-tengdar byggingarfrumur og allar blóðmyndandi frumur í blóðrás, án frekari vals.
Einfrumu RNA raðgreiningargagnagreiningNotuð voru áður birtar einfrumu RNA raðgreiningar (siRNA-seq) gögn úr mönnum úr tveimur ABMR vefjasýnum og fjórum heilbrigðum tilvísunum sem samsvara ígræðsluvöktunarsýnum. Tilheyrandi hrátölum eða fylkjum var hlaðið niður í sömu röð frá GEO(GSE145927, https://www.ncbi.nlm. nihgov/geo)(22)ogNýraPrecision Medicine Project (KPMP, https://atlas.kpmp.org/repository). Hrá genatjáningarfylki sem mynduð var fyrir hvert sýni var sameinuð og greind með Seurat V4 pakkanum (23). Færibreyturnar sem notaðar voru til að búa til og sía Seurat-hluti voru eftirfarandi: frumur sem tjáðu á milli 500 og 10.000 greind gen og minna en 25 prósent hvatberaafrit. Eftir síun voru allir hlutir samþættir með því að nota SCTransform samþættingarvinnuflæði á Seurat (24). Í stuttu máli voru 3000 eiginleikar notaðir til samþættingar með því að nota PrepSCTIntegration aðgerðina og FindIntegrationAnchors aðgerðin var notuð til að takmarka lotuáhrif. Fullt UMAP gagnasett (Uniform Manifold Approximation and Projection) var búið til með því að nota DimPlot aðgerðina og 16 efstu meginhlutana. Klasar voru smíðaðir með því að nota FindNeighbors og FindClusters aðgerðirnar með 0,6 upplausn. Auðkenning á klasa var framkvæmd með FeaturePlot aðgerðinni með því að meta tjáningu sérstakra merkja í hverjum klasa. Punktaplott var búið til með því að nota DotPlot og FeaturePlot plottunaraðgerðirnar, með staðlaða fjölda í RNA prófinu sem inntaksgögn.
CISTANCHE MUN BÆTA NÝRA/NYRA SÝKNING
TölfræðigreiningEiginleikum sjúklings og gjafa var lýst með tölum, prósentum og tíðni fyrir flokkabreytur. Við greindum frá samfelldum breytum með því að nota meðaltal og staðalfrávik (SD) ef normaldreifð er, miðgildi og millifjórðungssvið (IQR) fyrir breytur með skekkta dreifingu. Við bárum saman eiginleika þeirra með því að nota Fisher eða Wilcoxon prófið þegar við á. Við notuðum Kruskal-Wallis prófið til að bera saman miðgildi miRNA tjáningar samkvæmt MVI styrkleika, og Spearman prófið til fylgnigreiningar. Við töldum tölfræðilega marktækni fyrir P-gildi minni en 0.05. Við notuðum GraphPad Prism (útgáfa 8; GraphPad Software, San Diego, CA) og RStudio (útgáfa 4.0.3) fyrir tölfræðilega greiningu og framsetningu gagna. Eftirfarandi R-pakkar voru notaðir: hitakort3 (hitakort3_1.1.9) fyrir hitakortagreiningar, fmsb(fmsb_0.7.0) og mælikvarðar (kvarðar_1.1.1)pakkar fyrir ratsjárrit, ggplot2 (ggplot2_3.3.5) fyrir súlurit og complot(corrplot_0.90) fyrir fylgnifylkisgreiningu.
NIÐURSTÖÐUR
Fjölþrepa auðkenning á MVI-tengdum miRNABetween April 2013 and July 2015,646 patients enrolled in the BIOMARGIN study provided 716 indication or surveillance biopsies. Inadequate biopsies (N=49), biopsies with no paired sample for research use(N=135)or samples not passing molecular biology QC(N=49) were excluded, leaving 483 samples from 441 individuals available for this study (Figure 1A). Baseline and clinical characteristics of the study groups are provided in Supplementary Tables S1-3, and the histological characteristics of the biopsies are provided in Supplementary Tables S4-6. In the discovery cohort, a total of 27 patients met the MVI composite endpoint(MVI+), defined as clinical ABMR diagnosis and/or any level of MVI(g and/or ptc>0). Hinir 59 sjúklingarnir (MVI-) sýndu ýmsar greiningar sem samanstanda af T-frumumiðlaðri höfnun (TCMR, N=8), millivefs bandvefsvefja og píplurýrnun (IFIA,N=20), og eðlilegar vefjasýni (N{{6} }}),en engin MVI.Frá 754 miRNA umsækjendum voru 18 miRNA tjáð á mismunandi hátt milli MVI plús og MVI- hópa (Mynd 1B). Í valhópnum var takmarkaður listi með 143 miRNAs magngreindur í 99 sýnum. Í þessum valhópi voru 14 miRNA sýnd á mismunandi hátt á milli tilvika með (N=28) og án (N=71)ABMR(Mynd 1C). Að lokum, í stærsta þverskurðarhópnum, voru 38 miRNAs magngreind í 298 sýnum, þar af voru 12 miRNAs tjáð mismunað á milli ABMR(N=29) á móti engum ABMR (N=269) vefjasýnum (mynd 1D) ).
Samræmd auðkenning á 6 MVI-tengdum MiRNA og fylgni við vefjafræðiNæst skoruðum við 3 lista yfir mismunað tjáningu miRNAs og auðkenndum 6 miRNA sem voru stöðugt tengd MVI eða ABMR í 3 óháðu árgangunum (Mynd 2A).miR-142-3p,miR-150-5p,miR -155-5p, miR-222-3p og miR-223-3p voru oftjáð í MVI/ABMR, en miR-139-5p tjáning minnkaði. Ratsjáruppdrættir (Mynd 2B) sýna fyrir hvert skref mismunatjáninguna á milli tilviks og stýringa á 6 miRNA og styðja styrkleika miRNA sniðanna í þremur sjálfstæðum hópum. Næst rannsökuðum við hvernig 6 miRNA tjáningin tengist einstökum vefjaskemmdum í öllum 483 ósamgena vefjasýnunum teknar saman. Tjáning 5 uppstýrðu miRNAs jókst smám saman með MVI sárum styrkleika, en tjáning miR-139-5p var í neikvæðri fylgni (Mynd 2C).MiR-139-5p/142-3p/ 150-5p/155-5p/223-3p tengdust ekki aðeins ABMR-tengdum eiginleikum (g, ptc, C4d útfellingu), heldur einnig TCMR-tengdum skemmdum (i, t ) og IFTA skemmdir (ct, ci), sem benda til þátttöku þeirra í algengum, ósértækum, bólgu- og örmyndunarferlum. Að öðrum kosti gæti einhver eðlislæg samlína verið á milli meinanna, sem leiðir til þess að við getum ekki greint raunverulega sérstöðu fyrir eina meinsemd. MiR-222-3p tengdist ekki vefjaskemmdum TCMR eða IFTA (mynd 2D).
Multi-Omics samþætting: mRNA-miRNA samspil í MVNæst, metum við mismunandi tjáningu gena á milli MVI plús og MVI-tilfella, í áður birtu uppgötvunarsetti (25). Af 54.675 rannsaka, voru alls 2755 mismunandi tjáð gen (DEGs) auðkennd milli MVI plús og MVI-
hópa, sem samanstanda af 1085 niðurstýrðum og 1670 uppstýrðum genum (Mynd 3A). Mismunandi tjáð mRNA í MVI plús sýnum voru CXCL9 og CXCL10, í samræmi við fyrri skýrslur(17,26) um að þessi gen séu mest oftjáð í ABMR. Næst notuðum við IPA og OMICSnet til að bera kennsl á í silico hugsanlegu markgenin fyrir hvert miRNA. Alls var spáð að 4504 mRNAs yrðu miðuð af að minnsta kosti einu af 6 miRNA. Síðan samþættum við þessi 4504 spáðu markmið við DEG í ósamgengdu vefjasýni. Samþætt miRNA/mRNA greining benti á 61 DEG sem miR-139-5p miðar á sem voru marktæk aukning í MVI plús vefjasýni. Það greindi einnig að 28, 58, 52, 43 og 27 gráður minnkuðu marktækt í MVI plús vefjasýni sem voru miðuð af miR-142-3p, miR-150-5p, miR-155-5p, miR{ {22}}p,og miR-223-3p (Mynd 3B).
Frumuuppruni MV-tengdra miRNAFrumuuppruni miRNAnna sex einkenndist í ýmsumnýrufrumu- og blóðmyndandi frumuundirgerðir með því að nota miRNA atlas á netinu [Fantom gagnagrunnur (27)]. Óeftirlitslaus þyrping mismunuðnýrufrumuafleidd miRNAs frá ónæmisfrumuafleiddum miRNAs (mynd 4A). Það leiddi einnig í ljós eina eða tvær ríkjandi frumugerðir fyrir hvert miRNA. MiR-139-5p virtist aðallega tjáð af gauklaæðaþelsfrumum (EC). MiR-222-3p, þó tjáning þess hafi ekki verið í tengslum við pípubólgu (Banff lesions"t", mynd 2D), tengdist fyrst og fremstnýruþekjufrumur. Fjögur miRNA sem eftir voru voru fyrst og fremst tjáð í einkjarnafrumum í útlægum blóði (PBMC) eða kyrningafrumum, með miR-142-3p auðgað í NK frumum og mónocytum, miR-150-5p í CD4 plús og CD8 plús T frumum,miR -155-5p í CD19 plús B frumum og átfrumum,andmiR-223-3p í daufkyrningum.
Einfrumu RNA raðgreining greindi allar nýrnafrumur og íferðarónæmisfrumur Til að lýsa hugsanlegu hlutverki hvers MVI-tengdra miRNAs, greindum við opinberlega aðgengileg sc-RNAseq gögn frá tveimurnýruóbyggða vefjasýni með ABMR og háum MVI stigum (g2, ptc3)(22). Þessi gagnasöfn voru samþætt með 4 heilbrigðum tilvísunarvefsýnum án MVI. Eftir gæðaeftirlit og síun greindust 31545 frumur og þyrping án eftirlits leiddi í ljós 12 klasa (Mynd 4B). Við notuðum rótgróin merki (28) til að bera kennsl á allar helstu undirgerðir frumna og íferðarfrumu og merkja þær (viðbótarmynd S2). Næst einbeittum við okkur að frumustofnum sem talið var að sex miRNAs okkar ættu uppruna sinn í. Í þessu markmiði, lagskiptum við frumurnar í 4 helstu klasa sem samsvara æðaþekju, þekju, eitilfrumum og APC (mynd 4C). Í samræmi við fyrri greiningu á þessum gögnum (22), greindust hvorki daufkyrninga- né NK frumur í sc-RNASeg gagnapakkanum.
miR-139-5p stjórnar EC-virkjun og mótefnavaka-kynningarferli meðan á MVI stendurMiR-139-5p var eina niðurstýrða miRNA-efnið í rannsókn okkar í tilfellum með MVI/ABMR (Mynd 2A) og reyndist vera aðallega upprunnin frá gaukla EC (Mynd 4A). Staðfest var að sextíu og eitt af markgenum þess væri uppstýrt í lausu örfylki frá MVI plús tilfellum (Mynd 3B) og tjáning þeirra var frekar rannsökuð við einfrumuupplausn í 3 áður auðkenndum EC undirþyrpingum (Mynd 4B, C). Eins og sýnt er á mynd 5A var virkjaður ECcluster aðeins greinanleg í MVI plús sýnum. Að auki var helmingur af 61 genum (N=30) stöðugt aukinn í sc-RNAseq MVI plús vefjasýni, óháð þremur EC undirþyrpingum. Meðal þeirra var GBP5 hæsta genið. Næst, genaverufræðigreining með þessum 30 æðaþelsafleiddu afritum auðkenndu UBE2D1 og YWHAG sem miðlæga leikmenn í genakerfinu (Mynd 5B). Nánar tiltekið voru ónæmistengdar leiðir og helstu vefjasamhæfisfléttu (MHC)-miðluð mótefnavakavinnsla og framsetningarleiðir auðgaðir (Mynd 5C). Gervitímagreining var gerð til að einkenna breytingar á genatjáningu betur á meðan á EC virkjun stóð. Ferill yfir frumur ástand (myndir 5D,E), UBE2D1, YWHAG og GBP5 jókst stöðugt við MVI tengda æðaþelsvirkjun. Mjög svipaðar ferlar fundust fyrir MHC tengd gena HLA-A,-B og -DRA en einnig fyrir bónafide æðaþelsvirkjun og bólgumerki eins og VCAM1, CXCL9 og CXCL10, sem bendir til þess að öll þessi gen séu tjáð samtímis við virkjun æðaþels. Alls benda þessar niðurstöður til þess að miR-139-5p minnki við MV sár og bæli ekki lengur niður MHC mótefnavaka kynningarferilinn í virkjaðri EC.
miR-222-3p skerðir bæðiNýruLífeðlisfræðilegar og ónæmistengdar leiðir í þekjufrumum meðan á MVI stóð. Næst lögðum við áherslu á miR-222-3p, uppstýrt miRNA í MVI sýnum meðnýruuppruni þekjufrumna og sértækari fylgni við vefjaskemmdir sem tengjast ABMR (Mynd 2A, D,4A). Í ósamgena ígræðsluvef var tjáning 43 af markgenum þess minnkað (Mynd 3B) og metin frekar við einn- frumuupplausn í mismunandinýruþekjuþekjuhópar sem við greindum áður (myndir 4B, C). Stórfelld fækkun um 41 af þessum 43 (95 prósent) genum í öllum greindumnýruþekjufrumuþyrpingar benda til genaþagnar
prófíl í VMI (Mynd 6A). Athyglisvert er að 4 gen taka þátt ínýrulífeðlisfræðilegar leiðir (ERBB4, ATPIB1, TIMM50 og KIF3B), en einnig ónæmistengd gen (TRAPI og PEBPI) voru auðkennd sem miðgen í netinu (Mynd 6B). Genaverufræði 43genanna leiddi í ljós auðgun í ErbB boðleiðum en einnig í ónæmistengdum ferlum og frumuefnasvörun (Mynd 6C) og ERBB4 tjáning var enn staðfest í öllumnýrufrumur (Mynd 6D). Á heildina litið benda þessar niðurstöður til þess að á meðan á VMI stendur, sé hátt stigi -222-3p innýruþekjufrumur tengjast sterkri bælingu gena sem taka þátt í bæðinýruraflausnarjafnvægisleiðir og ónæmistengdar leiðir í þekjuvef.
miR-150-5p stjórnar NF-kB virkjun í T-eitilfrumum meðan á MVI stendur. Á sama hátt könnuðum við stjórnunarhlutverk (aukins) miR-150-5p við MVI í T-frumuþyrpingunni, þar sem það kom mest fram (Mynd 4A). Við teiknuðum 58 minnkuðu MVI-tengda DEG sem auðkennd voru í lausu ósamgena vefjasýni (Mynd 3B) og við horfðum á það við genatjáningu í sc-RNAseq T-frumuþyrpingunni (Mynd 7A). Hlutfall gena sem bæði miR150-5p beitti sér fyrir og sem voru sérstaklega vantjáð í T-frumum við MVI var furðu lágt (15/58,25,9 prósent) sem bendir til þess að alþjóðleg fækkun þessara gena in vivo hafi ekki eingöngu verið vegna T eitilfrumuhólf. Engu að síður, af þessum mjög völdum lista yfir 15 gena og með því að nota OMICSnet vettvanginn, bjuggum við til genanet (Mynd 7B) og framkvæmdum genagreiningu (Mynd 7C). Við sáum að miR-150-5p oftjáning tengdist NF -KB stjórnun í T eitilfrumum meðan á MVI stendur.
miR-155-5p stjórnar mRNA-skerðingu í APC meðan á MV stendur Að lokum var nákvæmlega sömu aðferð beitt fyrir 52miR-155-5p-markgenin, sem voru vantjáð við MVI (Mynd 3B). Öfugt við miR-150-5p í T eitilfrumum, sáum við að næstum tveir þriðju hlutar af miR-155-5p miðuðum genum var stöðugt fækkað í APC sc-RNAseq þyrpingunni (31/52,59,6 prósent, mynd 8A). Genanetgreining leiddi í ljós að AIFMI og CIAO1 voru miðgen (Mynd 8B). Þar að auki leiddi genaverufræði í ljós sterka auðgun á ferlum sem tengjast mRNA-skeðingu (Mynd 8C).
UMRÆÐAMeð einstakri hönnun sinni er BIOMARGIN rannsóknin dæmigerður rammi fyrir samþættingu gagna með mörgum umómum. Reyndar voru mjög öflugar leiðslur notaðar í bæði uppgötvunar-, val- og staðfestingarhópum sem ná yfir mikinn fjölda sjúklinga frá mismunandi ígræðslumiðstöðvum. Í óháðu hópunum þremur horfðum við samtímis á og staðfestum einkennilegt tjáningarsnið 6 miRNAs meðan á MVI stóð: miR-139-5p minnkaði en miR-142-3p/150-5p/{{5} }p/222-3p og miR-223-3p voru hækkuð. Mikilvægt er að magn hvers þessara 6 miRNAs var í tengslum við alvarleika MVI, sem bendir til skammtaháðs stjórnunarkerfis. Næst notuðum við í kísilpöllum til að rannsaka hvern miRNA frumuuppruna. Það er athyglisvert að tveir aðskildir hópar miRNAs sáust: sá fyrsti úr ónæmisfrumum sem síast inn og hinn sértækari fyrir íbúanýrufrumur. Síðan voru bæði miRNA og mRNA mæld í sama uppgötvunarsetti vefjasýnissýna, sem gerir kleift að greina samþætta greiningu á in vivo staðfestum mismunatjáðum mRNA/miRNA sem tengjast MVI. Að lokum, eftir að hafa lýst mRNA/miRNA tengslum við lausn vefja, staðfestum við samspil mRNA/miRNA við einfrumuupplausn fyrir fjögur af 6 auðgreindum miRNA.
Athyglisvert er að miR-139-5p var eina miRNA sem hafði neikvæða fylgni við MVI sár. Það er aðallega upprunnið frá EB og hefur verið greint frá því að það stjórnar MHC-tengdum genum. Meðal markgena þess var UBE2D1 mjög uppstýrt við virkjun æðaþels í tengslum við MVI. UBE2D fjölskyldan er E2 ubiquitin-samtengingarensímfjölskylda í ubiquitin-proteasome kerfinu(29, 30) og sýnt var að UBeD1 eykur mars-I ubiquitination, sem leiðir til uppstjórnunar MHC flokks II próteina(31). Að auki var GBP5 það genaóvirkjaða EC sem var mest táknað á meðan á MVI stóð, sem er í samræmi við nýlegar skýrslur okkar sem sýna að GBP5 er mjög uppstýrt í ABMR vefjasýni(17) en einnig í blóðsýnum(32). Athyglisvert var sýnt fram á að GBP5 tjáning var framkallanleg með interferóni af tegund II í æðaþelsfrumum í legi manna ásamt CXCL9 og CXCL10(33). Snemma hlutverk þessara tveggja bólgueyðandi krabbameinslyfja í bráðum höfnunarferlum er vel skjalfest og er lagt til að magn þeirra í þvagi sé fylgst með bráðri höfnunarhættu við hefðbundið eftirlit með nýrnaþegum (34). Annað miR-139-5p-markmið er YWHAG.YWHAG kóðar fyrir próteinfjölskyldu HLA-F og hefur verið lýst sem mismunandi tjáningu meðan á virku profibrotic ferli í sykursýki nýrnakvilla stendur (35). Hugsanlegt hlutverk miR-139-5p í bandvefsmyndun, sem er síðasta algeng leið eftir bólgu, er þeim mun mikilvægara að IFTA hefur nýlega verið innifalið í samsettu skori til að spá fyrir um lifun nýrnaígræðslu eftir ABMR(36). Alls benda þessar niðurstöður til þess að miR-139-5p bæli ekki lengur tjáningu MCH mótefnavaka á yfirborði Anethum meðan á MVI stendur og eigi að taka þátt í efnahvarfa- og bandvefsferli, en þessi aðferð á eftir að vera staðfest með tilraunum á tjáningu á æðaþeli meðan á MVI stendur og gæti tekið þátt í chemoattraction og fifibrosis ferlum, en eftir er að staðfesta þessar aðferðir með tilraunum.
Sekúndannýru-afleitt miRNA sem við greindum er miR-222- 3p, en tjáningin reyndist vera sértækari fyrir MVI sár: það tengist g og PTC stigum sem og C4d útfellingu, en ekki við i eða t sár. Hins vegar er það aðallega upprunnið úr þekjufrumum. Eftir multi-omic samþættingu við frumuupplausn, komumst við að því að miR-222-3p bæli aðallega ErbB boð sem er mikilvægt fyrir grundvallar frumustarfsemi, svo sem útbreiðslu, fólksflutninga, vöxt og aðgreiningu (37). Í líffræði mannsins er þörf á lífeðlisfræðilegum ErbB merkjumnýrublóðsaltajafnvægi og viðhald nýrnaheilleika (38). Niðurstöður okkar auðkenndu einnig ADAM22, NRG1, ZNF91 sem ErbB-merkjatengd gen sem eru sérstaklega bæld í þekjuvef við MVI. Önnur gen nauðsynleg fyrir lífeðlisfræði nýrna eins og ATP1B1 og KIF3B voru einnig bæld niður í nýrnaþekju með miR-222-3p meðan á MVI stóð. Áður höfðu Baker o.fl. sýndi að ATP1B1 (b1 undireining Na plús /K plús -ATPasa) rekurnýruendurupptöku natríums í píplum (39). Að auki, Aguado-Fraile o.fl. hafa borið kennsl á Kinesin fjölskyldumeðliminn 3B (KIF3B) sem taka þátt í verslun með frumur í nálægum píplafrumum rotta. KIF3B virðist vera lykilmiðlari fyrir svörun nærliggjandi þekjupíplafrumna við blóðþurrð/endurflæði með hugsanlegri notkun ínýrustjórnun blóðþurrðarskaða (40). Við getum því velt því fyrir okkur að miR-222-3p bæli niður nauðsynlegar lífeðlisfræðilegar leiðir meðan á MVI stendur í þekjuvef. Þar að auki er ónæmistengdum ferlum einnig stjórnað af miR-222-3p oftjáningu: mikilvæg gen eins og TRAP1 og PEBP1 voru algerlega hindruð í sýnum með sterka MVI. Athyglisvert var sýnt fram á að TRAP1 batnaðinýrutubulointerstitial fifibrosis í músum með einhliða þvagrásarstíflu með því að verndanýrupípulaga þekjufrumum hvatbera (41). Ennfremur veitir PEBP1 bólgueyðandi áhrif með hömlun á bæði MAPK og NF-kB ferlum við homeostatic/basal aðstæður (42). Ínýruþekjuvef, rannsókn Marko o.fl. sýndi á glæsilegan hátt að NF-kB virkjun eftir blóðþurrð eykur pípuskaða og eykur bólgu (43). Í okkar höndum var PEBP1 algjörlega bælt af miR-222-3p, sem bendir til þess að NF kB ferillinn sé leystur úr læðingi meðan á MVI stendur. Alls sýna þessar niðurstöður að þekjulíffræði er raskað við MVI ognýruþekjufrumur bregðast virkan við MVI meiðslum á meðan þátttaka þessa vefs í MVI er sjaldan tekin fyrir. Þessar sameindaniðurstöður gætu varpað nýju ljósi á bráða pípulaga skaðaskemmdir, sem er rótgróið, en samt vanrækt ABMR viðmið. Að auki hefur verið sýnt fram á að þekjufrumur geta seytt exosomal miR-222-3p og framkallað M2 svipgerð í átfrumum (44). Í millitíðinni, Li o.fl. mjög nýlega greint frá því að M2 átfrumur oftjáa miR-155 og skila þessu miRNA í örumhverfinu, einnig með því að seyta exósóm. Við nýrnaígræðslu jókst miR-155 við ýmsar aðstæður (IFTA, bráða höfnun og TCMR) og í líkamsvökva eða vefjum (45). Athyglisvert er að miR- 155 getur stuðlað að þekju-mesenchymal umskiptum með því að miða á RASSF4 í þekjufrumum (46). Þessi miRNA-undirstaða víxlun milli átfrumna ognýruÁ eftir að meta þekjufrumur ínýrnaígræðslaog sérstaklega í tengslum við MVI. Í samræmi við þessar niðurstöður sáum við að miR-155-5p var aðallega gefið upp af APC sem umlykja einfrumur og átfrumur. Í þessu tiltekna undirmengi sýndi miR- 155-5p-markgena verufræði auðgun í premRNA skeytingsferlum. Athyglisvert er að Janssen o.fl. greint frá því að lungnabólga framkallaði pre-mRNA skeytingsferla í lungnablöðrum átfrumum. Þar að auki var virkjun pre-mRNA splicing mismunandi í átfrumum sem búa í vefjum samanborið við (blóðsöfnuð) átfrumna sem unnin eru af einstofum. Greint var frá breytingum á kjarnaefnaskiptum í nýteknum átfrumum, með auknu útstreymi í gegnum glýkólýsu og minnkuðu útstreymi í gegnum tríkarboxýlsýruhringinn (TCA hringrás, þ.e. Krebs hringrás) (47). Varðandi miR-150-5p, komumst við að því að oftjáning þess meðan á MVI stóð tengdist NF-kB ferlinum í eitilfrumuþyrpingunni sem nær yfir bæði meðfæddar NKT frumur og aðlagandi T frumur. Athyglisvert er að miR-150-5p er mikilvægt til að mynda þroskaðar og starfhæfar NK frumur (48) og miR-150-5p skort CD8 plús T frumur voru minni frumudrepandi (49). Að auki geta CD8 T frumur einnig seytt miR-150-5p í exósómum (50) sem gæti aftur stuðlað að virkjun vefjafruma í pípulaga þekjufrumum og síðarinýrufifibrosis eins og bent er á í nýlegum skýrslum (51, 52).
CISTANCHE MUN BÆTA NÝRA/NÝRAVERK
Rannsóknin okkar hefur nokkrar takmarkanir. Við einbeitum okkur að rannsóknum okkar á 6 miRNA sem eru stöðugt auðkennd í fjölþrepa hönnun okkar. Hins vegar héldum við áfram með skref-fyrir-skref miRNA val, þar sem aðeins brot af öllum þekktum miRNAs var magnmælt í löggildingarhópnum. Tölfræðiferillinn fyrir val á miRNA byggðist á upphaflegri hönnun BIOMARGIN, sem hentaði til að bera kennsl á greiningarlífmerki fyrir marga endapunkta (ABMR, en einnig TCMR og IFTA). Þess vegna var miR-146a ekki magnmælt í staðfestingarhópnum, þó að það hafi aukist umtalsvert í uppgötvunar- og úrvalshópum (Mynd 2A). Þar með var miR-146a í reynd útilokað frá valferlinu okkar, þó að heimildir bendi til hlutverks í blóðþurrð/endurflæði í nýrnaígræðslu (53) og í Treg-miðluðu eftirliti með ónæmissvörun (54). Þar að auki getum við ekki útilokað að öflugri úrtaksstærð hefði gefið fleiri miRNA, eins og miR-138 (niður) og miR-511 (upp) sem voru gefin upp á mismunandi hátt í ABMR tilfellum úr valhópnum og sýndi þróun í sömu átt í uppgötvunarárganginum. Að auki gerðum við ekki sc-RNAseq greiningu á eigin vefjasýnissýnum heldur notuðum við sc-RNAseq gagnapakka sem til eru á netinu. Á þeim tíma sem rannsóknarhönnun og söfnun vefjasýnissýna var gerð var scRNAseq tækni reyndar ekki enn tiltæk og þörfin fyrir nýsöfnuð sýni leyfði ekki afturvirka notkun á frosnum eða paraffínum sýnum. Á sama hátt var mRNA prófílgreining gerð með því að nota örfylki, viðmiðunartækni á þeim tíma sem hefur nú verið betri en næstu kynslóð RNA-seq. Notkun á tiltæku sc-RNAseq gagnasafni á netinu takmarkar getu okkar til að tilkynna um helstu lýðfræðilega eiginleika sjúklinganna. Þessar upplýsingar sem vantar gætu valdið áhyggjum varðandi fulltrúa íbúahópa. Þar að auki stjórnuðum við engum tæknilegum þáttum raðgreiningarinnar. Þess vegna greindi sc-RNAseq greining okkar ekki neina daufkyrninga eða NK frumuþyrping í þessum sýnum, við valinn upplausn. Þess vegna voru niðurstreymisgreiningar okkar á miR-142-3p og miR-223-3p takmarkaðar við að byggja upp viðkomandi markgenanet og verufræði (viðbótarmynd S2) og leyfðu enga könnun á einfrumuupplausn. Hins vegar sýndi genanetið og verufræði 27 markgenanna miR-223-3p auðgun á TCA hringrás (viðbótarmynd S2) ásamt ERBB merkjum. Við getum því velt því fyrir okkur að bæði miR-155-5p í einfrumum og miR-223-3p í daufkyrningum gegni hlutverki í efnaskiptum og bólgusvörun sem þessar frumur taka þátt í meðan á MVI stendur. Að auki hefur nú þegar verið sýnt fram á að miR-142-3p eykst við höfnun nýrnaígræðslu (9, 55, 56), en það hafði hingað til ekki verið sérstaklega tengt við ABMR. Önnur takmörkun á rannsókninni okkar er að sérstakar breytingar á genatjáningu í sjaldgæfum íferðarfrumum gætu verið dulbúnar í lausu genatjáningargreiningu. Frekari rannsóknir þar á meðal fleiri sýni eru því nauðsynlegar til að leyfa rétta rannsókn á öllum, jafnvel sjaldgæfum frumuundirgerðum, en takmarkast nú af tiltölulega háum kostnaði við tæknina.
Að lokum könnuðum við hér sameindaferla sem tengjast MVI, helsta vefjafræðilegu áverka sem tengist ABMR. Samþætta omics nálgunin sem notuð var gerði okkur kleift að afhjúpa nýjar leiðir sem taka þátt í MVI og bendir til þess að breytingar á pípulaga þekjuefnaskiptum eigi sér stað sem afleiðing af ABMR, fyrir utan nærliggjandi æðaþekjuhólf. Rannsókn okkar sýnir mikla möguleika fjöl-omics til að afhjúpa sjúkdómskerfi og ryður brautina fyrir nýjar rannsóknir til að skýra frekar víxlræðuna millinýruundirhópar frumu sem eru búsettir og ígræðslu-ígræðslu.