Ágrip:Þessi rannsókn var gerð til að skýra hamlandi áhrif sýklóheterófýlíns á myndun melaníns. Til að skýra hamlandi áhrif sýklóheterófýlíns á B16F10 frumulínuna voru frumulífvænleiki, tjáning ríbónukleinsýru (mRNA), týrósínasavirkniprófun og melanínframleiðslumæling mæld. Áhrif sýklóheterófýlíns á týrósínasa-tengt prótein 1 (TYRP1)/TYRP2/týrósínasa (TYR)/microphthalmia-associated transcription factor (MITF) mRNA tjáningu og melaníninnihald voru ákvörðuð. Megindleg rauntíma RT-PCR sýndi að cycloheterophyllin minnkaði mRNA tjáningarstig TYRP1/TYRP2/TYR/MITF gena og melanínframleiðsluinnihaldi en -MSH-meðhöndlaðar B16F10 frumur. Týrósínasavirkniprófunin leiddi í ljós að sýklóheterófýllín minnkaði melanínframleiðslu í B16F10 frumunum. Þessi gögn sýna að cycloheterophyllin eykur hvítandi áhrif í B16F10 frumunum; þannig, cycloheterophyllin er öflugt innihaldsefni fyrir húðhvíttun. Því ætti að kanna frekari rannsóknir á verkunarmáta sýklóheterófýlíns fyrir þróun hagnýtra efna.

Samkvæmt viðeigandi rannsóknum er Cistanche algeng jurt sem er þekkt sem „kraftaverkajurtin sem lengir lífið“. Aðalhluti þess er cistanoside, sem hefur ýmis áhrif eins og andoxunarefni, bólgueyðandi og eflingu ónæmisvirkni. Hlutverkið milli cistanche og húðhvítunar liggur í andoxunaráhrifum cistanche glýkósíða. Melanín í húð manna er framleitt með oxun týrósíns sem hvatað er af týrósínasa, og oxunarviðbrögðin krefjast þátttöku súrefnis, þannig að súrefnisfríar stakeindir í líkamanum verða mikilvægur þáttur sem hefur áhrif á melanínframleiðslu. Cistanche inniheldur cistanoside sem er andoxunarefni og getur dregið úr myndun sindurefna í líkamanum og hamlað þannig melanínframleiðslu.

Smelltu á Hvernig nota Cistanche

Fyrir frekari upplýsingar:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

1. Inngangur

Litur húðarinnar ræðst af hemóglóbíni í blóði, melanín litarefni í húðþekjulaginu og -karótíni í undirhúð. Meðal þeirra ræðst litur húðarinnar aðallega af magni og dreifingu melanín litarefnisins [1]. Melanín er litarefni sem er myndað úr sortukorninu í sortufrumunni sem er til staðar í grunnlaginu. Það gleypir eða dreifir útfjólubláum (UV) geislum og hefur það jákvæða hlutverk að bæla skemmdir á húðfrumum eða húðvef. Hins vegar getur of mikil uppsöfnun melaníns valdið blettum, freknum og litarefnum. Það er vitað að það veldur oflitun [2,3].

Melanín litarefni er dæmigert ertandi efni sem veldur utanaðkomandi öldrun. Það er framleitt með sortumyndun sortufrumna sem hafa orðið fyrir útfjólubláum geislum og hefur það jákvæða hlutverk að vernda húðina fyrir útfjólubláum geislum með því að myrkva húðlitinn. Melanín litarefnið samanstendur af eumelanin (svart) og pheomelanin (rauðbrúnt) [4,5]. Melanín er framleitt með því að nota L-týrósín, tegund amínósýru, sem hvarfefni, og í gegnum L-DOPA (3,4-díhýdroxýfenýlalanín) og oxað frekar í DOPA-kínón með helstu ensímum týrósínasa (TYR), tyrosinasa-tengt prótein-1 (TYRP1) og TYRP2. DOPA-kínónið er frekar oxað í rautt-gult feómelanín í viðurvist súlfhýdrýlhópa. DOPA-kínónið er einnig afkarboxýlerað, oxað og hvatað í eumelanín þegar súlfhýdrýlhópar eru tæmdir [4,5]. Tyrosinasa ensímið er lykilensímið sem ber ábyrgð á framleiðslu melaníns og það er vitað að lakkrísþykkni, japanskt eikarþykkni, arbútín og kojínsýra, sem eru dæmigerð hvítandi efni, hindra virkni týrósínasa ensímsins [6,7]. Sérstaklega gegnir arbútín hlutverki við að hindra virkni týrósínasa með því að bregðast samkeppnishæft við L-týrósín, sem er hráefni fyrir melanín, og kojínsýru bundið við virka stað týrósínasa með Cu2 plús. Vitað er að kójínsýra og arbútín hafa sterk hvítandi áhrif, en tilkynnt hefur verið um aukaverkanir af öryggisvandamálum eins og húðertingu [8,9]. Margar rannsóknir eru gerðar til að uppgötva ný áhrifarík efni eins og þróun náttúrulegra hagnýtra efna [8,9].

Cycloheterophyllin (C30H30O7), tegund prenýlflavons, er í miklu magni í Artocarpus heterophyllus og hefur verið greint frá því að það hafi lyfjafræðilega og líffræðilega virkni, þar á meðal bólgueyðandi, blóðflögueyðandi virkni og andoxunarvirkni [10-13]. Að auki hefur verið greint frá því að það hafi andoxunar- og öldrunaráhrif á húðvefjafrumur í mönnum af völdum UV-A [14,15].

Sem slíkt hefur verið greint frá því að sýklóheterófyllín sé áhrifaríkt við ýmsum sjúkdómum, en engar rannsóknir eru til um áhrif melanínframleiðslu með sýklóheterófýlíni. Í þessari rannsókn skoðaði ég áhrif sýklóheterófýlíns á tjáningu merkjanna TYRP1, TYRP2, TYR og MITF í B16F10 frumum, sortuæxlisfrumulínu sem er unnin úr músum, sem tengist melanínframleiðsluferlinu.

2. Niðurstöður og umræður

CCK{{0}} prófun var gerð til að ákvarða frumueiturhrif sýklóheterófýllíns í B16F10 frumulínu. Ýmsum styrkjum af cycloheterophyllin var bætt við til að mæla lífvænleika frumna (Mynd 1). Þegar það var meðhöndlað með styrk upp á 20 µg/ml eða meira, var staðfest að lifunartíðni B16F10 frumna minnkaði marktækt miðað við samanburðarhópinn. Þegar sýklóheterófýllíni var bætt við með styrk upp á 10 µg/ml var lifunarhlutfall B16F10 frumna svipað og í samanburðarhópnum. Þess vegna var sýklóheterófýllíni bætt við í styrknum 10, 1 og 0,1 µg/mL í viðbótartilraunum.

Týrósínasa ensím hvarfast við L-týrósín til að framleiða L-DOPA og L-DOPA framleiðir loksins melanín litarefni í gegnum DOPAquinone með tyrosinasa, sem er þekkt sem lykilensím sem stjórnar sortumyndun [4,5]. Í þessari tilraun var kojínsýra notuð sem jákvæður samanburður til að meta hversu hömlun týrósínasa ensímvirkni er. Hömlun á virkni týrósínasa ensíma var staðfest með meðferð með sýklóheterófýllíni í styrkjum 10, 1 og 0,1 µg/ml. Það var staðfest að virkni týrósínasa ensíma var hamlað á styrkleikaháðan hátt með sýklóheterófýllíni (mynd 2). Í hópum sem fengu sýklóheterófyllín í styrkleikanum 10, 1 og 0,1 µg/ml, var staðfest að hamlandi áhrif týrósínasa ensíms voru 58,0, 27,4 og 16,9 prósent, í sömu röð.

UV geislar örva glærufrumur í húðþekju til að framkalla tjáningu á - sortufrumuörvandi hormóni ( -MSH), hormóni sem örvar sortufrumur, og er seytt út fyrir frumuna, og seytt -MSH örvar sortufrumur. Með því að bindast melanocortin 1 viðtakanum (MC1R), framkallar það boð sem tengjast melanínmyndun í frumunni, sem veldur framleiðslu á melanín litarefni [5]. Í þessari tilraun, til að örva melanínframleiðslu í B16F10 frumum, var 200 nM -MSH notað til að örva melanínframleiðslu í B16F10 frumum [16]. Rauntíma RT-PCR á tjáningarstigum TYRP1, TYRP2, TYR og MITF gena, sem eru merki sem aukast við -MSH meðferð, var ákvarðað, með cycloheterophyllin meðferð í -MSH meðhöndluðum B16F10 frumum. B16F10 frumur voru meðhöndlaðar með sýklóheterófýllíni og tjáning merkisins var staðfest með rauntíma RT-PCR. Fyrir vikið var staðfest að tjáning TYRP1, TYRP2, TYR og MITF minnkaði marktækt í hópnum sem fékk sýklóheterófýllín samanborið við hópinn sem fékk -MSH. Nánar tiltekið, í tilraunahópnum sem var meðhöndluð með 10 µg/mL af sýklóheterófýllíni, minnkaði tjáning TYRP1, TYRP2, TYR og MITF gena um 53,3, 26,6, 58 og 34 prósent, í sömu röð (Mynd 3). Í tilraunahópnum sem var meðhöndlaður með 1 µg/mL cycloheterophyllin var staðfest að tjáning merkjanna var marktækt minni og tjáning TYRP1 og TYRP2 gena minnkaði á sama hátt í hópnum sem fékk 0,1 µg/mL cycloheterophyllin.

Eftir að hafa staðfest að meðhöndlun á sýklóheterófýllíni minnkaði mRNA tjáningarstig merkis sem tengist sortumyndun, var hraði framleiðslu melanín litarefnis staðfest til að ákvarða hvort framleiðsla á melanín litarefni í B16F10 frumum væri verulega minni (Mynd 4) . B16F10 frumulínur sem voru meðhöndlaðar með sýklóheterófýllíni í styrkleikanum 10, 1 og 0,1 µg/mL, í sömu röð, voru safnað og magn melanínframleiðslu var staðfest. Fyrir vikið var staðfest að framleiðsla á melanín litarefni minnkaði verulega með sýklóheterófýllíni í styrkleikanum 10 og 1 µg/mL (Mynd 4A). Að auki var staðfest að framleiðsla á melanín litarefni í sýklóheterófýllíni-meðhöndluðu ástandi minnkaði samanborið við samanburðarhópinn (Mynd 4B). Þegar 10 og 1 µg/mL cycloheterophyllin var bætt við, minnkaði framleiðsluhraði melanín litarefnis um 44,6 og 37,8 prósent, í sömu röð, sem var verulega minnkað samanborið við samanburðarhópinn (Mynd 4B). Þessar niðurstöður hafa tilhneigingu til að vera í samræmi við tilraunaniðurstöður rauntíma RT-PCR á mRNA tjáningarstigum sortuefnatengdra merkja.

Andoxunarefni eins og askorbínsýra eru þekkt fyrir að vera mikilvægt hvítandi efni sem hindrar myndun melanín litarefna með því að minnka DOPAquinone, milliefni í eumelanín framleiðsluferlinu, í L-DOPA [16,17]. Einnig hefur verið greint frá því að cycloheterophyllin hafi andoxunaráhrif [11,12]. Sýnt hefur verið fram á að sýklóheterófýllín getur verið áhrifaríkt við að hvítna til þessara andoxunaráhrifa. Sem afleiðing af því að staðfesta andoxunaráhrifin in vitro með þessari DPPH radical scavenging prófun, var staðfest að það hefur andoxunaráhrif sambærileg við askorbínsýru, jákvæða stjórn undir háum styrk sýklóheterófýllíns (mynd 5). Í framtíðinni ætti að gera frekari rannsóknir á andoxunaráhrifum sýklóheterófýlíns í sortufrumum og tjáningu andoxunarensíma eins og katalasa, SOD1, SOD2 og SOD3.

3. Efni og aðferðir

3.1. Tilraunaefni og frumurækt

B16F10 frumulína var keypt frá Korean Cell Line Bank (Kóreu) og frumuræktunarmiðillinn var 10 prósent nautgripasermi (FBS, SFBU−0500, Equitech-bio, Kerrville, TX, USA) í Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) , LM 001–05, Welgene, Gyeongsan-si, Kóreu), og 1 prósent penicillín/streptomycin (Gibco, 15140–122, Waltham, MA, Bandaríkjunum) var bætt við. Frumur voru ræktaðar í hitakassa við 37 ◦C og 5 prósent CO2 [16]. Sýklóheterófýllínið sem notað var í þessari tilraun var dregið úr Artocarpus heterophyllus með því að nota DMSO og keypt frá ChemFaces Co. (CFN97748, Wuhan, Kína, hreinleiki meiri en eða jafnt og 98 prósent).

3.2. Cell Viability Assay Cell

hagkvæmni var metin með CCK-8 lausn (frumutalningarsetti; EZ−3000, EZ-Cytox, Seoul, DoGen). B16F10 frumulínur voru sáð í ræktunarmiðil með þéttleikanum 2 × 104 frumur/96 brunna plötur. Eftir 24 klst var cycloheterophyllin (CFN97748, Chemfaces) bætt við. B16F10 frumulínan sem var meðhöndluð með sýklóheterófýllíni var ræktuð í 24 klst og CCK-8 lausn var bætt við í 30 mínútur í 37 ◦C hitakassa. Frásog var mæld við 450 nm með því að nota örplötulesara (Epoch, Winooski, VT, USA, BioTek) og lífvænleiki frumna var reiknaður út frá gleypni samanburðarhóps án frumna [16].

3.3. DPPH próf

3.4. In vitro sveppir tyrosinase virkni

3.5. Magnbundin rauntíma öfug umritun-pólýmerasa keðjuverkun (Q-RT-PCR)

Heildar-RNA var einangrað með Trizol (15596018, Carlsbad, CA, Bandaríkjunum, Thermo Fisher Scientific). Styrkur RNA var ákvarðaður með litrófsmælingu (BioTek). Fjögur míkrógrömm af RNA voru öfugumrituð í cDNA með því að nota ReverTra Ace® öfugumritunarbúnaði (Toyobo, FSQ101, Osaka, Japan). Öfug umritun var stöðvuð með því að bæta Tris-EDTA jafnalausn (pH 8,0) við samtals 200 µL af cDNA lausn. TaqMan® Gene Expression Assay settin voru keypt frá Applied Biosystems. Q-RT-PCR voru gerðar samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. Í stuttu máli innihéldu 20 µL af Q-PCR blöndu 10 µL 2× TaqMan Universal Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), 1 µL 20× Taqman tjáningargreining (Applied Biosystems) og 50 ng cDNA. Q-PCR blanda var hvarfað við 95 ◦C í 20 sekúndur og 40 sinnum hringrásarhvörf (95 ◦C í 1 s og 60 ◦C í 20 s) með StepOnePlus kerfi (Applied Biosystems). Genaauðkennisnúmerin fyrir TaqMan tjáningargreininguna sem notuð eru í Q-RT-PCR greiningunum eru sýnd í töflu 1. Human GAPDH (Applied Biosystems) var notað til að staðla breytileika í cDNA magni úr mismunandi sýnum.

3.6. Melanin keppnisgreining

Til að mæla magn melanín litarefnis var aðferð Hosoi að hluta til breytt [17]. Alls voru 1 × 105 B16F10 frumur sáð í 60 mm vefjaræktunarskál. Eftir að frumurnar hafa verið ræktaðar í 24 klst, var 200 nM af -melanocyte örvandi hormóni (-MSH; M4135, Sigma-Aldrich) og cycloheterophyllin (10, 1, 0,1 µg/mL) bætt við í 72 klst við hverja styrk. Eftir að ræktunarmiðillinn var fjarlægður var 200 µL af NaOH (1N; S8045, Sigma-Aldrich) lausn bætt við og ræktuð við 60 ◦C í 2 klst. til að leysa upp melanín. Gleypið var mælt með litrófsmæli (405 nm, tímabil). Sem jákvæð viðmiðun var 100 µg/ml arbútín (A4256, Sigma-Aldrich) notað. Hömlun á framleiðslu melaníns litarefnis var gefin upp sem hundraðshluti af magni melaníns sem framleitt er við -MSH meðferðaraðstæður. Það var gert með því að framkvæma sjálfstætt þrjár sjálfstæðar tilraunir.

3.7. Tölfræðigreining

4. Niðurstöður

Útfjólublátt ljós í daglegu lífi hefur gagnlegar aðgerðir eins og D-vítamínmyndun og ófrjósemisaðgerð, en að öðru leyti veldur það tapi á húðteygjanleika, hrukkum, litarefnum, roða, bólgu osfrv., með keðjuverkun hvarfgjarnra súrefnistegunda [18, 19]. Að auki kemur utanaðkomandi öldrun af völdum utanaðkomandi þátta eins og UV í veg fyrir starfsemi eðlilegra vefja og endurnýjun þegar vefurinn er skemmdur vegna minnkunar og hnignunar frumna í lifandi líkama [20,21].

Með þessari rannsókn var hægt að staðfesta viðeigandi styrk sýklóheterófýllíns til að meðhöndla B16F10 frumurnar. Það var staðfest að styrkur 10 µg/mL hafði ekki áhrif á lífvænleika frumna, eins og sýnt er á mynd 1. Með niðurstöðum mælinga á virknihamlandi áhrifum týrósínasa ensímsins var staðfest að styrkur sýklóheterófýllíns upp á 10, 1, og 0,1 µg/ml dró verulega úr virkni tyrosinasa ensímsins (Mynd 2). Að auki var staðfest að sýklóheterófýllín dró marktækt úr tjáningu merkja (TYRP1, TYRP2, TYR og MITF gen) samanborið við -MSH meðhöndlað ástand (Mynd 3). Að auki var staðfest að sýklóheterófýllín minnkaði magn melanínsmyndunar í B16F10 frumum (Mynd 4). Byggt á þessum niðurstöðum sýnir cycloheterophyllin möguleika sem nýtt hvítunarefni.

Þessi rannsókn er sú fyrsta sem staðfestir hamlandi áhrif sýklóheterófýlíns á nýmyndun melaníns og bendir til þess að hægt sé að hamla öldrun húðar af völdum útfjólubláa geisla. Að auki virðast frekari dýpri áhrif þess á boðkerfi B16F10 frumna, á boðkerfi sem taka þátt í hvítun og á ýmis andoxunarensím sem eru til staðar í sortufrumum vera nauðsynleg.

Heimildir

1. Bonaventure, J.; Domingues, MJ; Larue, L. Frumu- og sameindakerfi sem stjórna flutningi sortufrumna og sortuæxlafrumna. Litarfrumu sortuæxli Res. 2013, 26, 316–325. [CrossRef] [PubMed]

2. Gilchrest, BA; Eller, MS DNA ljósskemmdir örvar sortumyndun og önnur ljósverndandi viðbrögð. J. Rannsókn. Dermatol. Symp. Frv. 1999, 4, 35–40. [CrossRef] [PubMed]

3. Sugumaran, M. Samanburðarlífefnafræði eumelanogenesis og verndarhlutverk fenóloxíðasa og melaníns í skordýrum. Pigment Cell Res. 2002, 15, 2–9. [CrossRef] [PubMed]

4. Ito, S.; Wakamatsu, K. Megindleg greining á eumelanin og pheomelanin í mönnum, músum og öðrum dýrum: Samanburðarrýni. Pigment Cell Res. 2003, 16, 523–531. [Krossvísun]

5. Yoon, YM; Bae, SH; An, SK; Choe, YB; Ahn, KJ; An, IS Áhrif útfjólublárar geislunar á boðleiðir húðar og húðfrumna. Kór. J. Aesthet. Snyrtivörur. 2013, 11, 417–426.

6. Baek, YS; Ryu, YB; Curtis-Long, MJ; Ha, TJ; Rengasamy, R.; Yang, MS; Park, KH Tyrosinasa hamlandi áhrif 1,3- dífenýl própans frá Broussonetia Kozinski. Bioorg. Med. Chem. 2009, 17, 35–41. [Krossvísun]

7. Kim, HJ; Seo, SH; Lee, BG; Lee, YS Greining á týrósínasahemlum frá Glycyrrhiza uralensis. Planta Med. 2005, 71, 785–787. [Krossvísun]

8. Han, NK; Park, CM; Kwon, JC; Joung, MS; Choi, JW Hvítandi áhrif Fagopyrum tataricum þykkni. J. Soc. Snyrtivörur. Sci. Kórea 2014, 40, 179–186.

9. Kim, BY; Park, SH; Park, BJ; Kim, JJ Whitening áhrif Androsace umbellate þykkni. J. Soc. Snyrtivörur. Sci. Kórea 2015, 41, 21–26.

10. Lin, CN; Lu, CM; Lin, HC; Fang, SC; Shieh, BJ; Hsu, MF Nýtt blóðflöguhemjandi efni frá Formosan moraceous plöntum. J. Nat. Framl. 1996, 59, 834–838. [Krossvísun]

11. Wang, JP; Raung, SL; Tsao, LT; Hsu, MF; Lin, CN Blokkun á prótein kínasa C tekur þátt í hömlun cyclometersphyllin á myndun daufkyrninga súperoxíðs anjóna. Naunyn. Schmiedeberg Arch. Pharm. 1997, 355, 551–558. [Krossvísun]

12. Ko, FN; Cheng, ZJ; Lin, CN; Teng, CM Hreinsandi og andoxunareiginleikar prenýlflavona einangruð frá Artocarpus heterophyllus. Free Radic. Biol. Med. 1998, 25, 160–168. [Krossvísun]

13. Jantan, I.; Yasin, YH; Jamil, S.; Sirat, H.; Basar, N. Áhrif prenýleraðra flavonoids og chalcones einangruð úr Artocarpus tegundum á blóðflagnasamsöfnun í heilblóði manna. J. Nat. Med. 2010, 64, 365–369. [Krossvísun]

14. Huang, CH; Li, HJ; Wu, NL; Hsiao, CY; Lin, CN; Chang, HH; Hung, CF Ljósverndandi áhrif sýklóheterófýlíns gegn UVA-völdum skaða og oxunarálagi í húðtrefjum úr mönnum. PLoS ONE 2016, 11, e0161767. [Krossvísun]

15. Shim, JH Öldrunaráhrif sýklóheterófýlíns í UVA-geisluðum húðtrefjum. Kór. J. Pharmacogn. 2019, 50, 285–290.

16. Tomita, Y.; Seiji, M. Óvirkjunarkerfi tyrosinasa í sortuæxlum í músum. J. Dermatol. 1977, 4, 245–249. [Krossvísun]

17. Panzella, L.; Ebato, A.; Napolitano, A.; Koike, K. Seinni stig sortumyndunar: Kannaðu efnafræðilegu hliðarnar og notkunarmöguleikana. Alþj. J. Mol. Sci. 2018, 19, 1753. [Krossvísun]

18. Talwar, HS; Griffiths, CE; Fisher, GJ; Hamilton, TA; Voorhees, JJ Minnkuð prókollagen af ​​tegund I og tegund III í ljósskemmdri húð fullorðinna manna. J. Fjárfest. Dermatol. 1995, 105, 285–290. [Krossvísun]

19. Kim, J.; Lee, CW; Kim, EK; Lee, SJ; Park, NH; Kim, HS; Kim, HK; Char, K.; Jang, YP; Kim, JW Hindrunaráhrif Gynura procumbens útdráttar á UV-B-framkallaða fylkis-metallópróteinasa tjáningu í húðtrefjum úr mönnum. J. Enthnopharmacol. 2011, 137, 427–433. [Krossvísun]

20. Kirkwood, TB Skilningur á undarlegum vísindum öldrunar. Cell 2005, 120, 437–447. [Krossvísun]

21. Jones, DL; Rando, TA Ný líkön og hugmyndafræði fyrir öldrun stofnfrumna. Nat. Cell Biol. 2011, 13, 506–512. [CrossRef] [PubMed]

Fyrir frekari upplýsingar: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501