Cistanchehefur einnig það hlutverk aðstuðla að kollagenframleiðslu, sem getur aukið mýkt og ljóma húðarinnar og hjálpaðgera við skemmdar húðfrumur. CistancheFenýletanól glýkósíðhafa veruleg niðurstýrandi áhrif á virkni týrósínasa og sýnt er að áhrifin á týrósínasa eru samkeppnishæf og afturkræf hömlun, sem getur veitt vísindalegan grunn til að þróa og nýta hvítunarefnin í Cistanche. Þess vegna gegnir cistanche lykilhlutverki í húðinnihvítun. Það geturhamla melanínframleiðslutil að draga úr mislitun og sljóleika; og stuðla að kollagenframleiðslu til að bæta mýkt og ljóma húðarinnar. Vegna víðtækrar viðurkenningar á þessum áhrifum cistanche hafa margar húðhvítunarvörur byrjað að fylla á jurtaefni eins og Cistanche til að mæta eftirspurn neytenda og auka þannig viðskiptalegt gildi Cistanche í húðhvítunarvörum. Í stuttu máli, hlutverk cistanche í húðhvíttun skiptir sköpum. Þessandoxunarefniáhrif ogkollagen-framleiðandi áhrifgetur dregið úr litabreytingum og sljóleika, bætt mýkt og ljóma húðarinnar og þannig náð hvítandi áhrifum. Einnig sýnir hin víðtæka notkun Cistanche í húðhvítunarvörur að ekki er hægt að vanmeta hlutverk þess í viðskiptavirði.

Smelltu á Organic Cistanche fyrir hvítun

Fyrir frekari upplýsingar:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

Týrósínasi er hraðatakmarkandi ensímið í framleiðslu melaníns og er því mest áberandi markmið til að hindra oflitarefni. Fjölmargir týrósínasahemlar hafa verið greindir, en flestir þeirra skortir klíníska skilvirkni vegna þess að þeir voru auðkenndir með því að nota sveppatýrósínasa sem markið. Þess vegna notuðum við raðbrigða týrósínasa úr mönnum til að skima safn með 50,000 efnasamböndum og bárum saman virku skimunarhitana við vel þekkt hvítunarefni. Hýdrókínón og afleiða þess arbútín hamlaði aðeins lítillega týrósínasa úr mönnum með hálfhámarks hamlandi styrk (IC50) á millimólum bilinu og kojínsýra sýndi veika verkun (IC50 > 500 mmól/L). Öflugustu hemlar týrósínasa úr mönnum sem greindust í þessari skjámynd voru resorsínól-þíazól afleiður, sérstaklega nýlega auðkennt Thiamidol (Beiersdorf AG, Hamborg, Þýskalandi) (ísóbútýlamídó þíazólýl resorsínól), sem hafði IC50 upp á 1,1 mmól/L. Aftur á móti hamlaði Thiamidol aðeins væga sveppatýrósínasa (IC50 =108 mmól/L). Í sortufrumnaræktum hamlaði Thiamidol melanínframleiðslu (IC50 =0,9 mmól/L), mjög en afturkræf, en hýdrókínón hamlaði sortumyndun óafturkræft (IC 50 = 16,3 mmól/L). Klínískt minnkaði Thiamidol sýnilega aldursbletti innan 4 vikna og eftir 12 vikur voru sumir aldursblettir óaðgreinanlegir frá venjulegri aðliggjandi húð. Kanna þarf alla möguleika Thiamidols til að draga úr oflitun í húð manna í framtíðarrannsóknum.

KYNNING

Melasma, aktínísk og senil lentigín og bólgueyðandi litarefni eru mikil snyrtivandamál sem margir sjúklingar leita til læknis vegna. Almennt hafa þessar sjúkdómar áhrif á íbúa með dekkri húðlit með meiri tíðni og alvarleika (Stratigos og Katsambas, 2004). Margar staðbundnar vörur eru fáanlegar til að meðhöndla oflitunarsjúkdóma og þau innihalda fjölbreytt virk efni til að draga úr melanínframleiðslu og/eða dreifingu. Þrátt fyrir að hægt sé að draga úr oflitun húðar með ýmsum aðferðum (Briganti o.fl., 2003), er týrósínasi, hraðatakmarkandi ensím melanínframleiðslu, augljóst markmið fyrir hemla oflitunar (Kanteev o.fl., 2015; Lee o.fl., 2014; Ramsden og Riley, 2014). Mörgum efnum hefur verið lýst í bókmenntum sem týrósínasahemlum, en flest þeirra skortir klíníska skilvirkni og aðeins fá efnasambönd eru nú notuð í staðbundnar húðsjúkdómavörur (Chang, 2009; Kim og Uyama, 2005; Rescigno o.fl., 2002 ). Meðal þeirra eru kojínsýra, hýdrókínón og arbútín algengust (Solano o.fl., 2006).

Ófullnægjandi klínísk virkni týrósínasahemla sem nú eru notuð er mikil vegna þess að þessi efnasambönd voru prófuð með því að nota eingöngu týrósínasa einangraðan úr sveppnum Agaricus bisporus (mTyr) (Espin o.fl., 2000; Garcia-Molina o.fl., 2005), sem er sá eini. virkur týrósínasi sem er fáanlegur í verslun. Hvatavirkni og sérhæfni hvarfefnis mTyr eru verulega frábrugðin spendýraensíminu (Hearing o.fl., 1980). Nýlega var leyst úr þrívíddarbyggingu nokkurra tyrosinasa, þar á meðal byggingu mTyr (Ismaya o.fl., 2011) og tveggja bakteríuensíma frá Streptomyces castaneoglobisporus (Matoba o.fl., 2006) og Bacillus megaterium (Sendovski o.fl. , 2011). Aftur á móti eru mjög litlar upplýsingar um hreyfingu eða uppbyggingu tiltækar fyrir týrósínasa manna (hTyr), aðallega vegna verulegra erfiðleika við að fá nægilegt magn af hTyr úr náttúrulegum uppruna eða með ólíkri tjáningu. hTyr hefur verið tjáð tímabundið í ýmsum dýrafrumulínum (Olivares o.fl., 2002; Schweikardt o.fl., 2007; Tripathi o.fl., 1992; Wendt, 2006), en afraksturinn var alltaf of lágur til að hægt væri að greina nákvæma lýsingu á niðurstöðunni. hTyr undirbúningur. Nýlega hafa nokkrir hópar þróað skilvirkari tjáningarkerfi fyrir hTyr (Cordes o.fl., 2013; Fogal o.fl., 2015; Lai o.fl., 2016), en gögn um þrívíða uppbyggingu hTyr eða hreyfifræðileg gögn um hTyr hemla vantaði enn.

NIÐURSTÖÐUR

Hömlun hTyr

A screen of 50,000 compounds in the library, which spans a wide chemical space, yielded several hit series of active and effective hTyr inhibitors. Among them, derivatives of thiazolyl-resorcinol were the most promising group. This lead compound was then optimized to develop derivatives with high activity and physicochemical properties compatible with topical formulations. Thiamidol (isobutyl amido thiazolyl resorcinol, compound 1) (Figure 1) was identified as one of the most potent derivatives. In addition to Thiamidol, 4-butyl resorcinol (compound 2) and the classical tyrosinase inhibitors kojic acid (compound 5), hydroquinone (compound 6), and arbutin (compound 7), as well as rhododendron (compound 9), were also tested as inhibitors of the diphenols (L-dopa oxidase) activity of hTyr over a wide range of concentrations (up to 4 orders of magnitude). The results are summarized in Figure 2a and Table 1. Among these actives, Thiamidol was by far the most efficient inhibitor of hTyr, with a half-maximal inhibitory concentration (IC50) of 1.1 mmol/L, with almost complete enzyme inhibition of hTyr occurring at concentrations above 10 mmol/L. The resorcinol derivatives 4-butylresorcinol, 4-hexylresorcinol, and 4-phenylethylresorcinol had IC50 values of 21mmol/L, 94mmol/L, and 131 mmol/L, respectively (Table 1). With an IC50 of about 500 mmol/L, kojic acid was 500 times less potent than Thiamidol. Hydroquinone and arbutin were both very poor inhibitors of hTyr, with IC50 values in the millimolar range. Kojic acid, arbutin, and hydroquinone were not able to completely inhibit hTyr in the concentration range tested. Racemic rhododendron was also rather ineffective as an inhibitor of L-dopa oxidation, with an IC50 >1.200 mmól/L (Mynd 2a).

Ítarleg greining á hTyr á hTyr af völdum Thiamidol leiddi af sér stranglega samkeppnishæfa tegund hömlunar með hemlafasta (Ki) upp á 0,25 mmól/L (Mynd 2b, Tafla 1). Þetta gildi er í samræmi við IC50 gildið sem er metið út frá skammta-svörunarferlum (1,1 mmól/L) (sbr. mynd 2a) sem, fyrir samkeppnishömlun, ætti að vera um það bil 3 sinnum hærra en Ki. Ki-gildin fyrir 4-bútýlresorsínól (9 mmól/L), 4-hexýlresorsínól (39 mmól/L) og 4- fenýletýlresorsínól (24 mmól/L) voru einnig töluvert hærri en Ki-gildi Thiamidol (tafla 1). Þessi gögn sýna að tíasólýlamíðhlutinn í Thiamidol flytur mun betri hTyr hTyr en kolvetnishliðarkeðjur sem eru til staðar í þremur öðrum afleiðum resorsínóls (4-bútýl-, 4-hexýl- og {{ 21}}fenýletýlresorsínól). Eins og fram hefur komið er verkunin áberandi frábrugðin mTyr, þar sem 4-bútýlresorsínól, 4-hexýlresorsínól og 4-fenýletýlresorsínól, og jafnvel kojínsýra, eru betri en Thiamidol við að hindra ensímið (tafla 1). Þannig hefði Thiamidol ekki verið greint sem jákvætt í skimun með mTyr og verkun 4-fenýletýlresorsínóls hefði verið gróflega ofmetin.

Garcia-Jimenez o.fl. (2016) greindi nýlega frá því að mTyr oxar hægt tiltekin resorsínól, að því tilskildu að ríkjandi met-form ensímsins sé áður breytt í annað hvort oxý- eða deoxýform með aukefnum eins og H2O2 og askorbati og að hvarfið sé haldið uppi af o-dífenólum . Þess vegna notuðum við megindlega hágæða vökvaskiljun (Ito og Wakamatsu, 2015) til að ganga úr skugga um hvort Thiamidol gæti einnig verið hvarfefni hTyr. Við eðlilegar prófunaraðstæður okkar (þ.e. í fjarveru aukefnanna sem Garcia-Jimenez o.fl., 2016 nefndi), átti engin greinanleg oxun Thiamidol sér stað innan nokkurra klukkustunda frá ræktun með hTyr, en rhododendron var auðveldlega oxað innan þess tímaramma (sjá aukamynd S1 á netinu). Þannig gerum við ráð fyrir að viðbrögðin sem Garcia-Jimenez o.fl. á ekki við um Thiamidol og hTyr við lífeðlisfræðilegar aðstæður.

Hindrun á melanínframleiðslu

Við prófuðum síðan hugsanleg hamlandi áhrif þessara efnasambanda með því að nota þrívíddarlíkan fyrir húð manna. Eins og sést með hreinsað hTyr sýndi arbútín aðeins óverulega virkni við að hamla melanínframleiðslu í MelanoDerm (MatTek Corporation, Ashland, MA) húðlíkönum (IC50 > 4,000 mmól/L) (Mynd 2c) . Kojínsýra hamlaði melanínframleiðslu með IC50 upp á w400 mmól/L, sem sýndi furðu bratta skammta-svörunarferil, þar sem styrkur undir 200 mmól/L hindraði melanínframleiðslu aðeins lítillega (þ.e. um 5 prósent við 150 mmól/L). Rhododendron sýndi aðeins jaðaráhrif á sortumyndun, með augljóst IC50 fyrir hömlun á w1.200 mmól/L. Hýdrókínón hamlaði melanínframleiðslu í MelanoDerm húðlíkönum með IC50 upp á 15 mmól/L, sem bendir til þess að það hafi annan virkni en týrósínasa hömlun. 4-Butýlresorsínól hamlaði myndun melaníns með IC50 13,5 mmól/L. Aftur var Thiamidol lang öflugasti hemill melanínframleiðslu í MelanoDerm húðlíkönum, með IC50 upp á 0,9 mmól/L, og í einlaga ræktun minnkaði Thiamidol sýnilega melanínmyndun (Mynd 3a).

Hýdrókínón og tíamídól voru síðan prófuð í langtíma sortufrumum einlaga ræktun til að athuga hvort hömlun gæti gengið til baka. Þrátt fyrir að 1 mmól/L Thiamidol hafi dregið úr melanínframleiðslu í minna en 60 prósent eftir 2 vikur, minnkaði 1 mmól/L hýdrókínón melanínframleiðslu aðeins í um það bil 85 prósent (Mynd 3b). Hins vegar, við frekari ræktun án virku efnasambandanna, hófu sortufrumur sem höfðu verið hamlað af Thiamidol, melanínframleiðslu sína aftur og náðu formeðferðargildum innan 1 viku. Aftur á móti náðu hýdrókínónmeðhöndlaðar frumur ekki fulla getu til melanínframleiðslu innan 2-vikuræktunartímabilsins og framleiðsla melaníns hélt áfram við 85 prósent af formeðferðargildum.

Sameindalíkön

Mögulegir bindingarhættir Thiamidols við hTyr voru skoðaðir með sýndartengingarrannsóknum. Mynd 4a sýnir virka staðinn á samheitalíkaninu af hTyr í met- formi, með dokkaðan Thiamidol bindil með lægstu orku. Tvíkoparmiðstöðin með brúandi súrefninu sést til vinstri. Aðeins eru sýndar amínósýruleifar sem liggja beint að bundnu hemlinum. (Númer leifa inniheldur merkjapeptíð). Innra yfirborð bindivasans er litað í samræmi við vatnsfælni á kvarðanum frá bláu fyrir vatnssækið til brúnt fyrir vatnsfælinn. Þrátt fyrir að umhverfi tvíkoparstöðvarinnar sé áberandi vatnssækið, myndast mjög vatnsfælinn undirvasi aðallega af hliðarkeðjum I368, V377 og F347. Í staðbundinni stefnu sem sýnd er, kemst 1-hýdroxýhópurinn í arómatíska hring bindilsins í mikla snertingu við tvíkopar miðjuna og 3-hýdroxýhópurinn tekur þátt í vetnistengi við hliðarkeðjuna á S380 og burðarás karbónýl M374. Tíasólýlhringnum er haldið á sínum stað með vatnsfælnum samskiptum við óskautaða vasann (Mynd 4b), sem myndast af hliðarkeðjum amínósýra, sem flestar eru mismunandi á milli mTyr og hTyr (Mynd 4c).

Sambærilegar niðurstöður fengust þegar Thiamidol var fest við nýlega birta röntgengeislabyggingu hins byggingarlega svipaða TRP1, sem er Zn2þ-innihaldandi sortuvaldandi ensím með enn óþekkta virkni í mönnum (Ghanem og Fabrice, 2011; Lai o.fl., 2017), sem bendir til þess að að TYRP1 ensímið er einnig hamlað af Thiamidol (sjá viðbótarmynd S2 á netinu).

Klínískar rannsóknir

Virkni Thiamidol in vivo var síðan skoðuð í klínískum rannsóknum þar sem aldraðir einstaklingar meðhöndluðu aldursbletti á húðinni tvisvar á dag með formúlu sem innihélt {{0}},2 prósent Thiamidol eða með burðarefninu eingöngu sem viðmiðunarefni. Þegar eftir 4 vikna meðferð voru meðhöndlaðir aldursblettir marktækt ljósari en ómeðhöndlaðir viðmiðunaraldursblettir (mynd 5a). Framfarir héldu áfram yfir allt meðferðartímabilið og eftir 12 vikur voru sumir aldursblettir óaðgreinanlegir frá nærliggjandi húð með venjulega litarefni (Mynd 5b). Ljósmyndir af EpiFlash (Canfifield Scientifific Inc., Parsippany, NJ) sýndu sýnilegan bata í útliti aldursbletta og ómeðhöndlaðir aldursblettir við samanburðinn héldust óbreyttir (ekki sýndir). Eftirfylgnirannsókn sýndi að styrkur Thiamidols allt að 0,1 prósent minnkaði í raun sýnileika aldursbletta (sjá viðbótarmynd S3 á netinu).

UMRÆÐA

Öruggasta og áhrifaríkasta leiðin til að meðhöndla oflitun í húð er að draga úr melanínframleiðslu með því að hindra virkni tyrosinasa. Hins vegar skortir flesta týrósínasahemla sem lýst er í bókmenntum klíníska skilvirkni þegar þeir eru settir inn í staðbundnar vörur. Næstum öll voru þau prófuð eingöngu gegn mTyr (Espin o.fl., 2000; Garcia-Molina o.fl., 2005) og reyndust því, þótt þau hafi áhrif á mTyr, vera lélegir hTyr-hemlar. MTyr, sem fæst í verslun, er ekki einsleit efnablöndur heldur er blanda af nokkrum tyrosinasa ísóensímum og litlu magni af viðbótarensímvirkni sem getur haft áhrif á hömlunarrannsóknir á ófyrirsjáanlegan hátt (Pretzler o.fl., 2017). Ísóensím AbPPO3 og AbPPO4, helstu efnisþættir mTyr sem fást í verslun, hafa amínósýruraðir á svæðinu á virka staðnum sem eru verulega frábrugðnar hTyr (Mynd 4c). Bæði mTyr ísóensímin innihalda auka lykkjur á milli Asn371 (einn af glýkósýleringarstöðum hTyr) og Gly372. Nokkrar af leifunum sem hafa samskipti við Thiamidol í hTyr (sbr. mynd 4b) eru ekki varðveittar í mTyr, til dæmis Ile368, Ser375 og Ser380. Phe207 er skipulagslega varðveitt í mTyr, en Phe347 er það ekki. Þar sem jafnvel smávægilegar breytingar á ensím-bindilvíxlverkunum geta haft stórkostleg áhrif á bindisækni, komu hinir fjölbreytilegu hömlunarsnið hTyr og mTyr (sem samantekt í töflu 1) ekki á óvart.

Meginmarkmið þessarar rannsóknar var að bera saman áhrif arbútíns, hýdrókínóns og kojínsýru við ýmsar resorsínólafleiður á hvatavirkni hTyr og á melanínframleiðslu in vivo. Fyrir utan Thiamidol hefur öllum prófuðu efnum verið lýst sem týrósínasahemlum (Kim o.fl., 2012); Hins vegar er tilkynnt um hamlandi virkni þeirra mjög ólík. Í læknisfræðilegum bókmenntum er hýdrókínón talið vera viðmiðunarstaðallinn fyrir meðferð á oflitun húðar, þó að það séu miklar áhyggjur af öryggi þess. Hýdrókínón er bannað í Evrópusambandinu að nota í snyrtivörur, en það er enn selt í Bandaríkjunum sem lausasölulyf í samsetningum sem innihalda allt að 2 prósent hýdrókínón. Nýlega lýstu Matvæla- og lyfjaeftirlit Bandaríkjanna (2006) áhyggjum af hýdrókínóni; endanlegur úrskurður bíður hins vegar enn. Birt IC50 gildi fyrir hýdrókínón hömlun á mTyr ná yfir bilið frá 1,1 mmól/L (Kang o.fl., 2003) til 680 mmól/L (Abu Ubeid o.fl., 2009). Í greiningu okkar var hýdrókínón ótrúlega óvirkt gegn hTyr, hamlaði það aðeins lítillega, náði aðeins 50 prósenta hömlun við um það bil 4,000 mmól/L. Þrátt fyrir að hýdrókínón hafi verið talið týrósínasahemill frá því snemma á tíunda áratugnum (Palumbo o.fl., 1991), benda niðurstöður okkar til þess að frumudrepandi eiginleikar þess séu mikilvægari, ekki aðeins vegna skaðlegra áhrifa þess á sortufrumur heldur einnig vegna virkni þess sem hemill á sortumyndun. (Jimbow o.fl., 1974; Penney o.fl., 1984; Smith o.fl., 1988). Þessi skoðun er ekki aðeins rökstudd af niðurstöðum okkar með hTyr og þeirri staðreynd að hýdrókínón dró verulega úr melanínframleiðslu í húðlíkönum heldur einnig af tilraunum okkar með sortufrumnaræktun. Hér dró hýdrókínón úr melanínframleiðslu, en meðhöndluðu frumurnar náðu ekki fullri getu til að framleiða melanín eftir að það virka var fjarlægt.

Although arbutin is generally considered an effective tyrosinase inhibitor, the published IC50 values of arbutin for mTyr range from 40 mmol/L (Ying et al., 1999) to more than 30,000 mmol/L (Sugimoto et al., 2005). In our test system, we found very high IC50 values (>4,000 mmól/L) fyrir arbútín með bæði hreinsað hTyr og MelanoDerm húðlíkanið. Gögn um virkni bæði a-arbútíns og b-arbútíns hafa verið birt (Garcia-Jimenez o.fl., 2017). Hins vegar eru bæði efnasamböndin hýdrókínón forlyf, þar sem líffræðileg virkni þeirra er háð losun hýdrókínóns úr sameindinni (Briganti o.fl., 2003). Vísindanefnd Evrópusambandsins um neysluvörur (2008) gaf út gagnrýna álit um arbútín. Í ljósi losunar hýdrókínóns úr sameindinni, telur það að notkun arbútíns í snyrtivörum sé óörugg.

Birt IC50 gildi fyrir týrósínasa hömlun af völdum kojínsýru eru á bilinu 6 mmól/L (Curto o.fl., 1999) til meira en 100 mmól/L (Jeon o.fl., 2005). Sem hTyr hemill er kojínsýra mun óvirkari, með IC50 um það bil 500 mmól/L. Kojínsýra sýnir blandaða tegund hömlunar, með Ki upp á 145 mmól/L, sem gefur til kynna að hún binst deoxýformi týrósínasa (Sun o.fl., 2014). Þegar það er notað til að meðhöndla MelanoDerm líkanið sýnir kojínsýra einstaklega bratta skammta-svörunarferil, þar sem hlutfallsleg hömlun eykst úr 5 prósentum við 150 mmól/L í meira en 75 prósenta hömlun við 900 mmól/L (sjá mynd 2c). Þessi staðreynd gæti verið aðalástæðan fyrir mjög takmarkaðri skilvirkni kojínsýru in vivo. Varðandi öryggi kójínsýru, telur Evrópska vísindanefndin um neytendaöryggi (2012) nú að kójínsýra í styrk upp að 1,0% sé öruggt fyrir snyrtivörur þegar það er borið á heilbrigða húð, það er skoðun sérfræðinganefndar um snyrtivörur (Cosmetic Ingredient Review Expert Panel) Burnett o.fl., 2010).

Rhododendron fékk hálfgerða lyfjastöðu í Japan árið 2008 og var notað sem hvítandi innihaldsefni í snyrtivörum. Gert var ráð fyrir að það væri samkeppnishemill týrósínasa. Hins vegar, árið 2013, voru vörur sem innihéldu rhododendron innkallaðar í 10 Asíulöndum þegar nálægt 20,000 neytendur fengu hvítblæði eftir að hafa notað vörurnar. Sýnt var fram á að rhododendron er ekki aðeins hemill heldur er einnig hvarfefni bæði hTyr (Ito o.fl., 2014a) og mTyr (Ito o.fl., 2014b). Týrósínasaháð uppsöfnun á streitu endoplasmic reticulum og/eða virkjun á apoptotic ferli getur stuðlað að frumueiturhrifum sortufrumna rhododendron (Sasaki o.fl., 2014).

4-útskipt resorsínól mótífið hefur verið þekkt um nokkurt skeið sem duglegur efnahluti sem hamlar týrósínasa (Khatib o.fl., 2005). Mörg náttúruleg efnasambönd sem hafa verið auðkennd sem hvítandi efni, aðallega flavonoids, innihalda þetta mótíf (Shimizu o.fl., 2000, 2011). Vegna þess að aðgengi flavonoids er almennt lítið var markmið okkar að bera kennsl á resorcinol afleiður með betri virkni og aðgengi. 4-Bútýlresorsínól hafði þegar verið skilgreint sem hemill á týrósínasa músa og manna (Kim o.fl., 2005; Kolbe o.fl., 2013) og virkni díhýdroxýindólkarboxýlsýruoxidasa músa TYRP1 (Katagiri o.fl. , 2001), og það er fáanlegt fyrir læknisfræðilega og snyrtifræðilega meðferð við oflitarmyndun (Bohnsack o.fl., 2012; Jimenez og Garcia-Carmona, 1997; Kim o.fl., 2005). Engu að síður vantaði enn ítarlegar upplýsingar um hreyfihvarf 4-bútýl resorsínóls. Í hTyr prófuninni fundum við stranglega samkeppnishæfa tegund hömlunar með 4-bútýlresorsínóli með Ki upp á 9,1 mmól/L, sem er í frábæru samræmi við IC50 gildið sem ákvarðað var (tafla 1).

Í in vitro tilraunum okkar var Thiamidol, með IC50 1,1 mmól/L í hTyr ensímprófinu og 0,9 mmól/L í MelanoDerm húðlíkaninu, lang árangursríkasta allra efna sem prófuð voru. Frekari tilraunir staðfestu að Thiamidol er stranglega samkeppnishemill (Mynd 2b) og ekki hvarfefni fyrir tyrosinasa (sjá viðbótarmynd S1), og þar af leiðandi er Thiamidol ekki breytt í eitrað og hugsanlega hvítvoðandi kínón. Þess vegna var Thiamidol valið í klínískar rannsóknir til að meta virkni þess in vivo. Rannsókn á tíamídóli með því að nota blettastýringu sýndi stöðuga bata á útliti aldursbletta yfir allt 12-viku meðferðartímabilið, og náði tölfræðilegri marktekt strax eftir 4 vikur. Þessar niðurstöður sýna sterka litarefnisminnkandi virkni Thiamidol prófunarvörunnar og skýran klínískan ávinning í meðhöndlun oflitunar húðar.

EFNI OG AÐFERÐIR

Týrósínasi manna

Stypt, His-merkt form hTyr (hTyr-DHis) sem samanstendur af hvatasvæði hTyr var tjáð í HEK 293 frumum og hreinsað með málmsækniskiljun á Ni2þ-Sepharose (GE Healthcare, Munchen, Þýskalandi) eins og lýst er annars staðar ( Cordes o.fl., 2013). Blandan sem fékkst hafði sömu hvarfaeiginleika og villigerð hTyr.

Uppsprettur hemla

Úr Evotec efnasamböndasafninu (Evotec, Hamborg, Þýskalandi), voru 50,000 efnasambönd, sem þekja breitt efnarými, valin til að framkvæma HTS fyrir hTyr hemla, metin með því að nota Tyr prófið sem lýst er í næsta kafla. Afleiður efnilegra blýefnasambanda voru síðan smíðaðar til frekari hagræðingar. Hinir hemlarnir voru keyptir frá ýmsum birgjum (sjá viðbótarefni á netinu fyrir frekari upplýsingar).

Týrósínpróf og HTS aðferð

Allar upplýsingar um virkni L-dopa oxidasa og HTS skimunaraðferðirnar sem notaðar eru má finna í viðbótarefninu.

Sameindalíkön

In silico docking var byggð á nýju homology líkani af hTyr, sem lýst er annars staðar (Mann o.fl., 2017). Eftirlíkingarnar voru gerðar með því að nota Molegro Virtual Docker (Molegro, Árósum, Danmörku). Discovery Studio Visualizer 4.0 (Accelrys, San Diego, CA) var notað fyrir sjónræna gagnagreiningu og framsetningu. Röðin voru tekin úr UniProt gagnagrunninum (UniProt Consortium, 2017).

Húðlíkanagreiningar

Allar upplýsingar um MelanoDerm vefi sem eru notaðir sem húðlíkan og magn n af melaníninnihaldi þeirra er að finna í viðbótarefninu.

Melanocyte ræktun

Allar upplýsingar um sortufrumnaræktun og magn melaníninnihalds þeirra er að finna í viðbótarefninu.

Klínískar rannsóknir

Tvær slembiraðaðar in vivo rannsóknir (blindaðar fyrir prófunarafurðirnar, opnar fyrir ómeðhöndlaða samanburðinn) voru gerðar. Ein rannsókn tók þátt í 18 kvenkyns einstaklingum (56e71 árs), en 17 einstaklingar luku rannsókninni. Önnur rannsóknin var gerð með 19 einstaklingum (18 konur, 1 karl; 58e7{{10}} ára), þar sem allir 19 einstaklingar luku rannsókninni. Hver einstaklingur beitti tveimur mismunandi lyfjaformum tvisvar á dag á aldursbletti á framhandleggjum sínum með því að nota blettastýringu. Samsetningarnar voru aðeins mismunandi hvað varðar virka innihaldsefnið: 0,2 prósent Thiamidol á móti burðarefni í fyrstu rannsókninni og 0,1 prósent Thiamidol á móti burðarefni í annarri rannsókninni. Einn aldursblettur á einstakling var meðhöndlaður með formúlu sem innihélt virka efnið og viðmiðunarblettur var meðhöndlaður með burðarefninu eingöngu. Litarefni aldursblettanna var greind eins og lýst er í viðbótarefnum. In vivo rannsóknirnar voru gerðar í samræmi við ráðleggingar í núverandi útgáfu Helsinki-yfirlýsingarinnar og leiðbeiningum Alþjóðaráðstefnunnar um samræmingu góðra klínískra starfsvenja. Allir þátttakendur í þessum rannsóknum veittu skriflegt upplýst samþykki. Að auki voru rannsóknirnar samþykktar og samþykktar af endurskoðunarnefnd stofnana hjá Beiersdorf AG (Hamborg, Þýskalandi).

HAGSMUNAÁREKSTUR

VIÐBÓTAEFNI

Viðbótarefni er tengt við netútgáfu blaðsins.

HEIMILDIR

1.Abu Ubeid A, Zhao L, Wang Y, Hantash BM. Skammröð fákeppni með hamlandi virkni gegn sveppum og tyrosínasa úr mönnum. J Invest Dermatol 2009;129:2242e9.

2. Bohnsack K, Koop U, Hiddemann S, Kolbe L, Rippke F. Litarefni sem minnkar virkni og þol sex nýrra andlitsmeðferða sem innihalda 4-n-bútýl resorsínól, veggspjald nr. P864. Veggspjald kynnt á 21. EADV-þingi, 27-30 september, 2012; Prag, Tékkland.

3. Briganti S, Camera E, Picardo M. Efnafræðilegar og tækjafræðilegar aðferðir til að meðhöndla oflitarefni. Pigment Cell Res 2003;16:101e10.

4. Burnett CL, Bergfeld WF, Belsito DV, Hill RA, Klaassen CD, Liebler DC, o.fl. Lokaskýrsla um öryggismat á Kojic-sýru eins og hún er notuð í snyrtivörur. Int J Toxicol 2010;29(6 viðbót). 244Se73.

5. Chang TS. Uppfærð umsögn um týrósínasahemla. Int J Mol Sci 2009;10: 2440e75.

6. Chen QX, Ke LN, Song KK, Huang H, Liu XD. Hamlandi áhrif hexylresorcinols og dodecyl resorcinols á sveppa (Agaricus bisporus) tyrosinasa. Protein J 2004;23:135e41.

7. Cordes P, Sun W, Wolber R, Kolbe L, Klebe G, Ro¨hm KH. Tjáning í kerfum sem ekki eru sortuvaldandi og hreinsun á leysanlegum afbrigðum af týrósínasa úr mönnum. Biol Chem 2013;394:685e93.

8. Curto EV, Kwong C, Hermersdo¨rfer H, Glatt H, Santis C, Virador V, o.fl. Hemlar á melanocyte tyrosinasa spendýra: In vitro samanburður á alkýlesterum af gentisínsýru við aðra hugsanlega hemla. Biochem Pharmacol 1999;57:663e72.

9. Espin JC, Varon R, Fenoll LG, Gilabert MA, Garcia-Ruiz PA, Tudela J, o.fl. Hreyfifræðileg einkenni á sérhæfni hvarfefnis og gangverki sveppa tyrosinasa. Eur J Biochem 2000;267:1270e9.

10. Fogal S, Carotti M, Giaretta L, Lanciai F, Nogara L, Bubacco L, Bergantino E. Mannlegur tyrosinasi framleiddur í skordýrafrumum: kennileiti fyrir skimun nýrra lyfja sem fjalla um virkni þess. Mol Biotechnol 2015;57:45e57.

11. Garcia-Jimenez A, Teruel-Puche JA, Berna J, Rodriguez-Lopez JN, Tudela J, Garcia-Canovas F. Virkni tyrosinasa á alfa og beta-arbútín: Hreyfifræðileg rannsókn. PLoS One 2017;12:e0177330.

12. Garcia-Jimenez A, Teruel-Puche JA, Berna J, Rodriguez-Lopez JN, Tudela J, Garcia-Ruiz PA, Garcia-Canovas F. Einkenni verkunar tyrosinasa á resorcinols. Bioorg Med Chem 2016;24:4434e43.

13. Garcia-Molina F, Hiner AN, Fenoll LG, Rodriguez-Lopez JN, Garcia-Ruiz PA, Garcia-Canovas F, o.fl. Sveppir tyrosinasi: katalasavirkni, hömlun og óvirkjun sjálfsvíga. J Agric Food Chem 2005;53:3702e9.

14. Ghanem G, Fabrice J. Tyrosinasa-tengt prótein 1 (tyrp1/gp75) í húð sortuæxli í mönnum. Mol Oncol 2011;5:150e5.

15. Heyrn VJ Jr, Ekel TM, Montague PM, Nicholson JM. Týrósínasi spendýra. Stoichiometry og mæling á hvarfafurðum. Biochim Biophys Acta 1980;611:251e68.

16. Ismaya WT, Rozeboom HJ, Weijn A, Mes JJ, Fusetti F, Wichers HJ, Dijkstra BW. Kristalbygging Agaricus bisporus sveppa tyrosinasa: auðkenni tetramer undireininga og samspil við tropolone. Lífefnafræði 2011;50:5477e86.

17. Ito S, Gerwat W, Kolbe L, Yamashita T, Ojika M, Wakamatsu K. Týrósínasi manna getur oxað báðar handhverfur rhododendron. Litarfrumu sortuæxli Res 2014a;27:1149e53.

18. Ito S, Ojika M, Yamashita T, Wakamatsu K. Tyrosinasa-hvatuð oxun á rhododendron framleiðir 2-metýlkróman-6,7-díón, hugsanlegt endanlegt eitrað umbrotsefni: afleiðingar fyrir eiturverkanir sortufrumna . Litarfrumu sortuæxli Res 2014b;27:744e53.

19. Ito S, Wakamatsu K. Þægileg skimunaraðferð til að greina fenólhvítandi týrósínasahemla frá fenólum sem framkalla hvítblæði. J Dermatol Sci 2015;80:18e24.

20. Jeon SH, Kim KH, Koh JU, Kong KH. Hamlandi áhrif l-Dopa oxunar á tyrosinasa með húðhvítunarefnum. Bull Korean Chem Soc 2005;26:1135e7.

21. Jimbow K, Obata H, Pathak MA, Fitzpatrick TB. Verkunarháttur aflitunar með hýdrókínóni. J Invest Dermatol 1974;62:436e49.

22. Jimenez M, Garcia-Carmona F. 4-útskipt resorsínól (súlfítval) sem hægbindandi hemlar á virkni tyrosínasa katekólasa. J Agric Food Chem 1997;45:2061e5.

23. Kang HH, Rho HS, Hwang JS, Oh SG. Aflitunarvirkni og lítil frumueiturhrif alkoxýbensóata eða alkoxýcinnamats í ræktuðum sortufrumum. Chem Pharm Bull (Tókýó) 2003;51:1085e8.

24. Kanteev M, Goldfeder M, Fishman A. Structure-function fylgni í tyrosinases. Prot Sci 2015;24:1360e9.

25. Katagiri T, Okubo T, Oyobikawa M, Futaki K, Shaku M, Kawai M, et al. Hindrandi verkun 4-n-bútýlresorsínóls á sortumyndun og húðhvítandi áhrif þess. J Soc Cosmet Chem Jpn 2001;35:42e9.

26. Khatib S, Nerya O, Musa R, Shmuel M, Tamir S, Vaya J. Chalcones sem öflugir týrósínasahemlar: mikilvægi 2,4-útskipts resorsínólhluta. Bioorg Med Chem 2005;13:433e41.

27. Kim DS, Kim SY, Park SH, Choi YG, Kwon SB, Kim MK, o.fl. Hindrandi áhrif 4-n-bútýlresorsínóls á virkni tyrosínasa og myndun melaníns. Biol Pharm Bull 2005;28:2216e9.

28. Kim H, Choi HR, Kim DS, Park KC. Staðbundin blóðlitarefni fyrir litarefnissjúkdóma og verkunarmáta þeirra. Ann Dermatol 2012;24:1e6.

29. Kim YJ, Uyama H. ​​Tyrosinasa hemlar frá náttúrulegum og tilbúnum uppruna, uppbygging, hömlunarkerfi og sjónarhorn til framtíðar. Cell Mol Life Sci 2005;62:1707e23.

30. Kolbe L, Mann T, Gerwat W, Batzer J, Ahlheit S, Scherner C, et al. 4-n-bútýl resorsínól, mjög áhrifaríkur týrósínasa hemill til staðbundinnar meðferðar á oflitarefni. J Eur Acad Dermatol Venereol 2013;27: 19e23.

31. Lai X, Soler-Lopez M, Wichers HJ, Dijkstra BW. Stórfelld raðbrigða tjáning og hreinsun á týrósínasa úr mönnum sem hentar fyrir byggingarrannsóknir. PLoS One 2016;11:e0161697. 32. Lai X, Wichers HJ, Soler-Lopez M, Dijkstra BW. Uppbygging mannlegs tyrosinasa-tengts próteins 1 sýnir tvíkjarna sinkvirkan stað sem er mikilvægur fyrir sortumyndun. Angew Chem Int Ed Engl 2017;56:9812e5.

33. Lee SY, Baek N, Nam TG. Náttúrulegir, hálftilbúnir og tilbúnir týrósínasahemlar. J Enzyme Inhib Med Chem 2014;31:1e13.

34. Mann T, Gerwat W, Wenck H, Ro¨hm KH, Kolbe L. Isobutylamido thiazolyl resorcinol nýr öflugur hemill á týrósínasa manna. Litarfrumu sortuæxli Res 2017:e85.

35. Matoba Y, Kumagai T, Yamamoto A, Yoshitsu H, Sugiyama M. Kristallfræðilegar vísbendingar um að tvíkjarna koparmiðja tyrosinasa sé FL sveigjanleg við hvata. J Biol Chem 2006;281:8981e90.

35. Nesterov A, Zhao J, Minter D, Hertel C, Ma W, Abeysinghe P, et al. 1-(2,4- díhýdroxýfenýl)-3-(2,4-dímetoxý-3-metýlfenýl)própan, nýr týrósínasahemill með sterk litarfleygandi áhrif. Chem Pharm Bull (Tókýó) 2008;56:1292e6.

36. Olivares C, Garcia-Borron JC, Solano F. Auðkenning á virkum stað leifum sem taka þátt í bindingu málmþátta og staðalsérhæfðum hvarfefnisþekkingu í týrósínasa spendýra. Áhrif á hvatahringinn. Lífefnafræði 2002;41:679e86.

37. Palumbo A, d'Ischia M, Misuraca G, Prota G. Mechanism of inhibition of melanogenesis by hydroquinone. Biochim Biophys Acta 1991;1073:85e90.

38. Penney KB, Smith CJ, Allen JC. Aflitunarverkun hýdrókínóns er háð truflun á grundvallarfrumuferlum. J Invest Dermatol 1984;82:308e10.

39. Pretzler M, Bijelic A, Rompel A. Heterologísk tjáning og lýsing á virkum sveppum tyrosinasa (AbPPO4). Sci Rep 2017;7:1810.

40. Ramsden CA, Riley PA. Týrósínasi: fjögur oxunarástand virka staðarins og mikilvægi þeirra fyrir ensímvirkjun, oxun og óvirkjun. Bioorg Med Chem 2014;22:2388e95.

41. Rescigno A, Sollai F, Pisu B, Rinaldi A, Sanjust E. Tyrosinasa hömlun, almennar og beittar hliðar. J Enzyme Inhib Med Chem 2002;17:207e18.

42. Sasaki M, Kondo M, Sato K, Umeda M, Kawabata K, Takahashi Y, o.fl. Rhododendron, fenólefnasamband sem veldur aflitun, hefur frumueiturhrif sortufrumna í gegnum týrósínasaháð kerfi. Litarfrumu sortuæxli Res 2014;27:754e63.

43. Schweikardt T, Olivares C, Solano F, Jaenicke E, Garcia-Borron JC, Decker H. Þrívítt líkan af týrósínasa spendýra virka stað sem gerir grein fyrir tapi á stökkbreytingum á virkni. Pigment Cell Res 2007;20: 394e401.

44. Vísindanefnd um neysluvörur. Álit um b-arbútín; 2008 (sótt 21. nóvember 2017).

45. Vísindanefnd um neytendaöryggi. Álit á kojic sýru; 2012 (sótt 21. nóvember 2017).

46. ​​Sendovski M, Kanteev M, Ben-Yosef VS, Adir N, Fishman A. Fyrstu uppbyggingu virks bakteríutýrósínasa sýna koparmýkingu. J Mol Biol 2011;405: 227e37.

47. Shimizu K, Kondo R, Sakai K. Hindrun á tyrosinasa með flavonoids, stilbenes og tengdum 4-setnum resorcinólum: uppbyggingu-virknirannsóknir. Planta Med 2000;66:11e5.

48. Shimizu MM, Melo GA, Brombini Dos Santos A, Bottcher A, Cesarino I, Arau'jo P, o.fl. Ensímeinangrun, einangrun og cDNA klónun pólýfenóloxíðasa í hjörtum lófa þriggja viðskipta mikilvægra tegunda. Plant Physiol Biochem 2011;49:970e7.

49. Smith CJ, O'Hare KB, Allen JC. Sértæk frumudrepandi áhrif hýdrókínóns fyrir frumur sem eru fengnar af sortufrumum er miðlað af týrósínasavirkni en óháð melaníninnihaldi. Pigment Cell Res 1988;1:386e9.

50. Solano F, Briganti S, Picardo M, Ghanem G. Hypopigmenting agents: uppfærð endurskoðun á líffræðilegum, efnafræðilegum og klínískum þáttum. Pigment Cell Res 2006;19:550e71.

51. Stratigos AJ, Katsambas AD. Ákjósanleg stjórnun á þrjóskandi röskun á oflitarefni hjá dökkum sjúklingum. Am J Clin Derm 2004;5: 161e8.

52. Sugimoto K, Nomura K, Nishimura T, Kiso T, Sugimoto K, Kuriki T. Myndun a-arbútín-a-glýkósíða og hamlandi áhrif þeirra á týrósínasa manna. J Biosci Bioeng 2005;99:272e6.

53. Sun W, Wendt M, Klebe G, Ro¨hm KH. Um túlkun á týrósínasa hömlunarhvörfum. J Enzyme Inhib Med Chem 2014;29:92e9.

54. Tripathi RK, Heyrn VJ, Urabe K, Aroca P, Spritz RA. Stökkbreytingarkortlagning á hvatavirkni týrósínasa manna. J Biol Chem 1992; 267: 23707e12.

55.UniProt Consortium. UniProt: alhliða þekkingargrunnur próteina. Nucleic Acids Res 2017;45:D158e69.

56. US Food and Drug Administration, Department of Health and Human Services. Húðbleikandi lyf til notkunar í lausasölu fyrir menn; fyrirhugaða reglu. 71 Federal Register 51146-5115521 (kótað í 21 CFR Part 310); 2006.

57. Vielhaber G, Schmaus G, Jacobs K, Franke H, Lange S, Herrmann M, et al. 4-(1-fenýlmetýl)1,3-bensendíól: nýtt, mjög skilvirkt ljósaefni. Int J Cosmet Sci 2007;29:65e6. 58. Wendt M. Rationales hanna neuer tyrosinase-inhibitoren. Ph.D. ritgerð. Marburg, Þýskalandi: Læknaskóli háskólans í Marburg; 2006.

59. Ying YH, Lee SJ, Chung MH, Ying HJ, Suk JL, Myung HC, o.fl. Alósín og arbútín hamla samverkandi virkni týrósínasa með öðrum verkunarmáta. Arch Pharm Res 1999;22:232e6.

Fyrir frekari upplýsingar: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501