In vivo gjöf á bakteríum í þörmum endurtekur Urolithin Metabotypes A og B í rottalíkani sem ekki framleiðir urolithinⅠ

Í áratugi hefur neysla á ellagitannínum (ET) andelagínsýru (EA) verið tengd fjölmörgum líffræðilegum áhrifum, þar á meðal andoxunarefni, krabbameinslyfjum, bólgueyðandi, bakteríudrepandi og afritunarvirkni gegn HIV.1 Hins vegar hefur frásog og aðgengi ET og EA eru mjög lélegar. Fyrri rannsóknir á mönnum leiddu í ljós að útskilnaður EA og EA-O-glúkúróníðs í þvagi er minna en 1% af inntökunni.2,3 Engu að síður, á meðan frásog ET og EA er lágt, umbrotna þau frekar af ristli örveru í urolítín (Uros), sem bera ábyrgð, að minnsta kosti að hluta, fyrir jákvæðum áhrifum ET- og (eða) EA-ríkrar matvæla.1,4

Smelltu á hægðalyf

Í fyrsta lagi losnar EA með vatnsrofinu á estertengjum ET fyrir ensím sem kallast ellagitannasa.5 EA gengur í gegnum frekara niðurbrot og myndar 6H-díbensó[b,d]pýran-6-eina afleiðu sem kallast Uros. Þetta efnahvarfafall byrjar með laktónhringklofnun með laktónasaensími, sem leiðir til lútínsýru, sem síðan er afkarboxýleruð í pentahýdroxý-Uro (Uro-M5). Samfelld afhýdroxýlering breytir því í tetrahýdroxý-Uros (Uro-D, Uro-E, og Uro-M6) og tríhýdroxý-Uros (Uro-C, UroM7 og Uro-G), til að loksins fá díhýdroxý-Uros (Uro-A andisoUro-A) og mónóhýdroxý-Uro (Uro-B), en hið síðarnefnda greinist almennt. þegar isoUro-A er einnig framleitt.1

Hin mikla breytileiki á Uro efnaskiptasniði sem greindist hjá mönnum eftir að hafa neytt ET-ríkrar matvæla gefur til kynna innbyrðis mun á ristli örveru sem ber ábyrgð á ET niðurbroti. )fenól.6,9 Þessi tvíhliða víxlverkun milli örveru í þörmum og (fjöl)fenól hefur orðið til þess að vísindasamfélagið hefur flokkað þýðið á grundvelli þeirraefnaskiptasvipgerð (málmgerð) til að útskýra muninn á áhrifum pólýfenóla.10,11 Nánar tiltekið, samkvæmt ET og EA umbrotum, er hægt að skipta einstaklinga í úrómetabótýpur (UMs) sem tengjast samsetningu og virkni þarma örveru.7,8,12

Þremur UM-um manna (UM-A,UM-B og UM-0) sem tengjast þremur mismunandi framleiðslusniðum Uro hefur verið lýst í vestrænum og austurlenskum íbúum.13–15 Í þessu sambandi eru einstaklingar með frumgerð A (UM-A) framleiða nokkur millistig Uro en aðeins urolithin A(Uro-A), helsta frásogaða Uro í þessu UM, í lok örveruefnaskiptaferils. Metabotype B (UM-B) einstaklingar framleiða nokkur millistig Uros og þrjú endanleg Uros, þ.e. urolithin B (Uro-B), urolithin A (IsoUro-A) og Uro-A, sem eru helstu frásogaðar Uros í UM-B. Þess vegna gæti millistigið Uros virkað fyrst og fremst í þörmum, á meðan hinir síðustu gætu haft staðbundin og kerfisbundin áhrif.6 Hins vegar geta einstaklingar með málmgerð 0 (UM-0) ekki framleitt þessa endanlega Uros (aðeins Forveri Urolithin-M5 hefur fundist hingað til, sem frásogast ekki í þörmum).

Munur á Uroprofile hefur sést milli UMs og meðfram stórgirni, sem sýnir ríkjandi Uro framleiðslu á distalcolon svæðinu.16–19 Merkilegt er að UM-0 hlutfallið í spænskum og kínverskum heilbrigðum sjálfboðaliðum er um það bil 10% og gæti verið jafnvel hærra í íbúum Bandaríkjanna.13–15 Gerlaættkvíslirnar Gordonibacter og Ellagibacter hafa verið auðkenndar sem geta umbrotið EA í suma Uros.20–23Hins vegar kom í ljós að einhver millistig (til dæmis Uro-D, Uro-E, Uro- M7 og Uro-G) og endanleg Uros (Uro-A og Uro-B) eru ekki framleidd í hreinræktun þessara baktería, sem þýðir að aðrar bakteríur þurfa að fullkomna Uros-settið sem stillir bæði UM-A og UM-B . Nýlega hefur verið greint frá þarmabakteríum sem taka þátt í efnaskiptum EA til að gefa af sér frummyndandi umbrotsgerðir (UM-A og UM-B) in vitro.24

Bakteríusamstæður sem innihalda Gordonibacter plus Enterocloster ættkvíslir og Ellagibacter plus Enterocloster framleiddu in vitro urolitínin sem tengjast UM-A og UM-B, í sömu röð.25 Hins vegar er hæfni þessara bakteríuhópa til að endurtaka Uro snið manna sem tengjast UM-A og UM-B in vivo. er enn óþekkt. Ennfremur er öryggi þess að neyta þessara Uro-framleiðandi baktería sem ný probiotics enn óvíst, þar sem það hefur ekki verið prófað áður á dýrum eða mönnum. Í þessari rannsókn voru bakteríusamböndin hér að ofan metin með tilliti til getu þeirra til að landvista þörmum úr Uro-ekki-framleiðandi (UM-0-líkum) rottum og breyta þeim í Uroframleiðendur sem líkja eftir UM-A og UM-B, í sömu röð. Öryggi þessara bakteríusamtaka var einnig metið. Að auki voru tvær nýjar rauntíma magn PCR (qPCR) byggðar aðferðir þróaðar til að greina og mæla Ellagibacter og Enterocloster í saursýnum.

efni og aðferðir

Efni og hvarfefni

Uros voru efnafræðilega tilbúin og hreinsuð af VillapharmaResearch SL (Parque Tecnológico de Fuente Álamo, Murcia, Spáni). EA var keypt frá Sigma-Aldrich (St Louis, MO, Bandaríkjunum). Phosphate buffer saltine (PBS) var fengið frá FisherScientific (Bandaríkjunum), en metanól, etanól og maurasýru voru frá Panreac Química (Barcelona, ​​Spáni). Leysir úr vökvaskiljun-massagreiningu (LC-MS) voru keyptir frá JT Baker (Deventer, Hollandi). Ultrapure Millipore vatn (Bedford, MA, USA) var notað í gegnum alla rannsóknina. Öll efni og hvarfefni voru af greiningargráðu.

Undirbúningur bakteríusamtaka

Gordonibacter urolithinfaciens DSM 27213T, Ellagibacter isourolithinifaciens DSM 104140T, og Enterocloster boltað CEBASS4A9, öll einangruð og auðkennd í rannsóknarstofunni okkar (CEBAS-CSIC, Spáni), voru annáluð -Chalgren loftfirrt miðlungs (WAM, Oxoid) rör við 37 gráður í 48 klst í Concept 400 loftfirrtu hólfinu (BakerRuskin Technologies Ltd, Bridgend, Suður-Wales, Bretlandi) og sviflausnar í PBS ásamt 10% glýseróli og 0,05% L-sýsteinhýdróklóríði (PanReaklóríði) Química, Barcelona, ​​Spáni). Eftir loftfirrta ræktun voru samtök útbúin.24,25 Í stuttu máli innihélt „bakteríahópur A“ G. urolithinfaciens og E. bolteae stofnar; „bakteríahópur B“ innihélt E. isourolithinifaciens og E. bolteae ræktun; og "viðmiðunarkokteill" innihélt dauðhreinsað PBS með 10% glýseróli og 0,05% L-sýsteinhýdróklóríði. Fyrir lyfjagjöf var öllum kokkteilum dreift í 3,5 ml skammta og haldið við -80 gráður.

Dýr, mataræði og tilraunahönnun

Tilraunabókunin (tilvísun 624/2020) var samþykkt af sveitarstjórn, lífsiðanefnd spænska rannsóknarráðsins (Madrid, Spáni) og siðanefnd dýratilrauna frá háskólanum í Murcia (Spáni). Tilraunirnar fylgdu ráðleggingum Evrópusambandsins varðandi dýratilraunir (tilskipun Evrópuþingsins og ráðsins 2010/63/ESB um vernd dýra sem notuð eru í vísindaskyni). Wistar rottur (n=18; 9 kvendýr og 9 karldýr) sem vógu 240 ± 31 g voru fengnar frá Envigo (Barcelona, ​​Spáni). Þetta rottulíkan var valið út frá getu þess til að framleiða Uros sem kom fram í frumrannsóknum okkar þar sem saursýni úr mismunandi rottumódelum voru prófuð. Þrír hópar (A, B og C) voru myndaðir með því að úthluta 6 dýrum af handahófi hverju (3 kvenkyns og 3 karlkyns rottur) ) á hvern hóp (mynd 1).

Hver rottuhópur var hýstur í tveimur mismunandi búrum, skipt eftir kyni, í herbergi með hitastýrðu umhverfi (22± 2 gráður) með 55 ± 10% hlutfallslegum raka og stýrðum ljós-myrkri hringrás (12 klst.). Rotturnar fengu staðlað fæðufæði (Teklad, Barcelona, ​​Spáni) sem innihélt (%/100 g ferskþyngd) 14,3% prótein (maísglútenmjöl), 48% kolvetni (hveitimjöl, malað hveiti, malað maís) og 4% fitu (sojaolía) ), 2,9 kcal g−1 orkuþéttleiki og 4,1% hrátrefjar, ásamt EA dufti sem er meira en eða jafnt og 95% hreinleiki (3,6 mg á 100 g af kjöti). EA var blandað einsleitt við malað staðlað fóður, endurkornað og frostþurrkað. EA-auðgað mataræði var geymt fjarri raka og ljósi. EA skammturinn sem gefinn errottur í fóðrinu voru u.þ.b. 0,72 mg á rottu á dag (EA1× fæði), jafngildur skammtur fyrir menn 41 mg dag–1,26 Allir hópar fengu EA 1× fæði og kranavatn að vild í gegnum tilraunina ( 5 vikur). Þar sem EA sem fannst í saursýnum var lítið fyrstu vikuna, var nokkrum auka EA bætt við næstu daga. Í 3. viku var aukaskammtur upp á 1,5 mg EA á rottu á dag, uppleyst í vatni, gefinn um munn með magaslöngu til dýranna (heildar=EA 3× fæði), sem var aðeins gefið í 1 viku. Að lokum, í viku 4, var ≈5 g valhnetum á rottu á dag (önnur EA uppspretta) bætt við EA 1× mataræðið og þeim haldið til loka rannsóknarinnar til að meta áhrif EA sem inniheldur matarfylki á hæfni bakteríana. að framleiða Uros. Þyngd, fæðu og vatnsneysla var mæld á hverjum degi. Þarmabakteríasamböndin voru gefin til inntöku með blóðgjöf. Hópur A fékk 500 µL af bakteríukokteil A, Group B fékk 500 µL af bakteríukokteil B og C-hópur (viðmiðunarhópur) fékk 500 µL af PBS. Munngjöf var framkvæmd á tveggja daga fresti fyrstu tvær vikurnar og á hverjum degi næstu 2 vikurnar á eftir. Síðustu vikuna (daga 28 til 32) héldu dýrin áfram með sama mataræði ásamt EA og valhnetum en án inntöku baktería. Í lok rannsóknarinnar var dýrum fórnað með því að nota CO2 hólf.

Sýnatökuaðferðir

Saursýnum var safnað meðan á rannsókninni stóð fyrir Uro-greiningu með UPLC-ESI-QTOF-MS/MS og örveru í þörmum með 16S rRNAgen raðgreiningu og qPCR. Blóð var dregið út á mismunandi tímapunktum (grunnlína, dagur 28 og lok rannsóknarinnar) fyrir blóðfræðilegar og lífefnafræðilegar greiningar í sermi. Blóðsýni voru tekin úr halaæð (≈500 µL) og safnað í glös sem innihalda heparín við grunnlínu og dagana 28 og 32 (mynd 1). Plasma aðskilnaður var gerður strax með skilvindu við 3000g í 10 mínútur við 4 gráður og frystur við - 80 gráður þar til frekari ákvörðun á sermilífefnafræðilegum breytum. Lifur, nýru og milta var safnað, vigtuð og skoðuð til að greina hvers kyns formfræðilegan mun við fórn.

Hönnun og hagræðing primers og rannsaka fyrir magngreiningu Ellagibacter og Enterocloster með qPCR

Raðir af 16S rRNA genum Ellagibacter isourolithinifaciens DSM 104140T og E. bolted CEBAS S4A9 voru fengnar úr GenBank gagnagrunninum (EMBL gagnagrunninum). Röðunum var stillt saman við bakteríuna sem er fylgjendafræðilega nánu sem framkallaði sameindaþróunarerfðagreiningarhugbúnaðinn (MEGA 11) og skoðaðar með tilliti til svæða með varðveittum og breytilegum raðir til að hanna frumur og rannsaka til að greina og magngreina Ellagibacter og Enterocloster (tafla 1). Grunnur og rannsakandi var hannaður og staðfestur með Primer Questand Oligo Analyzer verkfærunum, í sömu röð (Integrated DNATechnologies, Inc., Belgíu). TaqMan rannsakandinn var merktur á 5′ og 3′ endana með 6-karboxý-flúorljómun hópi (6FAM) og brómberjaslokkari (BBQ), í sömu röð. qPCR var framkvæmt með því að nota ABI 7500 raðgreiningarkerfi. Lokastyrkur hvers frumefnis og rannsakanda var 300 og 375 nM fyrir Ellagibacter og 200 og 500 nM fyrir Enterocloster. Hefðbundin qPCR samskiptaregla var framkvæmd fyrir DNA mögnun á Ellagibacter ogEnterocloster, í sömu röð. Rampunarsniðið fyrir Ellagibacteramplification var 1 lota við 95 gráður í 5 mínútur, fylgt eftir af 45 lotum af 95 gráðum í 15 sekúndur, 50 gráður í 40 sekúndur og 72 gráður í 31 s. Að lokum var 1 lotu við 72 gráður í 5 mínútur bætt við . Rampunarsniðið fyrir Enterocloster mögnun var 1 lota við 95 gráður í 5 mínútur, fylgt eftir af 40 lotum með 95 gráðum í 15 sekúndur, 65 gráður í 40 sekúndur og 72 gráður í 31 sekúndu. Að lokum var 1 lotu við 72 gráður í 5 mín bætt við.

Saur DNA útdráttur og örverugreiningar í þörmum

DNA útdráttur úr saursýnum var framkvæmd með NucleoSpin® vefja DNA hreinsunarsettinu (Macherey-Nagel, Þýskalandi), samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda með nokkrum breytingum. DNA var magnmælt með flúormælingu (Qubit3.0 – ThermoFisher Scientific™, Bretlandi), og hreinleiki var mældur út frá gleypnihlutfalli við bylgjulengd 260/280 nm (A260/A280) (NanoDrop-ThermoFisher Scientific™, Bretlandi ). Samsetning örvera í þörmum var ákvörðuð með því að raða V3 og V4 breytilegum svæðum 16S rRNA gensins í samræmi við Illumina samskiptareglur (Illumina Inc., San Diego, CA, USA) með lestrarlengd 2 × 300 bp pöruðum enda keyrslu (MiSeqReagent Kit v3 , Illumina Inc.). Metagenomic raðgreining var framkvæmd á MiSeq-Illumina palli (FISABIO raðgreiningarþjónusta, Spáni). Gagnavinnsla, fjarlæging á kímröð, röðun raða og 16S rRNA genaþyrping var framkvæmd eins og lýst er annars staðar til að fá flokkunarfræðilegu flokkunina.8,27 Gordonibacter DNA mögnun náðist í ABI 7500 qPCR kerfi eins og áður hefur verið lýst. sérstakur frumur og rannsaka sem hannaðir voru í þessari rannsókn voru notaðir í samræmi við qPCR samskiptareglur sem lýst er hér að ofan. Erfðafræðilegar DNA-staðalferlar Gordonibacter, Enterocloster og Ellagibacter voru notaðar til magngreiningar. Öll saursýni voru greind í þríriti.

Útdráttur, uppgötvun og magngreining á urolítíni í saursýnum

Saursýni ({{0}}.2–0,5 g) voru dregin út, í hlutfallinu 1:10, með lausn af MeOH/H2O (8{{ 20}}/20), sýrður með 0,1% HCl og einsleitur með því að hringsnúast í 2 mínútur og hrista við 1500 snúninga á mínútu við stofuhita í 10 mínútur í blokkhitara. Sviflausnin var skilin í skilvindu við 14 000g við 4 gráður í 10 mínútur og flotið var síað í gegnum 0,22 µm PVDF himnusíu (Millipore Corp., Bedford, MA) og þynnt 3x með MeOH (0,1% maurasýru) ) fyrir inndælingu í UPLC-ESI-QTOF-MS kerfi. UPLC kerfi (Agilent 1290Infinity) tengt fjórpóla flugtíma (QTOF) LC/MSsystem (6550 Accurate-Mass) (Agilent Technologies, Waldbronn, Þýskalandi) var notað til að greina saurefnabrotsefnin með því að nota hallaskolunaraðferð eins og áður hefur verið lýst. .29,30 Í stuttu máli var aðskilnaður framkvæmdur í aPoroshell 120 EC-C18 öfugfasa súlu, með því að nota vatn og asetónítríl, bæði sýrt með 0,1% maurasýru, sem farfasa. Rennslishraði var 0,4 mL mín−1 og inndælingarrúmmál var 5 μL. MassHunter Qualitative Analysis hugbúnaðurinn (útgáfa B.10, Agilent Technologies, Waldbronn, Þýskalandi) var notaður við gagnavinnslu. Öll umbrotsefni voru auðkennd með beinum samanburði við staðla og staðfest með mólmassa þeirra. Kvörðunarferlar fengust fyrir EA og mismunandi Uros með góðu línuleika (R2 > 0,99).

Blóðafræði og klínísk efnafræði

Blóðfræðilegar breytur voru ákvarðaðar í lifrarblóði með því að nota sjálfvirkan blóðgreiningartæki með sérstökum hugbúnaði fyrir blóðsýni úr rottum (AVDIA 120, Siemens, Munchen, Þýskalandi). Breyturnar sem greindar voru voru meðaltal blóðrauða (MCV), meðaltal blóðrauða (MCH), meðalþéttni blóðrauða (MCHC), rauðkornadreifing (RDW), meðaltal blóðflagna (MPV), blóðflagnakorn (PCT), breidd blóðflagna (PDW) , meðalblóðflöguþáttur (MPC), meðalfjöldi blóðflagna (MPM), blóðflagnafjöldi (PLT), blóðrauðainnihald netfrumna (CHr), og meðalrúmmál netfrumna (MCVr). Lífefnafræðilegar breytur í plasma, kalsíum (Ca) og fosfór (P) voru greind með Olympus AU400 efnafræði- og eiturefnagreiningartæki (Beckman Coulter, Kaliforníu, Bandaríkjunum). Lífefnafræðilegu breyturnar voru heildarprótein (PROT), albúmín (ALBU), glóbúlín (GLOB), kreatínín (CREA), glúkósa (GLUC), kólesteról (CHOL), þríglýseríð (TRIGL), basískur fosfatasi (ALP), gamma-glútamýl transpeptíðasi ( GGT), aspartat amínótransferasi (AST) og alanín amínótransferasi (ALT). Að lokum var styrkur týroxíns (T4) greind með IMMULITE® 1000 ónæmisprófunarkerfi (Siemens).

tölfræðigreining

Gögnin eru gefin upp sem meðaltal ± staðalfrávik (SD). Tölfræðileg greining var gerð með SPSS hugbúnaðarútgáfu 27.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, Bandaríkjunum), og munur með p < 0.05 voru taldar tölfræðilega marktækar. Eðlileiki gagna var metinn með Shapiro–Wilk prófinu. Samanburður á milli mismunandi meðferðarhópa var gerður með því að nota endurtekna mælda dreifnigreiningu (RM ANOVA) með Tukey's eða Dunnett's T3 post hoc prófi, eftir því hvort gögnin fylgdu eðlilegri eða óeðlilegri dreifingu, í sömu röð. Munur á körlum og konum var kannaður með því að nota paraða t-próf ​​nemenda eða Wilcoxon signedrank próf þegar gögn voru eðlilega eða óeðlilega dreifð, í sömu röð. Chi-quare linear discriminant analysis effectsize (LEfSe) var notað til að greina mismunandi bakteríueiginleika á milli hópa. Pearson fylgni var notuð til að greina möguleg tengsl milli breyta í normaldreifðum gögnum á meðan Spearman fylgni var beitt í ónormaldreifðum gögnum. Gagnalotur voru gerðar með Sigma Plot 14.5 (Systat Software, San Jose, CA, Bandaríkjunum).

Náttúruleg jurtalyf til að létta hægðatregðu-Cistanche

Cistanche er ættkvísl sníkjudýra sem tilheyrir fjölskyldunni Orobanchaceae. Þessar plöntur eru þekktar fyrir lækningaeiginleika sína og hafa verið notaðar í hefðbundinni kínverskri læknisfræði (TCM) um aldir. Cistanche tegundir finnast aðallega í þurrum og eyðimerkursvæðum í Kína, Mongólíu og öðrum hlutum Mið-Asíu. Cistanche plöntur einkennast af holdugum, gulleitum stönglum og eru mjög metnar fyrir hugsanlegan heilsufarslegan ávinning. Í TCM er talið að Cistanche hafi styrkjandi eiginleika og er almennt notað til að næra nýru, auka orku og styðja við kynlíf. Það er einnig notað til að takast á við öldrun, þreytu og almenna vellíðan. Þó að Cistanche hafi langa sögu um notkun í hefðbundinni læknisfræði, eru vísindarannsóknir á verkun og öryggi í gangi og takmarkaðar. Hins vegar inniheldur það ýmis lífvirk efnasambönd eins og fenýletanóíð glýkósíð, iridoids, lignans og fjölsykrur, sem geta stuðlað að lækningalegum áhrifum þess.

Wecistanchecistanche duft, cistanche töflur, cistanche hylki,og aðrar vörur eru þróaðar með því að notaeyðimörkcistanchesem hráefni sem öll hafa góð áhrif á hægðatregðu. Sérstakur búnaðurinn er sem hér segir: Cistanche er talinn hafa hugsanlegan ávinning til að létta hægðatregðu á grundvelli hefðbundinnar notkunar þess og ákveðinna efnasambanda sem það inniheldur. Þó að vísindalegar rannsóknir sérstaklega á áhrifum Cistanche á hægðatregðu séu takmarkaðar, er talið að þær hafi margar aðferðir sem gætu stuðlað að möguleikum hennar til að létta hægðatregðu. Hægðalosandi áhrif:Cistanchehefur lengi verið notað í hefðbundinni kínverskri læknisfræði sem lækning við hægðatregðu. Talið er að það hafi væg hægðalosandi áhrif, sem getur hjálpað til við að stuðla að hægðum og framkalla hægðatregðu. Þessi áhrif má rekja til ýmissa efnasambanda sem finnast í Cistanche, svo sem fenýletanóíð glýkósíðum og fjölsykrum. Raka í þörmum: Byggt á hefðbundinni notkun er Cistanche talin hafa rakagefandi eiginleika, sérstaklega miða á þörmum. Að stuðla að vökvun og smurningu í þörmum getur hjálpað til við að mýkja verkfæri og auðvelda yfirferð og þar með létta hægðatregðu. Bólgueyðandi áhrif: Hægðatregða getur stundum tengst bólgu í meltingarvegi. Cistanche inniheldur ákveðin efnasambönd, þar á meðal fenýletanóíð glýkósíð og lignans, sem talið er að hafi bólgueyðandi eiginleika. Með því að draga úr bólgu í þörmum getur það hjálpað til við að bæta hægðatregðu og létta hægðatregðu.