Bætt hlutgreiningarminni með eftirkóðun endurtekinni segulörvun um höfuðkúpu 2. hluti

3. Úrslit

Við notuðum ORT með {{0}} klst seinkun á milli sýnatöku og prófunarfasa til að meta virkni rTMS á minni. Enginn munur var á OFT virkni og könnunartímum hluta í sýnatöku og prófun milli SHAM v TMS (p > 0,05, mynd 1BD).

Minni er ómissandi hluti af lífinu, hjálpar okkur að skrá, rifja upp og álykta fyrri reynslu, og hefur einnig áhrif á ákvarðanir okkar um framtíðina.

Oft er litið á minnið sem eina af birtingarmyndum mannlegrar greind og það getur breyst í samræmi við ýmislegt nám og reynslu sem einstaklingur lendir í. Hjá flestum hefur minnið tilhneigingu til að minnka lítillega þegar fólk eldist, en það er hægt að bæta með stöðugri hreyfingu og þjálfun.

Skilvirkni minni er líka mjög mikilvægur þáttur. Skilvirkt minni getur hjálpað okkur að skilja betur reynslu okkar og þekkingu og eiga betri samskipti við aðra. Það getur líka hjálpað okkur að takast betur á við áskoranir og álag og ná meiri árangri í námi og starfi.

Þess vegna þurfum við að læra hvernig á að bæta skilvirkni og styrk minni okkar. Þetta felur í sér að þróa góðar minnisvenjur, svo sem að koma á skilvirkum aðferðum til að skrifa athugasemdir og búa til skilvirkt minnisumhverfi. Við getum líka bætt minni með því að taka þátt í heilbrigðum lífsstíl, eins og að fá nægan svefn og hreyfa sig rétt.

Í stuttu máli, skilvirkni og styrkur minnis er mjög mikilvægt fyrir líf okkar. Með því að nota jákvæðar aðferðir og nálganir til að bæta minni okkar og skilvirkni getum við tekist betur á við daglegt líf okkar og náð betri árangri í persónulegum og faglegum markmiðum okkar. Það má sjá að við þurfum að bæta minnið og Cistanche getur bætt minnið verulega því Cistanche er hefðbundið kínverskt lækningaefni með mörg einstök áhrif, ein þeirra er að bæta minni. Áhrif Cistanche koma frá hinum ýmsu virku innihaldsefnum sem það inniheldur, þar á meðal tannínsýru, fjölsykrur, flavonoid glýkósíð osfrv. Þessi innihaldsefni geta stuðlað að heilsu heilans á marga vegu.

Smelltu á Vita leiðir til að bæta minni

Þar að auki var engin hlutdrægni fyrir staðsetningu hlutar í öflunartilrauninni (p > {{0}}.05, gögn ekki sýnd). Mýsnar sem fengu TMS yfir 72- klst. höfðu marktækan mismununarstuðul fyrir nýja hlutinn (Einstefnu t-próf ​​t(9) ¼ 3.067, p ¼ 0,0134), en SHAM mýs gerðu það. ekki (Ein leið t-próf ​​t(10) ¼ 0,705, p ¼ 0,496).

Þegar þessar tvær mismununarvísitölur voru bornar saman var TMS marktækt hærra en SHAM (T-próf ​​nemenda t(19) ¼ 2.77,p ¼ 0.0122, mynd 1E). Að auki var aðeins hópurinn sem fékk TMS með marktækt t- Við greindum einnig muninn innan hvers meðferðarhóps um könnun á skáldsögunni og kunnuglega hlutnum og fundum marktækan mun á hlutnum sem var kannað og meðferðin sem gefin var (Two Way Repeated Measures ANOVA F(1) ,19) ¼ 8,305, p ¼ 0,0096, hp2¼,304 mynd 1F).

Post-hoc greining sýndi að TMS hópurinn hafði marktæka aukningu á nýrri hlutakönnun (p ¼ 0.0092), en enginn munur á SHAM hópnum (p > 0,05), sem bendir til þess að rTMS á milli nám og endurheimtur styrktu minnið betur.

Í kjölfar þessarar niðurstöðu höfðum við áhuga á að skilja taugalíffræðilegar breytingar sem tengjast bættri minnisgetu hjá músum sem fengu rTMS. Við notuðum Western Blot til að greina magn CREB, CAMKII og ERK og fosfórun þeirra með því að nota Full homogenate frá hippocampus og FC (mynd 2).

Í hippocampus, á heildina litið, varð breyting á magni CREB (One-Way ANOVA F(2,15) ¼ 6,20 p ¼ 0.013,hp2¼.488 mynd 2a). Post-hoc greining leiddi í ljós að þetta var dregið af aukningu á CREB í báðum hópunum sem gerðu hegðunarprófið, SHAM (p ¼ 0,048) og TMS (p ¼ 0,016) samanborið við CONTROL hópinn.

Hins vegar var það fosfórun CREB sem virtist eingöngu hafa áhrif á rTMS í hippocampus (Einstefnu ANOVA F(2,15) ¼ 11.813 p ¼ 0.00 1, hp2¼.645 mynd. 2a), sýndi aspost-hoc greining að mýsnar sem fengu rTMS höfðu marktækt meira magn af pCREB en CONTROL (p ¼ 0.001) og SHAM hópurinn (p ¼ 0.041).

Að auki fundum við áhrif á magn pCAMKII (Einátta ANOVA F(2,15) ¼ 4.817 p ¼ 0.029,hp2¼.445, mynd 2d), þar sem svipað og pCREB post-hoc prófanir sýndu að rTMS jók magn pCAMKII samanborið við CONTROL hópinn (p ¼ 0.027). Í ennisberki virtist fosfórun CREB vera fyrir áhrifum af rTMS (One-Way ANOVA F( 2,15) ¼ 10.572p ¼ 0.003, hp2¼.658, mynd 2b).

Post-hoc greining sýndi að mýsnar sem fengu rTMS höfðu marktækt meira magn af pCREB en CONTROL hópurinn (p ¼ 0.002)/Það var líka áhrif á pCAMKII í FC ( Einstefnu ANOVA F(2,15) ¼ 6.452 p ¼ 0.011,hp2¼.498, mynd 2e), hins vegar sýndi posthoc greining að það var óháð meðferð sem bæði SHAM (p ¼ 0,016) og TMS(0,035) hópar höfðu aukið pCAMKII samanborið við CONTROL hópinn.

Í FC var aukið pCAMKII vegna aukinnar fosfórunar á núverandi CAMKII, þar sem hlutfall pCAMKII í CAMKII var einnig aukið með hegðunarprófinu (One-WayANOVA F(2,15) ¼ 7.387 p ¼ 0.{{11 }}07, hp2¼.532, mynd 2e). Post-hoc prófanir sýndu að bæði SHAM (p ¼ 0,026) og TMS (0,010) höfðu marktækt stærri hlut en CONTROL. Í bæði hippocampus og FC sáum við engar marktækar breytingar á ERK eða fosfórun þess eftir rTMS.

Við notuðum Western Blot á Synaptic homogenates frá hippocampus og FC til að ákvarða áhrif rTMS á mismunandi taugamótaviðtaka sem taka þátt í námi og minni.

Við skoðuðum breytinguna á AMPA viðtaka undireiningum GluR1 og GluR2, sem og BDNF viðtaka TrkB. Í hippocampus var munur á magni GluR2 (Welch Test F(2,15) ¼ 6,718 p < 0.001, mynd 3g) og pGluR2 (Ein-Way ANOVA F( 2,15) ¼ 7.189 p ¼ 0.023, hp2¼.461, mynd 3g).

Post-hoc greining leiddi í ljós að SHAM mýs höfðu minna GLUR2 en CONTROLS (Games-Howell p ¼ 0.022) og mýsnar sem fengu rTMS meðferð höfðu marktækt hærra magn af bæðiGluR2 (Games-Howell p ¼ { {10}}.037) og pGluR2 (p < 0.05) en SHAM mýsnar. Í hippocampus fundum við einnig breytingar á pTrKB(One-Way ANOVA F(2,15) ¼ 8.449 p ¼ 0.005, hp2¼.585, mynd 3J).

Aspost-hoc próf sýndu að bæði SHAM mýsnar (p ¼ 0.008) og TMS mýs (p ¼ 0,013) höfðu minna pTRKb en CONTROL það bendir til þess að þessi áhrif hafi verið tengd hegðunarprófinu og óháð meðferð .

Þessi áhrif voru einnig vegna breytinga á hlutfalli heildarTrkB sem var fosfórýlerað (Einátta ANOVA F(2,15) ¼ 8.882p ¼ 0.{{10}}04, hp2¼ .597, mynd 3J), bæði SHAM (p ¼ 0,042) og TMS (p ¼ 0,004) voru marktækt lægri en CONTROL.

Einu áhrifin á GluR1 fundust í FC þar sem breyting var á hlutfalli GluR1 fosfórýleraðs á S845 staðnum, pGluR1(845) (Einstefnu ANOVA F(2,15) ¼ 4,170 p ¼ 0,040 , hp2¼.391, mynd 3e), en ekki S831 vefsvæðið.

Post-hoc greining sýndi að það var lækkun eftir rTMS samanborið við CONTROLS (p ¼ 0.038). Engin breyting var á GluR2 viðtökum í FC, en við fundum áhrif á magn af TrkB (Ein-Way ANOVAF(2,15) ¼ 13,601 p ¼ 0,001, hp2¼.712, mynd 3K) og pTrkB (Welch TestF(2,15) ¼ 4.745 p ¼ 0.035, mynd 0.035 ).

Post-hoc greining sýndi að þessi áhrif voru aðeins vegna hækkunar á magni eftir rTMS meðferð samanborið við viðmið fyrir bæði TrkB (p ¼ 0.001) og pTrKB(Games-Howell p ¼ 0,037) .

Þar sem enginn munur var á hlutfalli pTrKb og TrkB (mynd 3K) bendir þetta til þess að ólíkt hippocampus hafi breytingin á pTrkB verið afleiðing af heildaraukningu á TrKB.

Að lokum könnuðum við áhrif rTMS örvunar á að auka og viðhalda taugamótatengingum á svæðum heilans sem taka þátt í ORT. Við notuðum ónæmisvefjaefnafræði til að ákvarða samlokuð presynaptic (SV2A) og postsynaptic (PSD95) puncta til að gefa til kynna hlutfall virkra, tengdra taugamóta á þessum svæðum.

Á heildina litið varð breyting á fjölda samstaða taugamóta á CA1 svæðinu í hippocampus (OneWay ANOVA F(2,16) ¼ 4.231 p ¼ 0.038, hp2¼.377, mynd 4a ), EC(Einátta ANOVA F(2,16) ¼ 4.658 p ¼ 0.030, hp2¼.392, mynd. 4c) og PC-tölvan (Einátta ANOVA F(2,16) ¼ 7.895 , p ¼ 0,006, hp2¼.548, mynd 4d).

Bæði á CA1 svæðinu og PC var aukin samsetning í TMS hópnum til CONTROL (CA1 p ¼ 0.031, PCp ¼ 0.005), Hins vegar á EB var aukning frá CONTROL í bæði SHAM (p ¼ 0,047) og TMS (p ¼ 0,022) hópnum, sem bendir til heildaráhrifa hegðunarprófsins á þessu svæði með litlum áhrifum meðferðarinnar. Við sáum engar marktækar breytingar á FC.

4. Umræður

Niðurstöður okkar sýna að rTMS ef það er gefið á milli kóðunar og endurheimtar bætir minni í ORT hjá músum. Þessar niðurstöður endurspegla rannsóknir á mönnum sem hafa sýnt svipuð áhrif eftir encodingrTMS eða annars konar óífarandi heilaörvun, sem hefur bætt minni [2,3].

Rannsóknir á nagdýrum hafa aðallega einbeitt sér að forkóðun rTMS til að bæta minni í fortíðinni [29e32], því hafa taugalíffræðilegir aðferðir sameiningarmiðaðrar rTMS ekki verið rannsakaðar, jafnvel þó að það sé skilvirkara til að bæta minni en aðrir örvunartímar [1].

Vísbending um viðvarandi LTM er myndun sterkra, stöðugra taugasambanda. Í bæði PC og CA1 höfðu aðeins mýsnar sem höfðu rTMS auknar taugamótunartengingar samanborið við CONTROL mýsnar, á meðan SHAM mýs gerðu það ekki.

Tölvan og dorsal CA1 eru mikilvæg í hlutgreiningarminni með mismunandi aðferðum [33]. Þó að PC-tölvan sé þátttakandi í því að bera kennsl á hluti út frá nýjung þeirra eða kunnugleika, tekur hippocampus þátt í að kóða tilteknar hlutupplýsingar frá skynörvun inn í minni [33e35]. Þar sem bæði svæðin höfðu auknar taugamótunartengingar í rTMS músunum, sem höfðu bætt minni, bendir þetta til þess að örvunin hafi viðhaldið báðum mikilvægu tengingunum á þessum svæðum sem kóða bæði upplýsingar um hlut og kunnugleika.

Ein mest sláandi líffræðilega breytingin sem við sáum var aukning á tjáningu GluR2 við taugamót hippocampus eftir að rTMS meðferð bætti minni samanborið við minnkun hjá SHAM músunum.

Þetta var í mótsögn við mjög litla breytingu á GluR1 tjáningu. Fyrri rannsóknir hafa sýnt aðGluR2 viðtakar eru mikilvægir fyrir LTM geymslu og að fjarlægjaGluR2 viðtaka úr taugamótinu tekur þátt í að gleyma [36]. Á móti kemur að blokkun GluR2 endocytosis kemur í veg fyrir að ótilraunastillingar gleymist [37].

Það hafa aðeins verið nokkrar rannsóknir sem hafa sýnt misvísandi vísbendingar um áhrif rTMS á GluR2 viðtaka [26,38,39]. Við teljum að niðurstöður okkar sýni einstök áhrif þar sem rTMS var parað við námsverkefnið sem leiddi til þess að GluR2 viðtaka gleymdist og tapaðist í SHAM músunum.

Þess vegna hefur í fyrsta skipti sýnt að rTMS getur stuðlað að stöðugleika GluR2 viðtaka við taugamót um hlutgreiningarverkefnið, sem eins og sýnt hefur verið fram á í fyrri bókmenntum, er mikilvægt til að viðhalda minni [36,37].

Athyglisvert í FC var að rTMS tengdist aukningu á TrKB og fosfórun TrKB, en í hippocampus minnkaði minnisverkefnið pTrkB tjáningu. Hreyfifræði TrkB við taugamótin er háð mörgum þáttum, þar sem TrkB getur verið innrætt á taugamótinu þegar BDNF binst [40].

Hins vegar, lengri virkjunartímabil BDNF leiða til stöðugrar uppstjórnunar TrkB á meðan tímabundin BDNF eykur TrkB aðeins tímabundið [41]. Þess vegna getur mismunandi tjáning FC og hippocampus TrkB verið vísbending um svæðissértæk áhrif BDNF.

Í hippocampus gæti TrkB innbyrðis hafa átt sér stað í bæði SHAM og TMS músunum sem svar við hegðunarprófinu, þar sem framkvæmd prófunarstigsins gæti hafa valdið einhvers konar endurþéttingu námstilviki í báðum þessum hópum, sem hefði virkjað stutta BDNF svörun [42e44 ]. Þar sem fyrri rannsóknir hafa sýnt bein aukningu á BDNF frá rTMS [18e20] í FC, en viðvarandi aukning á BDNF frá örvun á þremur dögum gæti hafa stuðlað að uppstjórnun og flutningi TrkB í taugamótin [41].

Að auki hefðu áhrif hegðunarprófsins sem veldur innbyrðis TrkB ekki átt sér stað í FC eins og það gerði í hippocampus, þar sem FC á ekki þátt í viðurkenningarminni [45e47]. Þetta var einnig sýnt fram á í rannsókn okkar þar sem engin breyting var á synaptic tengingum á þessu svæði. Framtíðarrannsóknir ættu að kanna rTMS á móti hegðunarprófaáhrifum í frekari smáatriðum til að ákvarða nákvæmlega þennan gang.

Af niðurstöðum okkar virðast vera sterk tengsl á milli CREB og bættrar minnisgetu hjá músunum sem fengu TMS. Á heildina litið sáum við hækkað magn af CREB og fosfórun þess í bæði hippocampus og FC. Þessi niðurstaða má tengja við fyrri rannsóknir sem hafa einnig sýnt getu rTMS til að auka CREB tjáningu og fosfórun þess [20,21].

Aukið pCREB er mikilvægt fyrir umritunarvirknina sem þarf til að breyta skammtímaminni í stöðugt LTM [48e50] og lokun á CREB kemur í veg fyrir styrkingu minnis á klukkutímunum eftir námsviðburðinn [51]. Þess vegna, á samstæðustigi, væri mikilvægt ef rTMS gæti aukið pCREB. Hins vegar er hlutverk langvarandi virkjunar CREB óljósara.

Þessi rannsókn sýnir að fosfórun á CREB tengdist bættu minni og gæti því verið mikilvæg í þeim bættu minnisframmistöðu sem við sáum hjá músunum sem fengu rTMS.

CREB virkjun getur komið frá mörgum synaptic leiðum. Því miður ákvað þessi rannsókn ekki nákvæma leið sem myndi leiða til hækkaðs pCREB. Fosfórun CAMKII var aukin bæði í hippocampus og FC sem gæti valdið aukinni CREB fosfórun [9e11].

Þar sem rTMS breytir Ca2þ-stigi innan taugafrumna [18], gæti þessi virkjun CAMKII veitt beina leið til að virkja CREB, auk þess hefur CAMKIIvirkjun verið beintengd GluR2 virkni [52].

Hins vegar, í FC, höfðu SHAM mýsnar einnig hækkað CAMKII en ekki CREB eðaGluR2. Synaptic litunin leiddi í ljós að hippocampus gegnir stærra hlutverki í hlutgreiningarminni en FC, þannig að það eru kannski aðrar stjórnunarleiðir sem studdu virkjun CREB frá CAMKII eftir rTMS í hippocampus en ekki FC. Út frá þessari rannsókn er erfitt að greina hvort endurbæturnar frá rTMS hafi eingöngu verið vegna örvunarinnar sem gefin var 3 hpost-kóðun eða örvunarinnar sem gefin var innan 72-klst.

Singular consolidating áreiti eru áhrifarík til að bæta minni í rannsóknum á mönnum [3], en í rannsóknum á nagdýrum er stöðug endurvirkjun minnisferla nauðsynleg fyrir LTM viðhald [17].

Að auki, út frá niðurstöðum í þessari rannsókn, getum við ekki greint hvort bætt minni eða taugalífefnafræðilegar breytingar hafi stafað af rTMS örvuninni meðan á styrkingarfasanum stóð sem bætti minnisþéttingu eða hvort það var aukabúnaður sem breytti endurheimt minni óháð samþjöppun.

Niðurstöður þessarar rannsóknar sýna bæði skammtímabreytingar á fosfórun próteina sem þarf frá samþjöppun taugamóta og langtímabreytingar á stöðugum taugamótatengingum sem þarf til að viðhalda minni. Þess vegna mun mikilvægt fyrir framtíðarrannsóknir að bera saman áhrif mismunandi örvunartímapunkta og samanburðarhópa sem ekki eru rannsakaðir til að ákvarða nákvæma aðferð.

5. Niðurstaða

Saman benda niðurstöðurnar til þess að með því að stuðla að meiri synapticGluR2 og koma í veg fyrir innfrumumyndun þess, auk þess að viðhalda taugamótatengingum í tölvunni og hippocampal CA1, geti rTMS bætt minni í hlutgreiningarprófinu.

Við fundum vísbendingar um að þessar breytingar væru hugsanlega tengdar CAMKII og CREB brautum í hippocampal taugafrumum. Þessar niðurstöður styrkja enn frekar og skila rTMS í samþjöppunarfasa fyrir LTM og breyting á taugamótun, sem gæti haft meiri áhrif á klínískt taugamótunarsvið, ekki aðeins til að bæta minni heldur einnig í þeim tilvikum þar sem meiri varðveisla upplýsinga er gagnleg, til dæmis sálfræðimeðferð [53].

Framtíðarrannsóknir gætu notað svipaðar aðferðir til að bera saman styrkingu og viðhaldsörvun til að ákvarða beint sameindakerfið sem stuðlar að áhrifunum, sem og ákvarða hvort þessi áhrif gætu verið framlengd með langvarandi viðhalds rTMS.

Yfirlýsing um höfundarframlag CRediT

AM Heath: Hugmyndagerð, formleg greining, rannsókn, ritun upprunalegu uppkastsins. M. Brewer: Rannsókn. J. Yesavage: Umsjón, skrif og endurskoðun og klipping. MW McNerney: Eftirlit, auðlindir, fjármögnunaröflun, skrif og endurskoðun og klipping.

Viðurkenningar

Höfundarnir vilja þakka Dr. Eugeniu Poh fyrir að útvega mynd sína til notkunar í handritinu. Höfundar vilja einnig að Ass. Prófessor Jennifer Roger fyrir að útvega sérsniðið TMS sem notað er í þessari rannsókn.

Þessi vinna var studd af Department of Veteran's Affairs [styrkur númer 5IK2BX004105-2]. Upplýsingar í þessu skjali endurspegla ekki skoðanir Bandaríkjastjórnar, Department of Veteran's Affairs eða Stanford University School of Medicine.

Heimildir

[1] Yeh N, Rose NS. Hvernig er hægt að nota segulörvun um höfuðkúpu til að móta þáttaminni?: kerfisbundin endurskoðun og meta-greining. FrontPsychol 2019;10:993.https://doi.org/10.3389/fpsyg.2019.00993.

[2] Turriziani P, Smirni D, Zappala G, Mangano GR, Oliveri M, Cipolotti L. Auka minnisframmistöðu með rTMS hjá heilbrigðum einstaklingum og einstaklingum með væga vitræna skerðingu: hlutverk hægri dorsolateral prefrontal cortex. Front Hum Neurosci 2012;6:62.https://doi.org/10.3389/fnhum.2012.00062.

[3] Sandrini M, Censor N, Mishoe J, Cohen LG. Orsakahlutverk prefrontal heilaberki í styrkingu tímabundinna minninga með endurþéttingu. Curr Biol2013;23:2181e4.https://doi.org/10.1016/j.cub.2013.08.045.

[4] Nilakantan AS, Bridge DJ, Gagnon EP, VanHaerents SA, Voss JL. Örvun á aftari cortical-hippocampal netinu eykur nákvæmni minnisminni. Curr Biol 2017;27:465e70.https://doi.org/10.1016/j.cub.2016.12.042.

[5] Bekinschtein P, Cammarota M, Igaz LM, Bevilaqua LRM, Izquierdo I, Medina JH. Viðvarandi langtímaminnisgeymslu krefst síðbúins próteinmyndunar og BDNF-háðs fasa í hippocampus. Neuron 2007;53:261e77.https://doi.org/10.1016/j.neuron.2006.11.025.

[6] Bailey CH, Kandel ER, Harris KM. Byggingarhlutir taugamótunarmýkingar og styrkingar minnis. Cold Spring Harb Perspect Biol 2015;7:a021758.https://doi.org/10.1101/cshperspect.a021758.

[7] Rossato JI, Bevilaqua LRM, Myskiw JC, Medina JH, Izquierdo I, Cammarota M. Um hlutverk hippocampal próteinmyndunar í þéttingu og þéttingu hlutþekkingarminni. Lærðu Mem 2007;14:36e46.https://doi.org/10.1101/lm.422607.

[8] Cunha C, Brambilla R, Thomas KL. Einfalt hlutverk BDNF í námi og minni? Front Mol Neurosci 2010;3.https://doi.org/10.3389/neuro.02.001.2010.

[9] Yan X, Liu J, Ye Z, Huang J, He F, Xiao W, o.fl. CaMKII-miðluð CREB-fosfórun tekur þátt í Ca(2þ)-framkölluðum BDNF mRNA umritun og taugaútvexti sem stuðlað er að raförvun. PLoS One 2016;11:e0162784.https://doi.org/10.1371/journal.pone.0162784.

[10] Deisseroth K, Bito H, Tsien RW. Merki frá taugamótum til kjarna: postsynaptic CREB fosfórun við margs konar mýkt taugamóta í hippocampus. Neuron 1996;16:89e101.https://doi.org/10.1016/S0896-6273(00)80026-4.

[11] Ahmed T, Frey JU. Mjúkleikasértæk fosfórun á CaMKII, MAP-kínasa og CREB meðan á seint-LTP stendur í hippocampal sneiðum í rottum in vitro. Taugalyfjafræði 2005;49:477e92.https://doi.org/10.1016/j.neuropharm.2005.04.018.

[12] Kristensen AS, Jenkins MA, Banke TG, Schousboe A, Makino Y, Johnson RC, et al. Vélbúnaður Ca2þ/calmodulin-háðrar kínasa II stjórnun á AMPAreceptor gating. Nat Neurosci 2011;14:727e35.

For more information:1950477648nn@gmail.com