Hvernig á að tjá í nýrum og þvagfærum manna með vörn manna 5

Fyrir frekari upplýsingar:ali.ma@wecistanche.com

John David Spencer o.fl

Ágrip

Bakgrunnur:Aðferðirnar sem viðhalda ófrjósemi í þvagfærum eru ófullkomnar skildar. Nýlegar rannsóknir hafa bent á mikilvægi örverueyðandi peptíða (AMP) til að vernda þvagfærin gegn sýkingu. Hér auðkennum við tjáningu og mikilvægi AMP manna alfa-defensíns 5 (HD5) í mönnumnýruog þvagfærum hjá venjulegum og sýktum einstaklingum.

Aðferðafræði/Meginniðurstöður:Notkun RNA einangraðs úr mönnumnýru, þvagrásarvef og þvagblöðruvef, gerðum við megindlega rauntíma PCR til að sýna að DEFA5, genið sem kóðar HD5, er myndað tjáð um þvagfærin. Með nýrnabólgu jókst DEFA5 tjáning marktækt ínýru. Með því að nota ónæmisblóðgreiningu jókst framleiðsla HD5 einnig með nýrnabólgu. Ónæmislitun staðfærði HD5 í þvagblöðru í þvagblöðru og þvagrás. Í nýrum var HD5 fyrst og fremst framleitt í fjarlægum nýrnahettum og safnpíplum. Með því að nota immunoblot og ELISA mælingar, greindist HD5 ekki venjulega í ósýktum þvagsýnum úr mönnum á meðan þvagmyndun HD5 jókst með E.coli þvagfærasýkingu.

Ályktanir/Merki:DEFA5 er tjáð um þvagfærin hjá einstaklingum sem ekki eru sýktir. Sérstaklega er HD5 tjáð um þvagþekjuna í neðri þvagfærum og í safnpíplumnýru. Með sýkingu eykst HD5 tjáning ínýru, og magn verður greinanlegt í þvagi. Að því er við vitum eru niðurstöður okkar þær fyrstu til að mæla HD5 tjáningu og framleiðslu í nýrum manna. Þar að auki er þetta fyrsta skýrslan sem greinir tilvist HD5 í sýktum þvagsýnum. Niðurstöður okkar benda til þess að HD5 gæti gegnt mikilvægu hlutverki við að viðhalda ófrjósemi í þvagfærum.

Cistanche UK fyrir nýrnasjúkdóm, smelltu hér til að fá sýnishornið

Kynning

Þvagfærin, fyrir utan þvagrásina, eru yfirleitt dauðhreinsuð þrátt fyrir nálægð við saurflóru. Nákvæmar aðferðir þar sem þvagfærin halda ófrjósemi sinni eru ekki vel skilin. Fyrirhugaðar aðferðir sem stuðla að vörn þvagfæranna eru þvagflæði, breytingar á sýrustigi þvags og osmolarity, regluleg tæming þvagblöðru, efnavarnarþættir úrepithelium og þekjulosun/innstreymi áhrifaónæmisfrumna með bakteríuörvun [1]. Að auki hefur nýlega verið sýnt fram á að örverueyðandi peptíð (AMP) gegna mikilvægu hlutverki við að viðhalda ófrjósemi í þvagfærum [2]. AMP, sem þjóna sem náttúruleg sýklalyf framleidd af næstum öllum lífverum, eru alls staðar nálægur hluti af meðfædda ónæmiskerfinu. AMP eru katjónískar sameindir sem tjáðar eru af átfrumuhvítum frumum og þekjufrumum. Hjá mönnum og öðrum spendýrum eru defensin stór fjölskylda AMPs. Defensín hafa venjulega breiðvirka sýklalyfjavirkni gegn gram-jákvæðum og gram-neikvæðum bakteríum, veirum, sveppum og frumdýrum [2,3]. Defensín eru upphaflega mynduð sem forpróprótein og gangast undir vinnslu til að verða þroskuð, líffræðilega virk peptíð [4]. Hjá mönnum eru defensin flokkuð í eina af tveimur fjölskyldum eftir tvísúlfíðbrúunarmynstri þeirra - alfa-defensin eða beta-defensin [5].

Í þvagfærum eru beta-defensín tjáð víða um uroepithelium. Þekjufrumur sem klæðastnýrulykkja af Henle, fjarpíplum og safnrás tjáir mannlegt beta-defensín 1 (hBD1). Þrátt fyrir að magn hBD1 í þvagi sé ófullnægjandi til að drepa innrásarbakteríur, veitir hBD1 hraðvirka sýklalyfjahúð á pípulaga holrými og kemur í veg fyrir sýkingu með því að hindra tengingu baktería við þvaglegg [6]. Nýlegar rannsóknir benda til þess að afoxunarástand hBD1 hafi marktæk áhrif á sýklalyfjavirkni, þannig að minnkaða peptíðið er miklu öflugra en tvísúlfíð-tengda oxaða formið [7]. Mikilvægi þessa á yfirborði þvagfæra hefur ekki verið ákvarðað. Annað defensín, beta-defensín 2 úr mönnum (hBD2) er ekki tjáð í heilbrigðum nýrnavef; hins vegar er tjáning hBD2 framkölluð af sýkingu [8].

Ólíkt beta-defensínum er hlutverki alfa-defensína úr þekjuvef ekki vel lýst í þvagfærum. Tjáningu og virkni alfa-defensin HD5 og HD6 hefur að mestu verið greint frá í smáþörmum þar sem þau eru seytt af Paneth-frumum inn í þörmum og stuðla að jafnvægi í örveru í þörmum [9]. HD5 hefur einnig verið staðbundið í kynfærum karla og kvenna, með vísbendingum sem benda til þess að það sé framkallanlegt og mikilvægt til að uppræta sýkingu [10,11,12]. HD5 í þvagi hefur greinst hjá sjúklingum sem hafa gengist undir endurbyggingu nýblöðru í meltingarvegi og þvagleiðsla í meltingarvegi þar sem uppspretta HD5 framleiðslunnar var fyrst og fremst lögð á ileal Paneth frumurnar [13,14]. HD5 hefur bakteríudrepandi virkni gegn algengum uró-sjúkdómsvaldandi gram-jákvæðum bakteríum og gram-neikvæðum bakteríum [15]. HD5 hefur einnig sýklalyfjavirkni gegn uropathogenic veirum eins og adenóveiru og BK veiru [16,17,18]. Í þessari rannsókn gefum við fyrstu lýsingu og magngreiningu á HD5 tjáningu í mönnumnýruog skilgreina frekar tjáningu þess í neðri þvagfærum við ófrjósemi og sýkingu.

Niðurstöður

DEFA5 mRNA er myndað í þvagblöðru, þvagrás og nýrum manna

Magnbundin rauntíma PCR sýnir að öll prófuð blöðru-, þvagrásar- og nýrnasýni án sýkingar tjáðu DEFA5. DEFA5 tjáning var marktækt meiri í neðri þvagfærum en í efri þvagfærum (p= 0.014). Í þvagblöðru (n=4) var meðal DEFA5 tjáning 4,656637 afrit á 10 ng RNA og í þvagrásinni (n=4) var meðal DEFA5 tjáning 4,1126170 afrit á 10 ncRNA (mynd 1A) . Í nýrum (n=6) var meðal DEFA5 tjáning 2.9376274 afrit á 10 ng RNA. DEFA5 tjáning var greind sérstaklega í nýrnaberki, merg og mjaðmagrind. DEFA5 tjáning var ekki marktæk breytileg eftir nýrnasvæðum (p= 0.45).

DEFA5 tjáning og HD5 peptíðtjáning aukast með nýrnabólgu

Megindleg rauntíma PCR greining sem gerð var á nýrnavef með nýrnabólgu sýndi marktæka aukningu á DEFA5 tjáningu samanborið við ósýktan nýrnavef. Með kjarnabólgu (n= 6), jókst meðal DEFA5 tjáning í 7.82961.052 umrit á 10 ng RNA (p= 0.019) (Mynd 2A).

Til að meta frekar þessa aukningu á tjáningu með nýrnabólgu, gerðum við ónæmisblottagreiningu á sama nýrnavef sem notaður var fyrir rauntíma PCR greiningu til að meta samhliða aukningu á HD5 peptíðframleiðslu (Mynd 2B, miðja spjaldið). Ónæmisblóðgreining, með því að nota fjölstofna HD5 andserum, sýndi marktækt meiri HD5 peptíðframleiðslu í nýrnavef með nýrnabólgu (n=6) samanborið við ósýktan nýrnavef (n=6). Ósýktir nýrnavefur sýndu 300625 ng HD5/gram blautvefsþyngd á meðan nýrnavefur með nýrnabólgu gaf upp 600621 ng HD5/gram blautvefsþyngd (p,0,0001). Blettir voru rannsakaðir aftur með GAPDH til að þjóna sem hleðslustjórnun (Mynd 2B, miðborð) og silfurlitur var einnig gerður til að staðfesta jafna próteinhleðslu (Mynd 2B, efsta spjaldið).

HD5 peptíð er framleitt um nýru og þvagfæri manna

Ónæmislitun var gerð til að staðsetja HD5 framleiðslu í þvagfærum. Ónæmisvefjaefnafræði (IHC) sýndi að HD5-ónæmissvörun var til staðar í þvagleggi þvagrásar og þvagblöðru allra rannsakaðra sýna (n=4, mynd 3). IHC sýndi einnig að HD5 var framleitt í píplum í nýrnaberki og meðulla allra. eintök (n= 6, mynd 4). Ónæmisflúrljómun (IF) sýndi fram á að HD5 tjáning var mest í fjarlægu nýra og safnapíplum (mynd 5). Millivef og glomeruli sýndu ekki HD5 ónæmisvirkni. Ónæmislitunin sem sýnd er á myndum 3, 4 og 5 var framkvæmd með því að nota músa einstofna and-HD5 mótefni (8C8) sem þekkir HD5 própeptíðið (Abcam, Cambridge, MA). Niðurstöður voru svipaðar þegar notaðar voru kanínufjölstofna and-HD5 mótefni sem þekkja HD5 própeptíðið og þroskað peptíð (gögn ekki sýnd) - sem bendir til þess að HD5 sé geymt sem própeptíð.

Með nýrnahettubólgu jókst HD5 ónæmislitun verulega. HD5 ónæmissvörun jókst um nærri nýrunga, fjarlæga nýra og safnpíplur (mynd 4 og mynd 5). Eins og í ósýktum sýnum sýndu gaukla og millivef enga HD5 tjáningu með sýkingu. Neikvæð viðmið sýndu enga HD5 ónæmisvirka.

Sýkt þvag úr mönnum inniheldur mælanlegt

styrkur HD5 peptíðs

Immunoblot greining, með því að nota kanínu fjölstofna andsermi sem greinir forvera proHD5 og frekar unnin form auðkenndu mælanlegt magn af HD5 í 13 af 15 þvagsýnum sem voru prófuð sem voru sýkt af uropathogenic E.coli (Mynd 6A og B). Þegar til staðar var, var HD5 gildi, staðlað til kreatíníns í þvagi, á bilinu 299,8–669,7630 ng HD5/mg þvag Cr (110,67 ng/mL–276,67 ng/mL), sem samsvarar 11,10–27,67 nmól/L. Í sýktum þvagsýnum (n=15), HD5 var við eða undir greiningarmörkum (,50 ng). Ensímtengd ónæmissogandi prófun (ELISA) á sömu þvagsýnum, með því að nota einstofna músamótefni (8C8) sem greinir aðeins forvera proHD5, greindist mælanlegt magn af proHD5 í 13 af 15 sýktu sýnunum sem voru prófuð. Styrkur proHD5 í þvagi var á bilinu 122,78–490,060,03 ng HD5/mg þvagi Cr (30,02 ng/ml–200,5 ng/ml) þegar til staðar (Mynd 7).

Umræða

Í þessari rannsókn gefum við upphaflega eiginleika HD5 í nýrum, þvagleggi og þvagblöðru manna. Sýnt hefur verið fram á að HD5 er mikilvægur AMP sem kemur í veg fyrir ífarandi sýkingu í þörmum og er uppstillt í kynfærum við sýkingu [11,18,19,20,21]. Sýnt hefur verið fram á að þekjuafleidd AMP, eins og HD5, skipta miklu máli til að viðhalda ófrjósemi í þvagfærum [8,22,23,24]. Skortur á þessum meðfæddu slímhúðarvörnum getur leitt til bráðrar og/eða langvinnrar sýkingar [25,26].

Magnbundnar rauntíma PCR niðurstöður okkar sýna fram á að DEFA5 er myndað í nýrum, þvagrásum og þvagblöðru manna. DEFA5 tjáning eykst frá efri þvagfærum til neðri þvagfæra – í kjölfar flæðis þvagstraumsins og aukinni nálægð við innrásarpunkt örverunnar. Að því er við vitum er þetta fyrsta rannsóknin til að mæla DEFA5 tjáningu í nýrum og þvagblöðru manna. Nýlega sýndu Townes et al að venjulegt fjarlægt þvagrásarkerfi getur tjáð DEFA5 [14]. Niðurstöður okkar benda einnig til þess að DEFA5 sé formlega tjáð af fjarlæga þvagrásinni. Þrátt fyrir að DEFA5 tjáning í þvagfærum sé næstum 100-falt lægri en sú sem finnst í meltingarvegi, er grunntjáning í þvagrás á DEFA5 sambærileg við tjáningu þvagrásar sem áður hefur verið lýst eins og cathelicidin, hBD-1, hBD -2 og ríbónúkleasa 7[6,8,22,24,27]. Öfugt við þroskaða meltingarveginn þar sem DEFA5 er tjáð í miklu magni bæði í heilsufari og sýkingu/bólgu, er magnbundinn rauntími okkar PCR gögn sýna að DEFA5 tjáning í nýrum er marktækt uppstýrt með sýkingu [27,28,29]. Þetta framkallanlega tjáningarmynstur er hliðstætt DEFA5 tjáningu í kvenkyns æxlunarfærum þar sem DEFA5 tjáning eykst með salpingbólgu [30]. Í þvagfærum hafa Townes o.fl. sýnt tilhneigingu í átt að meiri þvagrás DEFA5 hjá sjúklingum með þvagfærasýkingu sem hafa gengist undir þvagleiðsögn í meltingarvegi [14].

Ónæmisblóðgreiningin okkar bætir við rauntíma PCR gögnin með því að sýna fram á að HD5 peptíðframleiðsla eykst með nýrnabólgu. Þetta framkallanlega mynstur HD5 framleiðslu er svipað því sem sést hjá sumum meðlimum beta-defensín fjölskyldunnar. hBD2 sýnir framkallanlegt framleiðslumynstur með sýkingu í þvagfærum og/eða langvarandi nýrnabólgu [8,31,32]. Sýnt hefur verið fram á að HD5peptíðframleiðsla eykst í efri kynfærum kvenna og þvagrás karla með bólgu [11,30].

Með því að nota ónæmislitun sýnum við fram á að HD5 er jafnt framleitt í gegnum þvaglegg þvagrásar og þvagblöðru. Vegna þess að mikill meirihluti UTI stafar af saurflóru sem fer upp í þvagblöðru, benda þessar niðurstöður til þess að HD5 tjáning sé til staðar á stöðum þar sem útsetning fyrir örverum á sér stað oftast [33]. Þess vegna er HD5 fullkomlega staðsett til að koma í veg fyrir vaxandi örverusýkingu. Í nýrum er HD5 fyrst og fremst framleitt í fjarlægum nýrna og safnpíplum. Þessar niðurstöður benda til þess að HD5 sé framleitt á stöðum þar sem það verður staðsett þannig að það hafi ákjósanlega sýklalyfjavirkni. Fyrri rannsóknir hafa sýnt að örverueyðandi eiginleikar defensín eru háðir saltstyrk - þar sem hærri saltstyrkur minnkar örverueyðandi virkni [23,34,35]. Við veltum því fyrir okkur að lítill saltstyrkur fjarlægra nýrna og safnapípla veiti hagstætt umhverfi fyrir HD5 sýklalyfjavirkni.

Immunoblot og ELISA greining sýna einnig að HD5 er seytt út í þvag í litlu magni. Miðað við stærð (8,1 kDa og 3,7 kDa) og jákvæða hleðslu proHD5 og fullunnar HD5, er mögulegt að eitthvað HD5 peptíð í þvagi komi, að minnsta kosti að hluta, frá plasmasíuvökva. Samt er lítið sem bendir til þess að HD5 haldist í plasma [27]. Að auki, til að birtast í þvagi, þyrfti HD5 að komast undan skilvirkum peptíð frásogsaðferðum í nærpíplum [6,36]. Að lokum gengu þvagsýnin sem notuð voru í skilvindu áður en mælingarnar voru gerðar, þar sem frumuuppsprettur HD5 voru fjarlægðar. Við þann styrk sem greinist er ólíklegt að HD5 í þvagi sé beint sýklalyf gegn uropathogenic örverum þar sem fullunnið HD5 hefur lágmarks hamlandi styrk (MIC) á milli 6-10 mg/ml gegn algengum gram-neikvæðum uropathogenic bakteríum [15]. Hins vegar er líklegt að styrkur yfirborðs slímhúðar sé hærri. Ennfremur sýnir ónæmisblóðgreining að HD5 styrkur er marktækt meiri í nýrum. Þessar niðurstöður benda til þess að HD5 eigi þátt í vörn slímhúðar í þvagfærum. Sambærilegt mynstur sést með hBD1, þar sem styrkur hBD1 í þvagi er ófullnægjandi til að sýna örverueyðandi virkni en hærri peptíðþéttni greinist nálægt nýrnapíplunum [6,31].

Vegna þess að IHC sýnir fram á að proHD5 er aðalform HD5 í nýrum og vegna þess að bæði þroskað og proHD5 finnast í þvagi, getum við velt því fyrir okkur að HD5 sé fyrst og fremst seytt sem forvera sameind og gangast síðan undir próteingreiningu til að mynda þroskað form - svipað og í meltingarvegi. og kynfærum [11,30,37]. Í smáþörmum framleiða Paneth frumur trypsín, sem klýfur HD5 própeptíðið þannig að fullunnið peptíð er ríkjandi form í þarmaholinu [37]. Í karlkyns þvagrás eru lykilvinnsla og virkjunarensím fyrir HD5 daufkyrningapróteasar sem stuðla að

daufkyrninga safnað á sýkingarstaðinn [11]. Á eftir að ákvarða framlag þekjutrypsínógens, þvagtrypsíns og/eða daufkyrningapróteasa við HD5 vinnslu í þvagfærum við sýkingu. Ennfremur á enn eftir að ákvarða áhrif breytinga í þvagumhverfi á HD5 virkni (breytingar á osmólarstyrk, pH og katjónískum styrk).

Að lokum er þetta fyrsta rannsóknin til að bera kennsl á og mæla tjáningu og framleiðslu HD5 í þvagfærum. Niðurstöður okkar benda til þess að HD5 sé þekjuvef-afleidd AMP sem gæti gegnt mikilvægu hlutverki í meðfæddu ónæmi mannsins úrepithelium sem kemur í veg fyrir flutning innrásarsýkla inn í blóðrásina. Útskýring á þáttum sem stjórna HD5 framleiðslu getur veitt nýja innsýn í meingerð þvagfærasýkinga hjá sjúklingum í áhættuhópi fyrir þvagfærasýkingu og sjúklingum með langvarandi sýkingar.

Aðferðir

Námssamþykki

Upplýst skriflegt samþykki var fengið frá öllum sjúklingum sem tóku þátt í þessari rannsókn. Fyrir einstaklinga yngri en 18 ára fékkst skriflegt samþykki foreldra/forráðamanns. The NationwideChildren's Hospital (NCH) Institutional Review Board samþykkti þessa rannsókn ásamt samþykkisferlinu og skjölum (IRB07-00383).

Vefja- og þvagsýni úr mönnum

Ósýktur fjarlægur þvagleggur og þvagblöðruvefur (n= 4) var fengin frá börnum sem fóru í endurígræðslu í þvagrás af öðrum ástæðum en endurtekinni sýkingu. Ósýkt nýrnasýni (n=6) voru fengin frá sjúklingum sem gengust undir nýrnabrottnám vegna nýrnaæxla. Vefjasýni voru laus við stórsæ merki um sjúkdóm eða bólgu. Nýrnavefur frá sjúklingum með langvinna nýrnabólgu var útvegaður af Cooperative HumanTissue Network (n=6) [38]. Tveir óháðir meinafræðingar staðfestu vefjameinafræðilega greiningu á nýrnabólgu. Vefjasýni voru snöggfryst eða varðveitt sem hlutlausir formalínfastir paraffín-innfelldir hlutar. Hlutar af ósýktum nýrnavef voru krufnir í heilaberki, merg eða nýrnagrind fyrir geymslu (n=4).

Ósýkt og sýkt þvagsýni voru tekin úr börnum sem komu á bráðamóttöku NCH eða nýrnalækningastofu. Greining á UTI var gerð með jákvæðri þvagrækt samkvæmt leiðbeiningum American Academy of Pediatrics [39]. Öll sýkt þvagsýni voru með.106 CFU/mL af E.coli. pH gildi í þvagi voru á bilinu 5,5 til 8,5 (meðalþvagi 6,9). Jónasamsetning þvags var ekki mæld. Þvagsýni voru skilin í skilvindu til að fjarlægja þvagset og próteasahemlum var bætt við (Thermo Scientific, Rockford, IL, Bandaríkjunum).