HPLC til að ákvarða samtímis fjórum fenýletanól glýkósíðhlutum í Cistanche Herba decoction stykki og Cistanche Tubulosa útdrætti

Ágrip: Markmið þessarar rannsóknar er að koma á ahágæða vökvaskiljun (HPLC)aðferð til að ákvarða samtímis fjögur fenýletanól glýkósíð íCistanches Herba decoction stykkiogCistanche tubulosa útdrættir. Litskiljunarskilyrðin notuðu Inertsil ODS{{0}} dálk (250 mm × 4,6 mm, 5 µm), með hreyfanlegum fasa sem samanstendur af asetónítríl - 0.1% maurasýru lausn með hallaskolun. Rennslishraði var stilltur á 1.0 mL/mín., súluhitastigi var haldið við 30 gráður og greiningarbylgjulengd var 330 nm með inndælingarrúmmáli 1{ {27}} µL. Línuleiki toppsvæðisins með styrkleika var á bilinu 2,53 til 201,60 µg/mL fyrir mismunandi glýkósíð, með fylgnistuðla (r) hærri en 0,9993. Greiningarmörk (LOD) og magngreining (LOQ) voru á bilinu 0,2249 til 1,1004 µg/mL og 0,3101 til 0,8161 µg/mL, í sömu röð. Aðferðin sýndi góða nákvæmni, stöðugleika og endurtekningarhæfni með RSD gildi undir 3,0%. Meðalendurheimtarhlutfall var á bilinu 97,70% til 100,95%, sem gefur til kynna nákvæmni og virkni aðferðarinnar fyrir samtímis magngreiningu þessara þátta í sýnunum.

Leitarorð:Hágæða vökvaskiljun,Cistanches Herba, decoction stykki,Cistanche tubulosa útdrættir, fenýletanól glýkósíð, efnisákvörðun.

HETIAN DICHENMICROBIAL LIMIT HERBERGI

Cistanche, einnig þekkt sem Rou Cong Rong og Desert Ginseng, tilheyrir fjölskyldunni Orobanchaceae og er notað í hefðbundnum lækningum vegna holdugra stilka sem eru þaktir hreisturum. Það sníklar rætur Chenopodiaceae plantna eins og Haloxylon og Tamarix, og er fyrst og fremst að finna í þurrum svæðum í Innri Mongólíu, Qinghai, Xinjiang og Ningxia í Kína. Það var fyrst skráð í klassíska jurtatextanum „Shennong Bencao Jing“ sem hágæða jurt. Cistanche er sætt og salt á bragðið, er hlýtt í náttúrunni og tengist lengdarlínum nýrna og þéttargirnis. Það er þekkt fyrir ávinning sinn í að styrkja nýrun og yang, raka þörmum og létta hægðatregðu, vernda lifur, gegn öldrun, berjast gegn þreytu og auka friðhelgi. Klínískt er það oft notað til að meðhöndla sjúkdóma eins og skort á nýrna-yang, hægðatregðu með blóðskorti, ófrjósemi hjá konum, veik hné og bak og minnisskerðingu. Cistanche er virtur sem „Ginseng eyðimerkurinnar“ og „dýrmæt lyf“.

Álverið inniheldur fenýletanól glýkósíð, iridoid terpenes, alkalóíða, lignans og aðra þætti, þar sem echinacoside og acteoside eru dæmigerð fenýletanól glýkósíð þekkt fyrir áhrif þeirra til að auka yang, öldrun, andoxunareiginleika og minnisauka. Þessir þættir eru aðal grundvöllur lyfjaáhrifa Cistanche og eru einnig lykilvísar fyrir gæðamat og eftirlit í 2020 útgáfu kínversku lyfjaskrárinnar.

Tilkynnt hefur verið um ákvörðun fenýletanóls glýkósíðs í Cistanche tegundum með hágæða vökvaskiljun (HPLC), en þær hafa verið takmarkaðar við hrá Cistanche efni og sneiðar. Eins og er eru engir innlendir staðlar fyrir Cistanche tubulosa þykkni og ekki hefur verið greint frá innihaldsákvörðun þess. Bráðabirgðarannsóknir okkar komust að því að Cistanche tubulosa frá Xinjiang inniheldur aðallega fjögur dæmigerð fenýletanól glýkósíð: echinacoside, isoacteoside, acteoside og tubuloside A. Þessi rannsókn kom á fót HPLC aðferð til samtímis ákvörðunar á þessum fjórum þáttum í bæði Cistanche decoction stykki og Cistanche tubulosa útdrætti, miðar að því að meta betur gæði Cistanche decoction stykki og hjálpa til við að koma á gæðastaðlum fyrir útdrætti þess. Skýrslan er sem hér segir.

1 Hljóðfæri og hvarfefni

1.1 Hljóðfæri

• LC-20AT hágæða vökvaskilji, þar á meðal díóða fylkisskynjari (Shimadzu, Japan)

• AB135-S rafræn jafnvægi (Mettler Toledo, Sviss)

• KQ-500DE ultrasonic cleaner (Kunshan Ultrasonic Instruments Co., Ltd.)

• Aike ofurhreint vatnskerfi (Chengdu Tangshi Corning Science and Technology Development Co., Ltd.)

1.2 Hvarfefni

• Staðlað efni úr Pinoresinol diglucoside (lotunúmer S-003-01904003), ísómukrónulatóli 7-O-glúkósíð (lotunúmer Y-073-11803024), múkrónúlatóli 7-O-glúkósíð (lotunúmer M{ {6}}), og Tubuloside A (lotunúmer G-066-11812016), allt keypt frá Beijing Inlay Technology Development Co., Ltd., með yfir 98% hreinleika.

• Asetónítríl og metanól af litskiljunargráðu, maurasýru af greiningargráðu, vatn var ofurhreint.

• Fjórar lotur af Cistanches Herba decoction stykki (kóði S1, S2 frá Innri Mongólíu; kóða S3, S4 frá Xinjiang) voru allir keyptir frá fjórum apótekum í Urumqi.

• Cistanche tubulosa útdrættir (kóði S5, ensímóvirkjað vatnsútdráttur í þurrsneiðum; kóða S6, ensímóvirkjaður þurrsneiðalkóhólútdráttur; kóða S7, ensímóvirkjaður þurrsneiðalkóhólresínbundinn útdráttur) voru allir keyptir frá Xinjiang Hetian Dichen Pharmaceutical Biotechnology Co. ., Ltd.

2 Aðferðir og niðurstöður

2.1 Litskiljunarskilyrði

• Litskiljunarsúla: Inertsil ODS-3 dálkur (250 mm × 4,6 mm, 5 µm)

• Hreyfanlegur fasi: Asetónítríl (A) - 0,1% maurasýruvatnslausn (B) með hallaskolun (frá 17% A til 20% A yfir 0-12 mín., 20% A til 22% A yfir 12-30 mín., 22% A til 17% A yfir 30-35 mín.)

• Rennslishraði: 1.0 ml/mín

• Uppgötvun bylgjulengd: 330 nm

• Súluhiti: 30 gráður

• Inndælingarrúmmál: 10 µL

  

Hetia Dichen Eðlis-efnafræðileg rannsóknarstofa

2.2 Undirbúningur lausnar

• Blönduð staðallausn: Vigtið hvern af stöðlunum fjórum nákvæmlega og flytjið í aðskildar 10 ml mæliflöskur, fyllið upp að rúmmáli með 50% metanóli til að fá stakar staðallausnir með styrkleika 1,008, 1,011, 1,012 og 1,012 mg/L fyrir Pinoresinol diglucoside, Tubuloside A, Mucronulatol 7-O-glucoside og Isomucronulatol 7-O-glúkósíð, í sömu röð. Mældu hæfilegt magn af hvoru, blandaðu saman í 10 ml mæliflösku, taktu það upp með 50% metanóli, blandaðu vel saman til að búa til blönduða staðallausn með styrkleika 201,60, 50,55, 101,20 og 50,60 µg/ml, í sömu röð og síaðu. í gegnum 0,45 µm himnusíu.

• Sýnislausn: Um það bil 1,0 g af Cistanches Herba decoction stykki dufti (farið í gegnum sigti nr. 4) er vegið nákvæmlega og flutt í 1{{10}}0 ml gulbrún mæliflösku . Bætið við nákvæmlega 50 ml af 50% metanóli, vegið, dragið út með ultrasound í 40 mínútur með 250 W afli og 35 kHz tíðni, kælið, vegið aftur og bætið saman tapaðan massa með 50% metanóli. Blandið vel saman, síið og safnað síuvökvanum saman. Farið í gegnum 0,45 µm himnusíu til að fá Cistanches Herba sýnislausnina. Á sama hátt, undirbúið Cistanche tubulosa þykkni sýnislausnina með því að nota um það bil 0,2 g af þykkniduftinu.

1. Echinacoside 2. Tubuloside A 3. Acteoside 4. Isoacteoside A. Blandað viðmiðunarlausn B. Próflausn af Cistanches Herba decoction stykki C. Próflausn af Cistanche Tubulosa þykkni

2.3 Aðferðafræðileg skoðun

Kerfishæfispróf: Sýni voru tekin úr viðeigandi rúmmáli af þremur lausnum úr kafla 2.2 við skilgreiningarskilyrðin sem lýst er í kafla 2.1 og litskiljun voru skráð. Niðurstöðurnar gáfu til kynna að fræðileg plötutala fyrir echinacoside toppinn ætti ekki að vera minna en 3000, með aðskilnaðargráður hærri en 1,5, sem gefur til kynna góðan grunnlínuskil. Sjá mynd 1 fyrir nánari upplýsingar.

Línulegt mat: Nákvæmt rúmmál blönduðu viðmiðunarlausnarinnar úr kafla 2.2 (0.5, 1.0, 2.5, 5.0 og 10,0 ml ) voru fluttar í 10 ml mæliflöskur, færðar í rúmmál með 50% metanóli, blandað vel saman og notaðar til að búa til röð af blönduðum viðmiðunarlausnum. Nákvæmlega 10 µL af þessum lausnum var sprautað við skilgreiningarskilyrði í kafla 2.1. Toppsvæði voru skráð og línuleg aðhvarf framkvæmd með styrk efnisþáttanna (X, µg/mL) sem óháðu breytu og toppsvæði (Y) sem háðu breytu. Aðhvarfsjöfnurnar og línuleikasviðið má finna í töflu 1.

Greiningar- og magngreiningarmörk: Nákvæmt rúmmál af blönduðu viðmiðunarlausninni úr kafla 2.2 var tekið, þynnt í samræmi við það og greint við skilgreiningarskilyrði í kafla 2.1. Styrkur sem samsvarar merki/suðhlutföllum 3:1 og 10:1 voru notuð sem greiningar- og magngreiningarmörk, í sömu röð. Niðurstöður eru sýndar í töflu 1.

Nákvæmnipróf: Viðeigandi rúmmál af blönduðu viðmiðunarlausninni úr kafla 2.2 var greint sex sinnum í röð við litskiljunarskilyrði í kafla 2.1. RSD gildi fyrir toppsvæði echinacoside, tubuloside A, acteoside og isoacteoside voru 1,31%, 0,91%, 1,58% og 0,58%, í sömu röð (n {{12} }), sem gefur til kynna góða nákvæmni tækisins.

Stöðugleikapróf: Prófsýnislausnir voru útbúnar og látnar standa við stofuhita í 0, 2, 4, 6, 8, 12 og 24 klukkustundir áður en þær voru greindar við skilyrði kafla 2.1. RSD gildi fyrir toppsvæði echinacoside, tubuloside A, acteoside og isoacteoside voru 1,84%, 2,18%, 1,05% og 1,55%, í sömu röð (n=7), sem gefur til kynna að prófunarlausnirnar hafi verið stöðugar í herberginu. hitastig í allt að 24 klst.

Endurtekningarpróf: Sýni (kenni: S2) var vegið nákvæmlega og skipt í sex skammta. Hver skammtur var útbúinn sem prófunarlausn samkvæmt aðferðinni í kafla 2.2 og greindur við skilgreiningarskilyrði í kafla 2.1. Meðalinnihald echinacoside, tubuloside A, acteoside og isoacteoside var 0,779%, 0.020%, 0,155% og 0,074%, í sömu röð. , með RSD gildi upp á 1,21%, 3,12%, 2,65% og 2,96% (n=6), sem sýnir góða endurtekningarhæfni aðferðarinnar.

Endurheimtarpróf: Þekkt magn af sýni (kenni: S2) var tekið og skipt í níu skammta. Hver skammtur var fylltur með lágum, miðlungs eða háum styrk af einstökum viðmiðunarlausnum, útbúinn samkvæmt aðferðinni í kafla 2.2, og greindur við skilgreiningarskilyrði í kafla 2.1. Hámarkssvæði voru skráð og endurheimtarhlutfall reiknað. Niðurstöður eru sýndar í töflu 2.

Hetian DiChen HPLC rannsóknarstofa

2.4 Dæmi um efnisákvörðun

Viðeigandi rúmmál af hverri lotu sýna var útbúið sem próflausnir samkvæmt aðferðinni í kafla 2.2, síðan greint við skilgreiningarskilyrði í kafla 2.1. Hvert sýni var prófað í þríriti, toppsvæði skráð og innihald sýnanna reiknað út. Niðurstöður eru sýndar í töflu 3.

3 Umræður

Í þessari rannsókn var díóða fylkisskynjari notaður og skannanir á blönduðu viðmiðunarlausnunum og prófsýnislausnum voru gerðar á bylgjulengdarbilinu 200 til 450 nm. Niðurstöðurnar sýndu að echinacoside og acteoside sýndu hámarks frásog við 330 nm, tubuloside A við 331 nm og ísóacteoside við 327 nm. Að auki, með því að vísa til 2020 útgáfu kínversku lyfjaskrárinnar, sem tilgreinir greiningarbylgjulengd 330 nm fyrir echinacoside og acteoside, kom í ljós að margir þættir höfðu marktæka litskiljunartoppa og há svörunargildi við 330 nm, sem leiddi til val á nm sem 330 nm. lokamælingar bylgjulengd.

Út frá niðurstöðum innihaldsákvörðunar á Cistanches Herba decoction bitum kom í ljós að echinacoside var með hæsta innihaldið bæði í Cistanche tubulosa og Desert Cistanche, þar á eftir acteoside, en tubuloside A og isoacteoside höfðu hlutfallslega lægra innihald. Verulegur breytileiki var í innihaldi fenýletanólglýkósíðþáttanna fjögurra og sá breytileiki var einnig áberandi milli mismunandi lota frá sama stað eða mismunandi stöðum. Þessa breytileika má rekja til þátta eins og landfræðilegs umhverfis, hitastigs, loftslags og uppskeruferla hráefna sem hafa áhrif á uppsöfnun efna í plöntunum. Þó að efnafræðilegir þættir Cistanche sem eru fengnir af mismunandi uppruna séu svipaðir, er styrkur þessara íhluta mismunandi, sem leiðir til mismunandi áhrifa þeirra. Þess vegna er rétt að velja hráefni út frá virkni þeirra til að ná betri klínískum árangri.

Í stuttu máli má segja að aðferðin sem kom fram í þessari rannsókn er einföld, hröð, nákvæm og áhrifarík. Það er hægt að nota til að ákvarða samtímis fjóra fenýletanól glýkósíðhluta í Cistanches Herba decoction stykki og Cistanche tubulosa útdrætti. Niðurstöður innihaldsákvörðunar geta endurspeglað gæðastig mismunandi lota og mismunandi útdrátta frá sömu eða mismunandi stöðum, sem gefur fræðilegan grunn til að setja viðeigandi gæðastaðla.

Tab. 2 Niðurstöður endurheimtarprófsins (n ​​= 9)

Tab. 3 Niðurstöður innihaldsákvörðunar fjögurra fenýletanóíð glýkósíða í sýnunum (%,n=3)

Cistanche fríðindi

Heimildir:

1. 中文 (kínverska): 国家药典委员会．中华人民共和国药典(一部)［M］．北京:中卛北京:瑭卛:0,2 {1}}.
   英文 (enska): National Pharmacopoeia Commission. Lyfjaskrá Alþýðulýðveldisins Kína (1. bindi) [M]. Peking: China Medical Science and Technology Press, 2020: 140-141.

2. 中文 (kínverska): 朱乃亮,徐荣,吴海峰,等. 荒漠肉苁蓉和管花肉苁蓉指纹图谱比较研究［J］. 中国药学杂志,2016,51(13):1116-1119.
   英文 (enska): Zhu Nailiang, Xu Rong, Wu Haifeng, o.fl. Samanburðarrannsókn á fingraförum Cistanche deserticola og Cistanche tubulosa [J]. Chinese Pharmaceutical Journal, 2016, 51(13): 1116-1119.

3. 中文 (kínverska): 闫暾,齐海平,李旻辉,等. 肉苁蓉和管花肉苁蓉的对比［J］. 包头医学院学报,2019,35(1):120-121.
   英文 (enska): Yan Tun, Qi Haiping, Li Minhui, o.fl. Samanburður á Cistanche deserticola og Cistanche tubulosa [J]. Journal of Baotou Medical College, 2019, 35(1): 120-121.

4. 中文 (kínverska): 吴波,顾少菊,傅玉梅,等. 肉苁蓉和管花肉苁蓉通便与补肾壮阳药理作用的研究［J］. 中医药学刊,2003,21(4):539-548.
   英文 (enska): Wu Bo, Gu Shaoju, Fu Yumei, o.fl. Rannsókn á hægðalosandi og styrkjandi nýrna-yang áhrifum Cistanche deserticola og Cistanche tubulosa [J]. Journal of Chinese Medicine and Pharmacy, 2003, 21(4): 539-548.

5. 中文 (kínverska): 范亚楠,黄玉秋,贾日柱,等. 肉苁蓉炮制前后对衰老模型大鼠抗衰老及免疫功能的影响［J］. 中华中医药学刊,2017,35(11):2882-2885.
   英文 (enska): Fan Yanan, Huang Yuqiu, Jia Tianzhu, o.fl. Áhrif Cistanche deserticola fyrir og eftir vinnslu á öldrun og ónæmisvirkni í öldrunarmódelrottum [J]. Chinese Journal of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy, 2017, 35(11): 2882-2885.

6. 中文 (kínverska): 吴波,付玉梅. 肉苁蓉总苷对亚急性衰老小鼠抗脂质过氧化作用的研究［J］. 中国药理学通报,2005,21(5):639.
   英文 (enska): Wu Bo, Fu Yumei. Rannsókn á and-lípíðperoxunaráhrifum Cistanche glýkósíða á undirbráða öldrun músa [J]. Chinese Pharmacological Bulletin, 2005, 21(5): 639.

7. 中文 (kínverska): 胡余明,胡怡秀,刘秀英,等. 苁蓉总苷对正常小鼠学习记忆功能的影响研究［J］. 中国预防医学杂志,2007,8(4):370-373.
   英文 (enska): Hu Yuming, Hu Yixiu, Liu Xiuying, o.fl. Rannsókn á áhrifum Cistanche glýkósíða á nám og minnisvirkni hjá venjulegum músum [J]. Chinese Journal of Preventive Medicine, 2007, 8(4): 370-373.

8. 中文 (kínverska): 屠鹏飞,姜勇,郭玉海,等. 发展肉苁蓉生态产业推进西部荒漠地区生态文明［J］. 中国现代中药,2015,17(4):297-301.
   英文 (enska): Tu Pengfei, Jiang Yong, Guo Yuhai, o.fl. Að þróa Cistanche deserticola vistfræðilegan iðnað til að efla vistvæna siðmenningu á vestrænum eyðimerkursvæðum [J]. Modern Chinese Medicine, 2015, 17(4): 297-301.

9. 中文 (kínverska): 覃文婷,宿美凤,雒晓梅,等. 定性分析不同产地荒漠肉苁蓉苯乙醇苷类及多糖类成分［J］. 辽宁中医药大学学报,2018,20(7):77-81.
   英文 (enska): Qin Wenting, Su Meifeng, Luo Xiaomei, o.fl. Eigindleg greining á fenýletanóíð glýkósíðum og fjölsykrum í Cistanche deserticola af mismunandi uppruna [J]. Journal of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, 2018, 20(7): 77-81.

10. 中文 (kínverska): 王力伟,曹瑞,房永雨,等. 超高效液相色谱-串联3重4极杆质谱联用法测定肉苁蓉中有效成分的含量［. 中药材,2017,40(2):295-300.
    英文 (enska): Wang Liwei, Cao Rui, Fang Yongyu, o.fl. Ákvörðun virkra efnisþátta í Cistanche deserticola með vökvaskiljun með ofurafkastamikilli virkni-tandem þrefaldri fjórpóla massagreiningu [J]. Journal of Chinese Medicinal Materials, 2017, 40(2): 295-300.

11. 中文 (kínverska): 初侨,席兴军,杨丽. 肉苁蓉中松果菊苷和毛蕊花糖苷闪提工艺研究［J］. 食品研究与开发,2015,36(16):49-52.
    英文 (enska): Chu Qiao, Xi Xingjun, Yang Li. Rannsókn á flassútdráttartækni á echinacoside og verbascoside í Cistanche deserticola [J]. Matvælarannsóknir og þróun, 2015, 36(16): 49-52.

12. 中文 (kínverska): 余逸凡. 肉苁蓉属植物化学成分及药理活性研究进展［J］. 化工管理,2019(13):111-112.
    英文 (enska): Yu Yifan. Framfarir rannsókna á efnafræðilegum innihaldsefnum og lyfjafræðilegri virkni Cistanche [J]. Efnastjórnun, 2019(13): 111-112.

13. 中文 (kínverska): 王小新,骆婷婷. 肉苁蓉对小鼠抗疲劳及记忆力的影响［J］. 内蒙古中医药,2014,33(22):102–103.
    英文 (enska): Wang Xiaoxin, Luo Tingting. Áhrif Cistanche deserticola á þreytu og minni í músum [J]. Inner Mongolia Journal of Traditional Chinese Medicine, 2014, 33(22): 102-103.

14. 中文 (kínverska): 随家宁,李芳婵,郭勇秀,等. 肉苁蓉化学成分,药理作用研究进展及其质量标志物预测分析［J］. 辽宁中医药大学学报,2021,23(1):191-196.
    英文 (enska): Sui Jianing, Li Fangchan, Guo Yongxiu, o.fl. Rannsóknarframfarir á efnafræðilegum innihaldsefnum og lyfjafræðilegum áhrifum Cistanche deserticola og spágreiningu á gæðamerkjum þess [J]. Journal of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, 2021, 23(1): 191-196.

15. 中文 (kínverska): 刘涛,殷松娜,栾昕. 肉苁蓉对卵巢早衰大鼠免疫因子和凋亡相关蛋白的影响［J］. 中国临床药理学杂志,2019,35(23):3084-3087.
    英文 (enska): Liu Tao, Yin Songna, Luan Xin. Áhrif Cistanche deserticola á ónæmisþætti og apoptosis-tengd prótein í rottum með ótímabæra eggjastokkabilun [J]. Chinese Journal of Clinical Pharmacology, 20