Hvernig hefur Cistanche Deserticola fjölsykra áhrif á frásog beina?

Tengiliður: Audrey Huaudrey.hu@wecistanche.com

Cistanche deserticola fjölsykra dregur úr vökvamyndun og beinupptöku með því að hindra RANKL-boð og hvarfgjörn súrefnisframleiðslu

Dezhi Song o.fl

Beinþynning er efnaskiptasjúkdómur sem einkennist af beinfrumnafæð og hnignun beina. Osteoclastar eru aðal áhrifafrumurnar sem brjóta niður beinfylki og óeðlileg virkni þeirra leiðir til þróunar beinþynningar. Uppsöfnun hvarfefna súrefnistegunda (ROS) við umbrot í frumum stuðlar að útbreiðslu og aðgreiningu beinþynninga og gegnir því mikilvægu hlutverki í beinþynningu.Cistanchedeserticolafjölsykra(CDP) býr yfir æxli,bólgueyðandi, og andoxunarvirkni. Hins vegar eru áhrif CDPon osteoclasts óljós. Í þessari rannsókn var tartratónæm sýrufosfatasa litun, ónæmisflúrljómun, öfug umritun-pólýmerasa keðjuverkun og westernblot greining notuð til að sýna fram á að CDP(Cistanchedeserticolafjölsykra)hamlað beinþynningarmyndun og uppsog hýdroxýapatíts. Auk þess CDP(Cistanchedeserticolafjölsykra)hindraði einnig tjáningu osteoclast merkja gena þar á meðal Ctsk, Mmp9 og Acp5, og hafði engin áhrif á viðtakavirkja kjarnaþáttar κB (RANK) tjáningar. Vélrænar greiningar leiddu í ljós að CDP(Cistanchedeserticolafjölsykra)eykur tjáningu andoxunarensíma til að draga úr RANKL-miðlaðri ROS framleiðslu í osteoclastum og hindrar kjarnaþátt virkjaðra T frumna og mítógenvirkjaðan próteinkínasavirkjun. Þessar niðurstöður benda til þess að CDP gæti verið frambjóðandi lyf til meðferðar á beinþynningu af völdum of mikillar beinþynningarvirkni.

LYKILORÐbeinupptaka,Cistanchedeserticolafjölsykra, MAPK, osteoclast, hvarfgjarnar súrefnistegundir

1|KYNNING

Jafnvægið á milli beinmyndunar, sem miðlað er af beinþynningum, og beinuppsogs, sem miðlað er af beinfrumum, gegnir mikilvægu hlutverki við að viðhalda efnaskiptajafnvægi beina (Manolagas, 2000; Zhuet al., 2018). Þegar beinupptakan er meiri en beinamyndun kemur fram beinþynning sem einkennist af minni beinmassa og skemmdum á örbyggingu beina (Ikeda, 2008). Beinþynning er algengur sjúkdómur hjá öldruðum einstaklingum og konum eftir tíðahvörf og meingerð hans hefur ekki verið skýrð að fullu (Cooper & Melton, 1992). Estrógenskortur er aðal orsök beinþynningar (Manolagas, O'Brien og Almeida, 2013). Að auki er hægt að framkalla hvarfgjörn súrefnistegund (ROS) með viðtakavirkjun kjarnaþáttarκB bindilsins (RANKL) og tengjast myndun beinþynningar (Yip o.fl., 2005) og geta því stuðlað að þróun beinþynningar (Manolagas, 2010). Sumar rannsóknir hafa komist að því að skortur á Nrf2-andoxunarefnum eykur ROS gildi og stuðlar að RANKL-framkölluðum beinþynningaraðgreiningu (Hyeon, Lee, Yang og Jeong, 2013). Þess vegna ætti að meta minnkun ROS framleiðslu meðan á beinþynningu stendur sem meðferðaraðferð við meðhöndlun á beinþynningu.

Osteoclastar eru fengnir úr einfrumu eða átfrumnahematopoietic ætterni og eru einu fjölkjarna frumurnar sem framkvæma beinupptöku (Teitelbaum, 2000). Þess vegna hafa rannsóknir sem fela í sér beinþynningarmyndun mikla þýðingu við að þróa árangursríkar meðferðir við efnaskiptasjúkdómum í beinum (Lorenzo, 2017). Macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) og RANKL, framleidd af beinfrumum og virkum T frumum, eru mikilvæg frumufrumur sem stjórna beinþynningu (Kim & Kim, 2016;Teitelbaum & Ross, 2003). RANKL örvar tjáningu kjarnaþáttar virkjaðra T-frumna (NFATc1), sem er mikilvægur umritunarþáttur sem virkur við myndun beinþynningar (Ishidaet al., 2002). Virkjað NFATc1 ýtir undir tjáningu beinþekkjamerkja eins og tartratónæmra sýrufosfatasa (TRAcP) og cathepsin K (CTSK) sem stjórna beinþekjumyndun og beinþynningarvirkni (Balkan o.fl., 2009; Crottiet al., 2008).

Cistanchedeserticolafjölsykra(CDP) er einangrað úr holdugum stönglumCistancheog býr yfir ónæmisstjórnun, æxlishemjandi áhrifum, öldrun og öðrum lyfjafræðilegum áhrifum (Guo o.fl., 2016; Jia, Guan, Guo og Du, 2012). CDP(Cistanchedeserticolafjölsykra)hafði hamlandi áhrif á framleiðslu nituroxíðs (NO) af völdum lípópólýsykra í múslímfrumum (BV-2 frumur; Nan o.fl., 2013). Að auki, afenýletanóíðríkur þykkni (ECD) afCistancheaukið sundgetu músa með því að minnka vöðvaskemmdir, seinka uppsöfnun mjólkursýru og bæta orkugeymslu (Cai o.fl., 2010). Hins vegar eru áhrif CDP á beinþynningarstarfsemi og virkni óþekkt.

Í þessari rannsókn sýndum við fram á að CDP(Cistanchedeserticolafjölsykra)hindrar RANKL-framkallaða dosteoclast aðgreiningu og beinupptöku. Undirliggjandi vélbúnaður var að CDP(Cistanchedeserticolafjölsykra)eykur tjáningu andoxunarensíma til að draga úr ROS framleiðslu og bælir síðan RANKL-virkjaðan NFAT og mítógenvirkjaðan próteinkínasa (MAPK)-merkjafall. Þessar niðurstöður benda til þess að CDP(Cistanchedeserticolafjölsykra)gæti verið notað til að meðhöndla beinþynningu sem stafar af of miklu beinupptöku beinþynningar.

2|EFNI OG AÐFERÐIR

2.1|Efni

CDP(Cistanchedeserticolafjölsykra)(hreinleiki > 98 prósent) var keyptur frá Solarbio (Beijing, Kína) og útbúinn í stofnstyrk 1 mM í fosfat-bufferuðu saltvatni (PBS). Mótefni eru sértæk fyrir c-Fos, CTSK, GSR, TRX1, NOS2,TRAF6, RANK, NFATc1, ERK, JNK, p38, fosfórýleruð (p)-ERK, p-p38, p-JNK og ‐aktín voru fengin frá jólasveininum. Cruz líftækni (San Jose, CA). Mótefni gegn V-ATPasa d2 voru framleidd eins og áður hefur verið lýst (H. Feng o.fl., 2009). 3-(4,5-dímetýlþíasól-2-ýl)-5-(3-karboxýmetoxýfenýl)-2-(4-súlfófenýl)-2H-tetrasólíum (MTS) og lúsiferasa prófunarkerfið var fengið frá Promega (Sydney, Ástralíu). Raðbrigða M-CSF var keypt frá R&D Systems (Minneapolis, MN). Raðbrigða GST-rRANKL prótein var tjáð og hreinsað eins og áður hefur verið lýst (Xu o.fl., 2000).

2.2|Frumuræktun

RAW264.7 frumur (mús átfrumur) voru fengnar frá American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) og ræktaðar í breyttum lágmarks nauðsynlegum miðli (Thermo FisherScientific, Scoresby, Ástralíu) bætt við 10 prósent fóstursermi, 2 mM af L-glútamíni , 100 einingar/ml af pensilíni og 100 ug/ml af streptomycini (heill miðill). Beinmergsúrleiddir einfrumur (BMM) voru einangraðir úr 6 vikna gömlum C57BL/6J músum, sem voru aflífaðar samkvæmt aðferðum sem samþykktar voru af dýrasiðanefnd háskólans í Vestur-Ástralíu (RA/3/100/1244). Löng bein voru sundurskorinn laus við mjúkvef og beinmergurinn skolaður úr lærlegg og sköflungi, sem síðan var ræktað í fullkomnu æti í viðurvist M-CSF (50 ng/ml).

2.3|Osteoclastogenesis próf

BMMs voru plötuð í 96-brunn ræktunarplötur með þéttleika 6 × 103 frumur í hverri brunn og meðhöndlaðir með fullkomnu miðli sem innihélt M-CSF (50 ng/ml) og GST-rRANKL (100 ng/ml), í nærveru eða fjarveru. mismunandi styrkur CDP(Cistanchedeserticolafjölsykra). The cell culture medium was changed every 2 days. After 5 days, cells were fixed with 4% paraformaldehyde for 10 min, washed three times with PBS, and then stained for TRAcP‐enzymatic activity using the leukocyte acid phosphatase staining kit (Sigma‐Aldrich, Sydney, Australia), following the manufacturer's procedures. TRAcP‐positive multinucleated cells (>þrír kjarnar) voru auðkenndir sem beinþynningar.

2.4|Frumueiturhrifapróf

BMM var sáð í 96-brunn plötur með 6 × 103 frumur í hverri brunn og afgangur yfir nótt til að festast. Daginn eftir voru frumurnar ræktaðar með mismunandi styrk CDP(Cistanchedeserticolafjölsykra). Eftir 48 klst til viðbótar var MTS lausninni (20 µl/brunn) bætt við og ræktuð með frumum í 2 klst. Gleypið við 490 nm var ákvarðað með örplötulesara (MultiscanSpectrum; Thermo Labsystems, Chantilly, VA.

2,5|Ónæmisflúrljómandi litun

BMM var sáð í þéttleikanum 6 × 103 frumur í hverri brunn í viðurvist M-CSF (50 ng/ml) yfir nótt. Frumur voru síðan örvaðar með M-CSF og GST-rRANKL (100 ng/ml) þar til þroskaðir beinþynningar mynduðust. Theosteoclastar voru síðan meðhöndlaðir með mismunandi styrk CDP(Cistanchedeserticolafjölsykra)í 48 klst. áður en það festist með 4 prósent paraformaldehýði, gegndræpi með 0.1 prósent Triton X‐100–PBS og blokkað með 3 prósent sermi albúmíni úr nautgripum í PBS. Tilbúnar frumur voru ræktaðar með rhodamine-tengdu phalloidin í 45 mínútur í dökkt til að bletta fyrir F-aktín. Frumur voru síðan þvegnar með PBS, kjarna mótlitaðar með 4′,6-diamidino-2-fenýlindóli (DAPI), og settar upp með hyljara til að mynda þétta smásjá.

2.6|Hýdroxýapatit uppsogspróf

Til að mæla beinþynningarvirkni BMM (1 × 105 frumur í hverri holu) ræktaðar á sex-brunn kollagenhúðuðum plötum (BD Biocoat; ThermoFisher Scientific) voru örvaðir með GST-rRANKL (100 ng/ml) og M-CSF (50 ng/ml) ) þar til þroskaðir beinþynningar voru myndaðir (Zhou o.fl., 2016). Frumurnar voru síðan losaðar varlega frá frumusundrunarlausninni (Sigma-Aldrich) og jafnmörgum þroskuðum osteoclastum var sáð á einstaka brunna í hýdroxýapatíthúðuðum 96-brunn plötum (Corning Osteoassay, Corning, NY). Þroskaðir beinþynningar voru ræktaðir í miðli sem innihélt GST-rRANKL og M-CSF með eða án CDP(Cistanchedeserticolafjölsykra)við tilgreinda styrki. Eftir 48 klst. var helmingur brunnanna litaður með ónæmisvefjaefnafræðilega litun fyrir TRAcP virkni, eins og lýst er hér að ofan, til að meta fjölda fjölkjarna frumna í hverri brunn. Holurnar sem eftir voru voru bleiktar í 10 mínútur til að fjarlægja frumur og leyfa mælingu á uppsoguðu svæðin. Uppsoguð svæði voru mynduð í venjulegri ljóssmásjá og Image J hugbúnaðurinn (National Institute of Health, Bethesda, MD) var notaður til að mæla hlutfallshlutfall flatarmáls hýdroxýapatíts yfirborðs sem osteoclastarnir uppsoguðu.

2.7|Lúsiferasa fréttaritarapróf

Til að rannsaka NFATc1 umritunarvirkjun, voru RAW264.7 frumur stöðugt transsmitaðar með NFATc1-svarandi luciferasereporter byggingu (Cheng o.fl., 2018; van der Kraan o.fl., 2013). 0,5 × 105 frumur í hverri brunn og formeðhöndluð með ýmsum styrkjum af CDP(Cistanchedeserticolafjölsykra)í 1 klst. Eftir formeðferð voru frumur örvaðar með GST-rRANKL (100 ng/ml) í 24 klst og virkni luciferasa var mæld með því að nota luciferase reporter prófunarkerfið í samræmi við siðareglur framleiðanda (Promega).

2.8|Magnbundin umritunar-pólýmerasa keðjuverkun (RT-PCR) greining

Heildar-RNA var einangrað úr frumum með því að nota Trizol hvarfefni í samræmi við samskiptareglur framleiðanda (Thermo Fisher Scientific). Viðbótar-DNA var búið til með því að nota Moloney músahvítblæðisveiru bakriti með 1 ug af RNA sniðmáti og oligo-dT primers. Fjölliðakeðjuverkunarmögnun sérstakra raða var framkvæmd með eftirfarandi forriti: 94 gráður í 5 mínútur, fylgt eftir með 30 lotum af 94 gráðum í 40 sekúndur, 60 gráður í 40 sekúndur og 72 gráður í 40 sekúndur, og síðasta framlengingarskref 5 mín. 72 gráður. Nákvæmar upplýsingar um tiltekna primera eru sýndar í töflu 1. Hlutfallslegt boðbera RNA gildi voru reiknuð út með því að staðla tjáningu á heimilisgeninu Hmbs.

2.9|Western blot greining

BMM var ræktað í heilum miðli með M-CSF í sex-brunn plötum og örvað með GST-rRANKL (100 ng/ml) í tilgreinda tíma. Frumur voru ljósaðar í geislaónæmisútfellingarlýsisbuffi og prótein voru leyst upp með natríumdódecýlsúlfat-pólýakrýlamíð hlaup rafdrætti og flutt yfir á pólý(vínýlíden flúor) himnur (GE Healthcare, Silverwater, Ástralía). Himnurnar voru stíflaðar í 5 prósenta undanrennu í 1 klst og síðan rannsakaðar með ýmsum sértækum frummótefnum með mildum hristingi yfir nótt við 4 gráður. Himnur voru þvegnar og í kjölfarið ræktaðar með piparrótarperoxidasa-tengdum aukamótefnum. Mótefnahvarfsemi var síðan greind með auknu efnaljómunarefni (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) og sýnd með Image-quant LAS 4000 (GE Healthcare).

2.10|Innanfrumu ROS uppgötvun

Innanfrumu ROS stig voru greind með því að nota 2′,7′‐díklórflúorescein díasetat frumu ROS greiningarsett (Abcam, Melbourne, Ástralía). BMM (5 × 103 frumur í hverri brunn) voru ræktaðar í 96-brunn plötum og meðhöndlaðar með RANKL (100 ng/ml), M-CSF (50 ng/ml) og CDP í 72 klst. Innanfrumuþéttni ROS var mæld með því að nota 2′,7′‐díklórfluorescein díasetat, sem oxast í flúrljómandi DCF í nærveru ROS. Frumur voru þvegnar í Hank's buffer og ræktaðar í myrkri í 30 mínútur með 10 µM af DCFH-DA. Myndir voru fengnar með confocal smásjá.

2.11|Tölfræðilegar greiningar

Öll gögn eru dæmigerð fyrir a.m.k. þrjár tilraunir sem gerðar eru í þrígang nema annað sé tekið fram. Gögnin eru gefin upp sem meðaltal ± SD. Einhliða dreifnigreining fylgt eftir með Student–Newman–Keulspost hoc prófum voru notuð til að ákvarða þýðingu mismunar á milli niðurstaðna, þar sem p < 0.05="" var="" talið="">

3|NIÐURSTÖÐUR

3.1|CDP hamlar RANKL-framkallaða dosteoclastogenesis og osteoclast samruna

Til að ákvarða hvort CDP(Cistanchedeserticolafjölsykra)geta bælt RANKL-framkallaða beinþynningarmyndun, gerðum við fyrst beinþynningargreiningu með því að nota músa BMMs (Liu o.fl., 2013; Song o.fl., 2016). BMM voru meðhöndluð með RANKL og M-CSF í 5 daga með auknum styrk CDP. CDP minnkaði fjölda TRacP-jákvæðra fjölkjarna frumna þegar styrkur CDP(Cistanchedeserticolafjölsykra)náð 5 µM eða hærra (Mynd 1a,b). Til að meta CDP(Cistanchedeserticolafjölsykra)eiturhrif og staðfesta að þessar niðurstöður endurspegli ekki frumudauða eða fjölda, gerðum við MTS próf. BMM voru meðhöndluð með RANKL og M-CSF í 48 klst með mismunandi skömmtum af CDP(Cistanchedeserticolafjölsykra). CDP hafði engin áhrif á útbreiðslu BMM við styrkinn 15 µMor minna (Mynd 1c).

Til að prófa áhrif CDP(Cistanchedeserticolafjölsykra)við samruna beinhimna voru beinþynningar framkallaðir með RANKL og M-CSF meðferð, með eða án mismunandi skammta af CDP(Cistanchedeserticolafjölsykra). Osteoclastar voru litaðir með rhodamine‐phalloidin og DAPI til að meta fjölda kjarna á hvern osteoclast (Mynd 2a).(Cistanchedeserticolafjölsykra)meðferð (5–10 µM; mynd 2b, c). Þess vegna, CDP(Cistanchedeserticolafjölsykra)haft hamlandi áhrif á RANKL-framkallaða beinþynningarmyndun og samruna beinþynna á skammtaháðan hátt.

3.2|CDP(Cistanchedeserticolafjölsykra)dregur úr RANKL-framkallaðri uppsogsvirkni osteoclastichydroxyapatite

Hýdroxýapatit uppsogsgreining var gerð til að greina áhrif CDP(Cistanchedeserticolafjölsykra)um beinþynningarstarfsemi (mynd 3a). Eftir 24-hrincubation breyttist fjöldi osteoclasts í hverri holu ekki á meðan hýdroxýapatituppsogssvæðið minnkaði marktækt við meðferð með 5 og 10 µM CDP samanborið við samanburðarhópa (Mynd 3b,c). Þessar niðurstöður sýna að CDP(Cistanchedeserticolafjölsykra)hefur sterk hamlandi áhrif á bæði beinþynningarmyndun og beinþynningarvirkni án frumudrepandi áhrifa.

3.3|CDP(Cistanchedeserticolafjölsykra)hamlar genatjáningu osteoclast merkja

Til að rannsaka frekar hamlandi áhrif CDP(Cistanchedeserticolafjölsykra)á beinþynningarmyndun og beinupptöku beinþynningar, voru BMMs meðhöndlaðir með RANKL og M-CSF í 5 daga með mismunandi styrk CDP(Cistanchedeserticolafjölsykra).RT-PCR var síðan framkvæmt til að greina tjáningu beinþynningarmerkja gena. Tjáning Nfatc1, mikilvægs umritunarþáttar við beinþynningu, var hamlað af CDP(Cistanchedeserticolafjölsykra)á skammtaháðan hátt (Mynd 4a). Auk þess CDP(Cistanchedeserticolafjölsykra)(5 og 10 µM) minnkaði tjáningu gena sem tengjast beinupptöku, þar á meðal Mmp9, Ctsk og Acp5 (Mynd 4b-d).

3.4|CDP bælir NFATc1 virkni og prótein tjáningu niðurstreymis

Til að skoða áhrif CDP(Cistanchedeserticolafjölsykra)á RANKL-framkallaðri NFATc1 virkni var alúsiferasa skýrslupróf gerð. Meðferð með CDP(Cistanchedeserticolafjölsykra), við styrk 5 µM og hærri, hamlaði marktækt RANKL-framkallaða NFATc1 virkni (Mynd 5a). Að auki sýndi western blot greining að CDP(Cistanchedeserticolafjölsykra)verulega bæla prótein tjáningu NFATc1 og c-Fos í BMMs meðhöndlaðir með RANKL og M-CSF í 3 og 5 daga (Mynd 5b). Ennfremur var tjáning próteina sem tengjast beinþynningastarfsemi, eins og V-ATPase-d2 og CTSK, minnkað þegar CDP var til staðar.(Cistanchedeserticolafjölsykra)miðað við samanburðarhópa. Hins vegar hafði CDP engin áhrif á RANK tjáningu (Mynd 5b).

3,5|CDP stuðlar að tjáningu andoxunarantensíma til að hreinsa ROS framleiðslu meðan á RANKL framkölluðum beinþynningarmyndun stendur

Til að kanna undirliggjandi verkun CDP-háðrar beinþynningarhömlunar, voru BMMs meðhöndlaðir með RANKL (100 ng/ml) og M-CSF (50 ng/ml) ásamt PBS eða CDP(Cistanchedeserticolafjölsykra)í 72 klst. Við skoðuðum áhrif CDP á innanfrumu ROS framleiðslu sem örvast af RANKL. Innanfrumu ROS gildi voru aukin með RANKL meðferð, sem var veikt af CDP (5 og 10 µM; mynd 6a). Bæði fjölda ROS-jákvæðra frumna og styrkleiki ROS-litunar minnkaði með CDP meðferð á skammtaháðan hátt (Mynd 6b,c). Western blot greining sýndi að CDP(Cistanchedeserticolafjölsykra)stuðlað að þíóredoxíni (TRX1) og glútaþíon redúktasa (GSR) tjáningu en bæla tjáningu á framkallanlegum nituroxíðsyntasa (NOS2) í BMM sem voru meðhöndluð með RANKL og M-CSF í 3 daga (Mynd 6d).

Til að kanna frekar hvort CDP(Cistanchedeserticolafjölsykra)bældu aðgreining beinþynna með því að draga úr ROS framleiðslu, við meðhöndluðum síðan BMM með peroxíði (10 µM) til að líkja eftir háu ROS ástandi í frumum. BMM var framkallað af RANKL og M-CSF í 3 daga og niðurstöður westernblot greiningar og RT-PCR sýndu að peroxíð stuðlaði að NFATc1 og c-Fos tjáningu samanborið við samanburðarhópana. Í samræmi við niðurstöðurnar á mynd 5 var tjáning NFATc1 og c-Fos bæld af CDP(Cistanchedeserticolafjölsykra)en peroxíð bjargaði hamlandi áhrifum CDP (Mynd 6e,f). Þessi gögn bentu til þess að CDP bældi tjáningu á NFATc1 og c-Fos með því að hreinsa ROS framleiðslu.

3.6|CDP(Cistanchedeserticolafjölsykra)bælir MAPK ferlum við RANKL-framkallaða beinþynningarmyndun

Næst könnuðum við áhrif CDP(Cistanchedeserticolafjölsykra)meðferð á RANKL-miðlaðri TRAF6 tjáningu og MAPK ferilvirkjun. Eftir ræktun í sermifríum miðli í 2 klst. voru BMM örvuð með RANKL, með eða án CDP, í 60 mín. Örvun með CDP (10 µM) hafði engin áhrif á TRAF6 tjáningu og dró úr fosfórun JNK2 og ERK1/2 eftir 10 og 20 mínútur (Mynd 7). Að auki var p38 fosfórun marktækt hamlað af CDP(Cistanchedeserticolafjölsykra)meðferð í 60 mínútur samanborið við samanburðarhópa (Mynd 7). Þessi gögn sýna að CDP(Cistanchedeserticolafjölsykra)bælir MAPK-boðaleiðum af völdum RANKL, í samræmi við hamlandi áhrif þess á myndun og virkni beinþynningar.

4|UMRÆÐA

Cistanche, þekktur sem „eyðimerkurginseng,“ hefur vakið mikla athygli að undanförnu fyrir getu sína til að móta ónæmi og verka verndandi við öldrun og oxunarálag (Jia o.fl., 2012; Snytnikovaet al., 2012). Sýnt hefur verið fram á að fenýlprópanóíð-útskipt glýkósíð, helstu virku þættir Cistanche, hamla NO-virkni í átfrumum (Ahn, Chae, Chin og Kim, 2017). Auk þess er aCistancheútdráttur minnkaði oxunarálag í endurrennt hjartavöðva eftir blóðþurrð og gegndi mikilvægu hlutverki í hindrun á apoptótískum ferlum sem leiða til hjartaverndar (Yu, Li og Cao, 2016). Sem mikilvægur þáttur í Cistanche, CDP(Cistanchedeserticolafjölsykra)hefur margvíslega lyfjafræðilega virkni. Núverandi rannsókn okkar leiddi í ljós að CDP bældi RANKL-virkjaða beinþynningaraðgreiningu og virkjun með því að draga úr ROS framleiðslu sem og NFAT og MAPK virkjun.

Sem súr fosfatasi er TRAcP til í ýmsum frumum og er mikið til í beinfrumum og átfrumum í lungnablöðrum (Snipes, Lam, Dodd, Gray og Cohen, 1986). TRAcP er einkennandi ensím fyrir beinþynningar og tjáning þess er nátengd beinþynningastarfsemi, talin vísbending um beinþynningarvirkni og beinupptöku (Minkin, 1982). Í rannsókn okkar, CDP(Cistanchedeserticolafjölsykra)hamlaði fjölda TRAcP-jákvæðra frumna, sem gefur til kynna að RANKL-framkallað beinþynningarmyndun hafi verið læst af CDP(Cistanchedeserticolafjölsykra). Niðurbrot beinagrunns af völdum beinþynningar fer eftir cathepsin K (CTSK) og MMPs (Gruber, 2015). Hér dró CDP verulega niður tjáningu á beinþynningargenum eins og Mmp9, Ctsk og Acp5.

Beinþynningaraðgreiningu og virkni er stjórnað af mörgum boðleiðum (Boyle, Simonet og Lacey, 2003). Eftir tengingu við RANK fær RANKL til liðs við sig aðlögunarprótein TRAF6 til að virkja tjáningu NFATc1, sem er mikilvægur umritunarþáttur fyrir myndun osteoclasts, sem hefur áhrif á osteoclast-sértæka genatjáningu, þar á meðal TRAcP og CTSK (X. Feng, 2005; Takayanagi o.fl., 2002). Í þessari rannsókn komumst við að því að CDP(Cistanchedeserticolafjölsykra)hafði engin áhrif á RANK og TRAF6 tjáningu í osteoclasts. Hins vegar CDP(Cistanchedeserticolafjölsykra)hamlaði RANKL-framkallaða NFATc1 virkjun við beinþynningu BMMs. Að auki var sýnt fram á að ROS, framleitt af hvatberum í því ferli að afhenda rafeindir, stuðlaði að útbreiðslu og aðgreiningu osteoclasts og stjórnaði niðurbroti beinfylkis (Ha o.fl., 2004). Nýleg rannsókn leiddi í ljós að RANKL olli Bach1 kjarnainnflutningi og dró úr Nrf2-miðlaðri andoxunarensímframleiðslu, og eykur þar með innanfrumu ROS tjáningu og osteoclastogenesis í músum (Kanzaki o.fl., 2017). Að auki jókst innanfrumu ROS myndun með homocysteine ​​eykur dosteoclast myndun og virkni (Koh et al., 2006). Rannsóknin okkar leiddi í ljós að CDP minnkaði ROS uppsöfnun í beinþynningum með því að hindra tjáningu NOS2 og stuðla að tjáningu andoxunarensíma, eins og TRX1 og glútaþíon redúktasa. Þegar við meðhöndluðum BMMs með peroxíði til að auka innanfrumu ROS uppsöfnun sýndu niðurstöðurnar að aukin ROS gæti bætt NFATc1 tjáningu að ROS var uppstreymis á ROS. NFATc1.Við komumst líka að því að peroxíð bjargaði hamlandi áhrifum CDPon NFATc1 tjáningar. Svo, gögn okkar benda til þess að CDP bæli ROS uppsöfnun til að hamla NFATc1 tjáningu, síðan til að bæla niður myndun og virkni.

ERK, JNK og p38 tilheyra MAPK fjölskyldunni, sem tekur einnig þátt í stjórnun á beinþynningaraðgreiningu (Seger & Krebs, 1995). RANKL virkjar MAPK ferlið með því að auka fosfórun ERK, JNK og p38 (Mizukami o.fl., 2002). Við sýndum fram á að CDP(Cistanchedeserticolafjölsykra)bæla niður RANKL-miðlaða fosfórun lykilpróteina í MAPK brautinni og stuðlaði þar með að hamlandi áhrifum CDPon á tjáningu beinoklastmerkja gena. Að okkar viti er þetta fyrsta rannsóknin sem sýnir hamlandi áhrif CDP(Cistanchedeserticolafjölsykra)um ROS framleiðslu, NFAT og MAPK virkjun, sem táknar nýja verkunarmáta CDP in vitro.

Í stuttu máli sýndum við fram á að CDP(Cistanchedeserticolafjölsykra)dregur úr beinþynningarmyndun og uppsog hýdroxýapatíts og tjáningu beinþekkjamerkja gena þar á meðal Ctsk, Mmp9 og Acp5. CDP(Cistanchedeserticolafjölsykra)hægt að bæla RANKL-miðlaða ROS framleiðslu, sem og NFAT og MAPK virkjun (Mynd 8). Samanlagt benda niðurstöður okkar til þess að CDP(Cistanchedeserticolafjölsykra)getur verið frambjóðandi lyf til að meðhöndla beinþynningartengda sjúkdóma sem fylgja ROS offramleiðslu.

MYND 8 Skýringarmynd af CDP(Cistanchedeserticolafjölsykra)virkni í beinþynningaraðgreiningu. CDP(Cistanchedeserticolafjölsykra)bælir RANKL-framkallaða ROS framleiðslu, sem og NFATc1 og MAPK virkjun, og hindrar þar með beinþynningu. CDP,Cistanchedeserticolafjölsykra; MAPK, mítógenvirkjaður próteinkínasi; NFATc1, kjarnaþáttur virkjaðrar T frumu; RANKL, viðtakavirkjari kjarnaþáttar κBligand; ROS, hvarfgjarnar súrefnistegundir [Hægt er að skoða litmynd áwileyonlinelibrary.com]

VIÐTAKNINGAR

Þessi rannsókn var studd af Nature Science Foundation of China (81572164), National Key Technology Research and Development Programme of China (2017YFC1103300), Natural Science Foundation of Guangxi Province (2016GXNSFAA380295), og University Science and Technology Research Project Guangxi Province (KYB04015YB05YB0415YB05YB0415YB05YB05YB05YB0415YB015YB016GXNSFAA380295). ). Það er einnig stutt að hluta til af GuangxiScientific Research and Technology Development Plan Project (GKG13349003, 1598013‐15), Western Australia Medical & HealthResearch Infrastructure Fund, Arthritis Australia Foundation, The University of Western Australia (UWA) Research CollaborationAwards, og Australian Health and Medical Rannsóknaráð (NHMRC, nr. 1107828 og 1027932).

Hagsmunaárekstrar

Höfundar lýsa því yfir að ekki sé um hagsmunaárekstra að ræða

Frá: 'Cistanchedeserticolafjölsykradregur úr beinþynningu og beinupptöku með því að hindra RANKL boð og hvarfgjörn súrefnisframleiðslu af Dezhi Song o.fl.

---©2018 Wiley Periodicals, Inc. wileyonlinelibrary.com/journal/jcp J Cell Physiol. 2018;233:9674–9684