efni og aðferðir

6. Frumuupptökupróf

Fylgst var með innheimtu EVs í frumur með því að fyrst lita LEVs og SEVs með fitusæknum DiI (MOP-D -3911) (Invitrogen, Carlsbad, CA, Bandaríkjunum). Eftir að hafa meðhöndlað frumur með lituðum EVs í 1, 3, 6, 12, 24 og 48 klst, var vaxtarmiðillinn fjarlægður og frumur festar með 4 prósent paraformaldehýði (Wako, Japan). Hoechst 33342 (Invitrogen) var bætt við og frumurnar voru ræktaðar í 15 mínútur við stofuhita til að lita kjarnana (bláa). Að lokum voru frumur þvegnar með PBS sem innihélt 1 prósent nautgripasermisalbúmíns og flúrljómun (rautt og blátt) sást undir flúrljómunarsmásjá (Leica Microsystems, Wetzlar, Þýskalandi). Að minnsta kosti þrjú svið voru valin og greind með ImageJ hugbúnaði.

7. Mæling á melaníninnihaldi

Til að meta innihald melaníns voru B16BL6 sortuæxlisfrumur fyrst sáð í 24-brunnsplötur (5 × 104 frumur/brunn) í rúmmáli 500 μL. Eftir 24 klst ræktun, frumurvoru meðhöndlaðir með 100 nM -MSH (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) einu sér eða 50 μL LEV og SEV við 1, 5 og 10 µg/mL í 48 klukkustundir. Eftir meðferð voru frumurnar þvegnar með PBS og síðan ræktaðar með 2,5 prósent trypsíni (Gibco, Thermo Fisher Scientific) til einangrunar. Frumu örkúlur voru leystar upp í 1n natríumhýdroxíðlausn (Sigma-Aldrich) sem innihélt 1 prósent DMSO (Sigma-Aldrich) í 1 klukkustund við 80 gráður. Frumulýsin voru flutt yfir á 96-brunnsplötu og melaníninnihaldið var ákvarðað með því að mæla gleypni við 405 nm með því að nota ensímmerki (BioTek). Melaníninnihald var ákvarðað með því að nota melanín staðalferil sem var smíðaður úr 0-100 µg/mL tilbúinni melanínlausn (Sigma-Aldrich) (utanfrumublöðrur Mynd eins og hér segir). Melaníninnihald var reiknað út með samanburði við viðmið.

8. Týrósínasavirkniprófun

TYR virkni var mæld með því að nota L-DOPA oxidasa virkni. B16BL6 frumur voru sáðar í -MEM miðli sem innihélt 100 nM Sigma-Aldrich -MSH (500 μL) og ræktaðar í þéttleika 1 × 105 frumur/holu í 24-brunn ræktunarplötum. Eftir að hafa meðhöndlað frumur með 50 μL af LEVs og SEVs í styrkleikanum 10, 50 og 100 µg/ml í 24 klst., voru frumur þvegnar með PBS og ljósaðar með 1 prósent Triton X -100 (Sigma-Aldrich). Skýrðu frumurnar voru ræktaðar við - 80 gráðu í 30 mínútur og síðan frostþurrkaðar og geymdar við RT í 10 mínútur. Sýnin sem fengust voru skýrð með skilvindu við 12,000 × g í 15 mínútur, eftir það var 2 mg/ml L-DOPA (Sigma-Aldrich) bætt við og ræktað við 37 gráður í 1 klst. Frásog var síðan mæld við 490 nm með því að nota ensímmerki (BioTek). Gleypið var síðan mælt við 490 nm með BioTek.

Smelltu hér til að fáCistanche ávinningurinn af hvítandi húðoghver eru áhrif Cistanche tubulosa

9. Western blot greining

Próteinmagn í tengslum við mótefnavaldandi ferli var ákvarðað innanfrumu með Western blot greiningu á heilfrumuútdrætti. Rúmmál 500 μL af B16BL6 sortuæxlisfrumum í músum var sáð í 24-brunnsplötur (1 × 105 frumur/brunn). Frumur voru ljósaðar með ræktun í RIPA jafnalausn (Thermo Fisher Scientific) í 20 mínútur í viðurvist próteasahemlablöndu (Roche, Þýskalandi) og meðhöndlaðar með 50 μL af 10, 50 og 100 μg/mL af EVs í 24 klst. Frumulýsin voru skilin í skilvindu við 17 709 g í 15 mínútur og próteinstyrkurinn í lýsunum sem myndast var ákvarðaður með því að nota BCA prófunarbúnað (Thermo Fisher Scientific). Jafnt magn af próteini (10-20 ug/sýni) var hlaðið í brunna Bolt 4-12 prósent Bis-Tris Plus gel (Invitrogen) og rafflutt í PVDF (pólývínýlíden flúor) himnur (GE Healthcare, Chicago, IL, Bandaríkjunum). Himnurnar voru skolaðar með Tris-bufferuðu saltvatni sem innihélt 0,2 prósent (v/v) ten -20 (TBST), lokað með TBST sem innihélt 5 prósent (w/v) undanrennu (Gibco, Thermo Fisher Scientific) í 1 klst. við RT, og síðan ræktað við 4 gráður í frummótefnalausn þynnt með 1 prósent (w/v) undanrennu. Ræktun var framkvæmd yfir nótt. Aðal mótefni sem notuð voru voru and-TRP-1 (1:1000), and-TRP-2 (1:1000) og and-MITF(1:1000) mótefni frá Abcam, Cambridge, Bretlandi; and-TYR (1:500) mótefni frá Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, Bandaríkjunum). And- -aktín mótefni (1:500; Santa Cruz) var notað til að staðla á próteinstigi. Aðal mótefni greindust með piparrótarperoxidasa (HRP) merktu aukamótefni frá Genetex (Irvine, CA, Bandaríkjunum). Himnur voru þvegnar með TBST og ræktaðar í 1 klst við RT með 1:2000 þynningu af aukamótefninu í TBST. Merkið sem myndast eftir þvott á himnunni með TBST og ræktun með aukinni efnaljómun (ECL) hvarfefni (GE Healthcare) var greint með því að nota ImageQuant 350 hlaupmyndakerfi (GE Healthcare).

10. Rafeindasmásjárgreining á melanínframleiðslu innanfrumu

Frumur voru unnar með LEV eða SEV og ræktaðar í 48 klst. Eftir meðferð voru frumur festar með ræktun með 200 mM kakódýlatbuffi sem innihélt 8 prósent glútaraldehýð og 20 prósent paraformaldehýð (Wako). Eftir að hafa verið þurrkaður með etanóli voru ofurþunnir hlutar útbúnir með Leica EM UC7 míkrotóm (Leica) og safnað á 200-möskva koparnet. Hlutar voru litaðir með 1 prósent úranýlasetati og blýsítrati og myndir voru teknar með JEOL JEM 1010 rafeindasmásjá (JEOL) við 80 kV.

Cistanche þykkni

11. Mæling á hvítunaráhrifum með því að nota mannshúðlíkan

Derm-me (Tego Science, Seoul, Kóreu) húðlíkan manna var notað til að prófa hvítandi áhrif LEVs. Húðvefur manna var meðhöndlaður með 10 μg/mL af lev í 7 daga sem neikvæða samanburð. Styrkur arbútíns var 70 µg/ml. Húðvefur manna var leystur upp í 1 N NaOH og gleypni við 405 nm var mæld með því að nota ensímmerki (BioTek) til að ákvarða melaníninnihaldið. Á 7. degi var litarefni húðarinnar borið saman með smásjágreiningu á Fontana - mason lituðum sýnum. Fyrir Fontana-Masson litun voru húðsýni fest yfir nótt við RT í 4 prósent paraformaldehýði (Waco), sneidd í sneiðar og felld inn í paraffínvax. Parafín-innfelldir hlutar voru síðan hitaðir í ofni við 60 gráður í 1 klst til að þorna. Hlutarnir voru síðan lagðir þrisvar sinnum í xýlen, tvisvar í 95 prósent etanóli og tvisvar í 100 prósent etanóli og síðan skolaðir með eimuðu vatni. Fontana-Masson litun var framkvæmd með því að nota ammoníak silfurlausnina við 56 gráður og þvegin með eimuðu vatni. Glerurnar voru síðan festar í 0,2 prósent gullklóríðlausn og sökkt í 5 prósent natríumþíósúlfatlausn við stofuhita. Að lokum voru glærurnar þurrkaðar í fersku áfengi.

12. Tölfræðigreining

Gögnin sem fengust úr tilraununum eru gefin upp sem meðaltal ± SEM. Við gerðum tilraunir með fjórar lotur af virkni, melaníninnihaldi og TYR virkni (viðbótarmynd S3). Einhliða dreifnigreining (ANOVA) og Dunnetts próf voru framkvæmd með GraphPad Prism (GraphPad Prism Software Inc., San Diego, CA, Bandaríkjunum). p < munur; 0.05, p < 0.01, p < 0.001 voru talin tölfræðilega marktæk.

Cistanche tubulosa þykkni

Umræða

Öfugt við flestar heilkjörnungafrumur hafa plöntur flókinn frumuvegg, sem er mikilvæg hindrun fyrir hreyfingu exósóma. Fyrir vikið losa plöntufrumur útfrumna í gegnum röð fjölblöðrulaga sem sameinast plasmahimnunni. Seytingarafurðirnar sem losna við seytingu plantna eru settar í periplasmic bilið sem liggur að plasmahimnunni; þegar þau safnast upp mynda þau þrýsting sem gerir seytingunni kleift að fara yfir frumuveggþröskuldinn. Fyrir vikið er hægt að losa seytt efni, þar á meðal exósóm, án þess að þurfa orku. EVs úr plöntum eru svipaðar að stærð og eða stærri en náttúrulegar frumur í dýrafrumum og eru svipaðar þeim sem sjást í sólblómafrumum (50-200 nm) og Arabidopsis EVs (50-300 nm). Skilvirkni frumuupptöku er talin vera lykilákvarða virkni, þar sem markmið margra lækningalyfja eru staðsett innanfrumu. Þess vegna ákváðum við bestu tímasetningu og styrk upptöku sortuæxlafrumna og sáum hraðan flutning LEVs og SEVs til sortuæxlisfrumna innan 12 klukkustunda.

TYR er glýkóprótein sem hvatar umbreytingu l-tyrosinasa í L-DOPA, hraðatakmarkandi skrefið í myndun melaníns. Báðar rafbílarnir sýna sortuvaldandi áhrif, en mótefnavaldandi áhrif LEV eru marktækt meiri en SEV.

Melanínframleiðsla er stjórnað af -MSH-MC1R og vitað er að hömlun á PKC dregur úr litarefni húðar og hárs. Hins vegar benda margar erfðafræðilegar, lífefnafræðilegar og lyfjafræðilegar rannsóknir til þess að -MSH-MC1R merkjaleiðin sé aðal drifkraftur sortumyndunar. Þrátt fyrir að tilraunir okkar sýndu ekki bein víxlverkun milli MITF og TYR, var sýnt fram á að LEVs hamla sortumyndun með því að draga úr MITF tjáningu í gegnum UV-háða -MSHMC1R ferilinn, sem aftur dregur úr tjáningu TYR, TRP-1, og TRP-2. Við gerum ráð fyrir að TRP fjölskyldupróteinin séu óbeint tengd hvert öðru, en frekari tilraunir gætu þurft til að sýna fram á bein víxlverkun þeirra á milli. Ennfremur sýna endurgerð húðlíkön af mönnum að UV-framkallað melanín nýmyndun og melanín innihald eru í raun hindrað af LEV.

Cistanche dulcis

Niðurstaða

Niðurstöður okkar benda til þess að LEVs séu umsækjendur fyrir ný mótefnavaldandi lyf sem draga úr sortumyndun með því að hindra tjáningu melaníntengdra próteina. Niðurstöðurnar staðfestu að LEVs minnkuðu MITF og lækkuðu þar með TRP í B16BL6 sortuæxlisfrumum. levs og arbutin hamluðu TRY um 66 prósent og 67 prósent, í sömu röð. Melaníninnihald endurgerðrar húðar sem var meðhöndluð með LEVs minnkaði um 43 prósent og 28 prósent samanborið við ómeðhöndlaða neikvæða samanburðinn og arbútín sem jákvæða samanburðinn, í sömu röð.

Byggt á fyrstu niðurstöðum teljum við að rafbílar úr plöntum gætu verið gagnlegir sem mótefnavaldandi efni til að þróa náttúrulegar snyrtivörur. Frekari rannsókna er þörf í framtíðinni til að þróa rafbíla sem eru unnin úr plöntum sem áhrifaríkt innihaldsefni til að bæta húðina og nauðsynlegt er að sýna fram á öryggi rafbíla sem eru afleiddir úr plöntum á húðlíkönum manna. Niðurstöður okkar benda til þess að hægt sé að nota EV til að draga úr melaníni og gera þannig húðina bjartari. Hins vegar getur EV haft eituráhrif á húðina og gera ætti aðrar tilraunir eins og ofnæmispróf eða Ames próf.

HEIMILDIR

[1] Nosanchuk JD, Nimrichter L, Casadevall A, o.fl. Hlutverk fyrir blöðruflutning stórsameinda yfir frumuveggi í meingerð sveppa. Commun Integr Biol. 2008;1(1):37–39.

[2] Robinson DG, Ding Y, Jiang L. Óhefðbundin próteinseyting í plöntum: mikilvægt mat. Protoplasma. 2016;253(1):31–43.

[3] Paiva EA. Hvernig fara seytingarefni yfir plöntufrumuvegginn til að losna? Ný tilgáta sem felur í sér hringlaga vélrænni verkun frumplastsins. Ann Bot. 2016;117(4):533–540.

[4] Hood JL, Scott MJ, Wickline SA. Hámarka stöðugleika exosome colloidal eftir rafporun. Anal Biochem. 2014;448(1):41–49.

[5] Rutter BD, Innes RW. Utanfrumublöðrur sem eru einangraðar frá blaðaapoplasti bera streituviðbragðsprótein. Plant Physiol. 2017;173(1):728–741.

[6] Luan X, Sansanaphongpricha K, Myers I, o.fl. Verkfræðilegar exósómar sem fágaðir líffræðilegir nanóvettvangar fyrir lyfjagjöf. Acta Pharmacol Sin. 2017;38(6):754–763.

[7] Videira IF, Moura DF, Magina S. Aðferðir sem stjórna sortumyndun. Bras Dermatol. 2013;88(1):76–83.

[8] Park HY, Lee J, Kapasi S, et al. Staðbundin notkun próteinkínasa C hemils dregur úr litarefni húðar og hárs. J Invest Dermatol. 2004;122(1):159–166.

[9] Yamanishi DT, Graham M, Buckmeier JA, o.fl. Mismunandi tjáning próteinkínasa C gena í venjulegum sortufrumum nýbura og sortuæxlum með meinvörpum. Krabbameinsvaldandi. 1991;12(1):105–109.

[10] Borovansky J, Riley PA. Melanín og melanósóm: lífmyndun, lífmyndun, lífeðlisfræðileg og meinafræðileg virkni. Hoboken, NJ: Wiley-Blackwell; 2011

[11] D'Mello S, Finlay G, Baguley B, o.fl. Merkjaleiðir í sortumyndun. Int J Mol Sci. 2016;17(7):1–18.