GRP78 oftjáning kveikir bleiku1-IP3R-miðlaða taugaverndandi hvatvef 2. hluti

2.5. Western Blot

Við svæfðum rottur djúpt með Dolethal (n=4) við 7 dpi til að fá L4–L5 mænuhluta (5- mm lengd) fyrir Western blot greiningu. Við skyndifrystum sýnin í fljótandi köfnunarefni.

Á undanförnum árum hafa fleiri og fleiri rannsóknarniðurstöður sýnt að náin tengsl eru á milli próteinflettingar og minnis. Próteinfletting er greiningartækni til að greina tjáningu próteina, sem hefur verið mikið notuð í taugavísindarannsóknum.

Tenging taugafrumna er nátengd geymslu minni. Próteinfletting getur greint tengslastöðu milli taugafrumna og tjáningu próteina fyrir og eftir taugamótun, sem leiðir enn frekar í ljós mikilvægu hlutverki próteina í minnismyndun og geymslu.

Rannsóknir hafa komist að því að tjáning taugafrumna próteina í taugamótum er nátengd myndun og geymslu minni. Til dæmis, meðan á náms- og minnisferlinu stendur, breyta taugafrumum tjáningu presynaptic próteina, og þessi breyting tengist myndun og geymslu nýrra minninga. Að auki hafa sumar rannsóknir einnig leitt í ljós að breytingar á tjáningu sumra próteina tengjast taugahrörnunarsjúkdómum eins og Alzheimerssjúkdómi.

Þess vegna getur próteinfletting veitt ítarlegan skilning á tengslastöðu milli taugafrumna og breytingum á tjáningu skyldra próteina, sem leiðir í ljós sameindakerfi taugafrumna. Þetta hefur mikla þýðingu fyrir rannsókn á kerfi minnismyndunar og taugahrörnunarsjúkdóma.

Í stuttu máli má segja að sambandið á milli próteinflettingar og minnis sýnir hlutverk próteina í tengslum milli taugafrumna og minnisgeymslu. Þetta gefur nýjar hugmyndir og leiðbeiningar til að rannsaka hvernig minnismyndun og taugahrörnunarsjúkdómar eru. Leyfðu okkur að efla taugavísindarannsóknir á virkan hátt og stuðla að heilsu og langlífi! Það má sjá að við þurfum að bæta minnið og Cistanche getur bætt minnið verulega vegna þess að það hefur andoxunar-, bólgueyðandi og öldrunaráhrif, sem getur hjálpað til við að draga úr oxunar- og bólguviðbrögðum í heilanum og vernda þannig heilsu tauga. kerfi. Að auki getur Cistanche einnig stuðlað að vexti og viðgerð taugafrumna og þar með aukið tengsl og virkni tauganeta. Þessi áhrif geta hjálpað til við að bæta minni, námsgetu og hugsunarhraða og geta einnig komið í veg fyrir vitsmunalegan truflun og taugahrörnunarsjúkdóma.

Smelltu vita leiðir til að bæta heilastarfsemi

Sýni voru geymd eða unnin frekar með einsleitni í lýsisbuffi (20 mM HEPES, pH 7,7, 251 mM súkrósa, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA og kokteil af próteasa (Sigma-Aldrich) og fosfatasahemlum (Roche, Basel, Sviss) ) með Potter einsleitara á ís.

Eftir skilvindu lýsis við 800× g í 20 mínútur við 4◦C, söfnuðum við flotinu sem eftirkjarnahluta, og magngreindum prótein með BCAassay (Pierce Chemical Co.).

Fyrir western blotting hlóðum við 30 µg af eftirkjarnahlutum af L4–L5 hlutum úr hverju dýri á 12% SDS-pólýakrýlamíð hlaup til að framkvæma rafrænan aðskilnað á próteinum og fylgt eftir með flutningi yfir í PVDF himnu í BioRadcuvette kerfi í 25 mM Tris, pH 8,4, 192 mM glýsín, 20% (v/v) metanól.

Við lokuðum himnurnar með 5% BSA í PBS auk 0.1% Tween-20 í 1 klst við stofuhita og ræktuðum síðan við 4 ◦C yfir nótt með aðal mótefni: músa anti- -aktín ( 1:10000; SigmaAldrich), mús gegn GRP78 (1:500, Sigma-Aldrich), mús gegn CV (1:1000, Invitrogen), kanína andstæðingur-HSP60 (1:500, mótefni-á netinu), mús gegn- NDUFA9 (1:1000, Invitrogen), mús andstæðingur-OPA1 (1:1000, BD Biosciences), kanínu andstæðingur-Parkin (1:500, Abcam, Cambridge, Bretlandi), mús andstæðingur-PINK1 (1:500, Abcam), kanína and-NRF2 (1:500, Abcam), and-MNF2 (1:500, Abcam), kanína and-GRP75 (1:500, Abcam).

Eftir nokkra þvotta voru himnur ræktaðar í 2 klst með viðeigandi aukamótefni tengt piparrótarperoxídasa (1:5000, vektor). Himnan var sýnd með því að nota efnaljómandi blöndu af 1:1 (0,5 M luminol, 79,2 mM p-kúmarsýru, 1 M Tris-HCl, pH 8,5) og (8,8 M vetnisperoxíð, 1 M Tris-HCl; pH 8,5), og Myndir voru teknar með Gene Genome tæki og greindar með Gene Snap og Gene Tools hugbúnaðinum (Syngene).

2.6. In Vitro líkan

NSC34 frumur voru ræktaðar í breyttum Eagle's miðlungs háum glúkósa (DMEM, Biochrom, Cambridge, Bretlandi) ásamt 10% fóstursermi (Sigma-Aldrich), 100 einingar/mLpenicillín og 0,5 X penicillín/streptomycin lausn (Sigma-Aldrich) og haldið í rakaðri hitakassa við 37 ◦C undir 5% CO2, í meginatriðum eins og áður hefur verið lýst [26].

Eftir 4 daga frumuræktun án þess að skipta um miðil voru NSC34 frumur með sérhæfða svipgerð sem einkennist af tilvist langra taugafruma. Á degi 4 var lyfjum bætt við frumurnar. Tun (Sigma-Aldrich, Missouri, Bandaríkjunum) og EFV (Bristol-Myers Squibb, New York, Bandaríkjunum) lausnir voru unnar í styrkleikanum 10X og leystar upp í DMEM.

Eftir 24 klst. var lífvænleiki frumna metinn með því að rækta frumurnar með 4 mg/ml MTT lausn í 3 klst. Bláu formazan kristallarnir sem mynduðust voru leystir upp í DMSO og gleypni við 570 nm var mæld með örplötulesara (Elx800, Bio-tek, Winooski, VT, Bandaríkjunum).

2.7. Kjarnabrot

Við fluttum milljón frumur með 2 µg plasmíði til tjáningar á GFP, GRP78, HAPARK, mús sh-eGFP, mús sh-PINK1 (ID 68943, Tebu-bio), mús sh-Hspa5 (ID 14828, Tebu-bio) og /eða mús sh-IP3R (ID 16440, Tebu-bio) með því að nota Amaxa Nucleofector II TM (Lonza, Basel, Sviss) og Nucleofactor V settið (Lonza) í samræmi við tilmæli framleiðanda.

Fyrir kyrrstöðugreiningu sáðuðum við frumurnar í {{0}} vel plötur húðaðar með 10% kollageni. Eftir ræktun festum við frumurnar með 4% PFA, skoluðum tvisvar með PBS og geymdum eða bættum í kjölfarið við blokkandi stuðpúða sem innihélt PBS 0,3% (v/v) Triton X-100 og 10% af sermi fósturs. Eftir 3 daga frumuræktun var lyfjum uppleyst í DMEM bætt við.

Fyrir þessar tilraunir notuðum við 1 µM Tun (Sigma-Aldrich), 10 µMCCCP (Sigma-Aldrich), 5 µM CsA (Sigma-Aldrich), eða 10 µM BAPTA-AM (Sigma) -Aldrich). Eftir 5 klst. eftir meðferðina festum við frumurnar annað hvort fyrir ónæmisfrumuefnafræði með 4% PFA eða gerðum þær einsleitar í breyttum RIPA jafnalausn (50 mM Tris-HCl, pH 7,5.150 mM NaCl, 1 mM EGTA , 1% NP-40, 0,5% natríumdeoxýkólat, 0,1% SDS, próteasa og fosfatasa kokteila) fyrir ónæmisblettingu. Ónæmisvefjaefnafræði var framkvæmd með því að skola sýnin tvisvar með PBS og ræktað með blokkandi buffer sem innihélt PBSplus 0,3% (v/v) Triton X-100 og 10% fóstursermi.

Við ræktuðum með eftirfarandi frummótefnum: kanínu-anti-IP3R (1:200, Abcam), músa-anti-HA (1:2000, Abcam), músa-anti-GRP78 (1:200, Sigma-Aldrich) og kanínu-anti-HSP60 (1:500, mótefni á netinu). Til að meta hagkvæmni með MTT eins og lýst er hér að ofan, fórum við úr meðferð í 24 klst.

2.8. Mæling á framleiðslu hvatbera ofuroxíðs og ∆ψM

Frumur voru ræktaðar með 2,5 µM MitoSOX fyrir súperoxíðgreiningu eða með 2,5 µMTMRM fyrir ∆ψM greiningu, bæði frá Molecular Probes og Invitrogen á síðustu 30 mínútum meðferðar. Flúrljómun greindist með IX81 Olympus smásjá og magngreind með kyrrstöðu frumfrumumælingar hugbúnaðinum.

2.9. Rafefnafræðileg mæling á súrefnisnotkun

Frumur (1 × 106 á 1 mL í HBSS) voru hrærðar í gasþéttu hólfi við 37 ◦C. Mælingar voru teknar með Clark-gerð O2 rafskauti (Rank Brothers, Cambridge, Bretlandi) og skráðar með Dup.18 gögnum öflunartæki (WPI) strax eftir 5-meðhöndlun með ökutæki eða Tun.

2.10. Hvatbera og frumubrot

Frumur voru einsleitar í leysingarjafna (10 mM HEPES, pH 7,4, 1 mM EGTA, 250 mM súkrósa og kokteil af próteasum (Sigma-Aldrich) og fosfatasahemlum (Roche)) með Potter einsleitara á ís.

Eftir skilvindu lýsis við 2000x g í 5 mínútur, var flotið skilið við 10.000× g í 12 mínútur. Fljótandi vökvinn var talinn leysanlegur hluti (S2) og inniheldur umfrymisprótein og míkrósóm.

The pellet (P2) var auðgað hvatbera brotið, sem var endurleyst í breyttri RIPA jafnalausn (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM EGTA, 1% NP{{8 }}, 0,5% natríumdeoxýkólat, 0,1% SDS, próteasa og fosfatasa kokteila) og próteinstyrkur var ákvarðaður með BCA prófun. Sýni voru síðan unnin fyrir Western blot.

2.11. Sendingarrafeindasmásjá

Við sökktum mænu L{{0}}L5 hluta (1-mm sneiðar) í vatnslausn með 2% (w/v) PFA og 2,5% (v/v) glútaraldehýði (EM einkunn) í 0,1 M PBS, pH 7,4 og settu þau á ruggpalla í 2 klst, síðan fest í 1% (w/v) PFA og síðan fest með 1% (w/v) osmíumtetroxíði (TAAB Lab ) sem inniheldur 0,08% (w/v) kalíumhexasýanóferrat (Sigma-Aldrich) í PBS í 2 klst.

Við gerðum fjóra þvotta með afjónuðu vatni og raðþurrkun í asetoni. Allar aðgerðir voru framkvæmdar við 4 ◦C, eins og áður hefur verið lýst [33]. Við settum sýni í EPON plastefni og fjölliðuðum við 60 ◦C í 48 klst.

Sýni voru unnin til að fá hálfþunna hluta (1 µm) með Leicaultracut UCT örtóm, lituð með 1% (w/v) vatnskenndri tólúidínblári lausn, og skoðuð með ljóssmásjá til að bera kennsl á kviðhornssvæði auðgað með MNs.

Ofurþunnir hlutar (70 nm) voru skornir með demantshníf, settir á húðuð rist og sett í andstæða við hefðbundið úranýl asetat og Reynolds blýsítratlausnir.

Að lokum skoðuðum við hlutana með rafeindasmásjá (Jeol 1400) búin GatanUltrascan ES1000CCD myndavél. Við völdum þrjár sneiðar í hverju ástandi, greindum þrjár MNs á kafla og mældum svæði kjarna samanborið við heildarflatarmál MN með ImageJ verkfærum.

2.12. Lífupplýsingafræði og tölfræði

Við notuðum dreifigreiningar (ANOVA) til að bera saman gildin á milli mismunandi tilraunahópa fyrir gögn sem uppfylltu eðlilega forsendur. Mismunur á milli hópa var greindur með einstefnu ANOVA, fylgt eftir með Tukey's post hoc multiple rangetest, eða með því að nota t-próf ​​nemenda. Allar tölfræðilegar greiningar voru gerðar með GraphPad Prism5 hugbúnaði (n=3–5; p < 0.05 fyrir marktekt).

3. Úrslit

3.1. Texti

3.1.1. Próteomic greining á GRP78 oftjáningu leiddi í ljós hvatbera sem aðalmarkmið

Til þess að bera kennsl á sameindakerfin sem leiða til taugavarna sem miðlað er af GRP78 oftjáningu, gerðum við samanburðarlausa próteingreiningu til að bera kennsl á bæði megindlegan og eigindlegan mun á RA-slösuðum dýrum sem sýkt voru af adenóveirum fyrir oftjáningu á GRP78 (Ad-GRP78), sem áður hefur reynst vera taugavarnarefni. af MNs, eða beta-galaktósíðasa (Ad-ß-Gal) sem stjórn [20].

Sjö dagar eftir meiðsli (dpi) var valinn tími fyrir greininguna samkvæmt fyrri rannsóknum sem gerðar voru á rannsóknarstofu okkar [20,25]. Í fyrri samanburði á líkani af endurnýjun eftir fjarlægu axótómíu og sauma á sciatic taug samanborið við hrörnandi RA líkan okkar, sáum við að merkjaatburðir voru svipaðir þar til 7 dpi, þegar mismunandi hrörnunartilvik komu fram eftir RA [20,25].

LC-MS/MS merkingarlaus greining á eftirkjarnahlutum úr L4-L5 mænuhlutum leiddi til auðkenningar á 1420 próteinum, með að minnsta kosti tveimur peptíðum á hvert prótein eins og áður hefur verið greint frá fyrir önnur sýni og rannsóknir [25] .

Alls voru 566 og 732 prótein eða peptíð marktækt breytt vegna Ad-GRP78 eða Ad-ß-Gal oftjáningar, í sömu röð, í iktsýkisslösuðum dýrum með tilliti til iktsýkisskaddra dýra sem ekki voru sýkt af veiru (p < 0 .05) (Töflur S1 og S2).

Við bárum saman báða listana og komumst að því að 220 voru einstakar breyttar vegna Ad-GRP78 oftjáningar (tafla S3). Virkar skýringar á þessum próteinum með því að nota Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery (DAVID) tólið gerði okkur kleift að bera kennsl á mikilvægustu líffræðilegu hlutverkin í gagnasafninu (FDR < 0,05) [34,35].

Oftjáning GRP78 leiddi til mismunar á magni próteina sem taka þátt í hvatberaferlum, virkni og íhlutum (tafla S4A–C, mynd S1A–C). Genaverufræði (GO) hugtök og KEGG ferli auðgunargreiningar á þessum gögnum leiddu í ljós að hjá dýrum sem voru sýkt af Ad-GRP78 var marktæk lækkun á magni margra próteina með hvatberavirkni, þar á meðal prótein frá ytra og innra andliti hvatbera, prótein í öndunarfærum, og fylkisprótein.

Við staðfestum mun á próteinimagni sem kemur fram í próteinlistanum, svo sem GRP75, sem var uppstýrt (p < 0.05), og undireining flókins V (CV ), niðurstýrð (p=0.03) í GRP78 hópunum eins og búist var við (Mynd 1A).

Yfir allan listann var mest niðurstýrt 2-oxoglútarat/malatburðarprótein OGC (SCL25A11), MT-ND3 (æxlisbæli sem tekur þátt í þemalat-aspartat skutlu og endurnýjar NADH safnið í hvatbera fylkinu sem leyfir flókið I virka), NADH dehýdrógenasa undireining 3 af flóknu I, gammaamínósmjörsýru amínótransferasa ABAT og ubiquinol-sýtókróm C redúktasa undireiningu flókins III. Aftur á móti voru mjög fá prótein stýrð upp (Mynd 1B).

Einuppstýrt prótein var GRP78 eins og búist var við og hin uppstýrðu próteinin voru amínósýruflutningsefnið EAAT2, sem er aðallega staðsett í plasmahimnunni og stundum í hvatberum við örvandi taugamót, og hýdroxýacýl-CoA dehýdrógenasinn HADHA, sem hvatar síðustu þrjú þrep hvatbera beta. -oxun á langkeðju fitusýrum.

Við útvíkkuðum greininguna til að kanna hvort önnur prótein í hvatbera eða hvatbera virknitengdum próteinum hafi verið breytt úr próteómalistanum til að staðfesta virkni hvatberaáhrifa (Mynd 1C).

Við sáum að hvatbera varðveitt dínamín-tengd GTPase sjónrýrnun 1 (OPA1), sem tekur þátt í samruna [36], var lækkuð (p < 0.1); LONP1, ATP-háður próteasi sem miðlar sértæku niðurbroti misbrotna fjölpeptíða, sýndi tilhneigingu til að aukast, en enginn munur sást á magni ubiquinone NDUFA9, umritunarþáttarins NRF2, sem stjórnar genum sem innihalda andoxunarsvörunarþætti eða önnur dínamín. -tengd GTPase sem tekur þátt í innrennsli, svo sem mítófúsín 2 (MFN2) [36].

Yfirgripsmikil samantekt á breytingunum sem finnast innan hvatbera er sýnd í kerfinu á mynd 1D. Virkni hvatbera er mikilvæg fyrir streituviðbrögð þar sem skemmd hvatbera sameinast fyrir efnisskipti og hvatberaklofin gerir aðskilnað skemmdra hvatbera og síðari hvatbera [37].

Með hliðsjón af því að meirihluti niðurstýrðra próteina staðsetur við hvatberana og engar augljósar breytingar sáust varðandi samrunavirkni hvatbera með því að greina MFN2 og hlutfall L/S OPA1 forma (Mynd 1C), rannsökuðum við merki sem tengjast hvatbera.

Klassískt, sjálfsátháð niðurbrot hvatbera á sér stað eftir afskautun, og það er venjulega kveikt af aukinni uppsöfnun fosfatasa og tensinhomolog (PTEN)-framkallaðs hugsanlegs kínasa 1 (PINK1) í fullri lengd á ytri hvatberahimnu.

Í kjölfarið er E3 ubiquitin-prótein ligasa Parkin á milli hringsins ráðinn til að merkja ytri himnuprótín hvatbera af afskautuðu hvatberum með ubiquitylering [38-41]. Efst á mynd 2A sýnir engar breytingar á Parkin-gildum en marktæka lækkun á PINK1 í fullri lengd sem myndast af RA-meiðsli í ípsilateral L4-L5 mænuhlutanum með tilliti til samanburðar við 7 dpi. Aftur á móti minnkaði oftjáning GRP78 Parkin en tvöfaldaði PINK1 gildi eftir iktsýki samanborið við samanburðartjáningu á ótengdu próteini -Gal (Mynd 2A, neðst).

Uppstillingin á PINK1 í fullri lengd er í samræmi við framköllun hvatbera [42], og Parkin minnkun gæti tengst langt gengið ástandi líffæra í sundur eins og sést af restinni af hvatberapróteinum.

Við könnum frekar samstaðsetningu hvatbera og örpíputengdra próteina 1A/1B létt keðju 3 (LC3)-jákvæð punkta, lykilþáttur í kjarna stórsjálfráða vélarinnar og nauðsynlegur fyrir hvatvefsferlið [43].

Með því að nota confocal smásjárskoðun sáum við marktæka aukningu á samstaðsetningu hvatbera, merkt með and-COX IV, með LC 3-jákvæðum punktum eftir RA aðeins í skemmdum MNs sem oftjáðu GRP78 við 7 dpi (Mynd 2B).

Við staðfestum tilvist hvatvefs í afulsuðum MNs aðeins þegar GRP78 var oftjáð með greiningu á sýnum með rafrænni smásjá.

Við sáum mikið af lofttæmum með engulfedmitochondria, einkenni hvatbera [37], sem líkjast hvatberum, og nokkrum ERcisternae í nánum tengslum við hvatbera innan MNs frá Ad-GRP78 dýrum, en við fundum þær ekki í Ad- -Gal RA-slösuðum rottusýni við 5 dpi (mynd 2C).

Mynd 1. Oftjáning GRP78 í RA-slösuðum dýrum miðar að hvatberapróteinum. (A) Ónæmisstærð og súlurit sem sýna meðalfallsbreytingar (± SEM) á GRP78, GRP75 og CV próteingildum í L4-L5 mænuhlutum í GRP78 vs.

-Gal sem oftjáir RA slasaðar rottur um 7 dpi. Stig voru staðlað að aktíngildum (n=4; * p < 0.05 vs. Ad- -Gal, t-próf ​​nemenda). (B) Vísalarit yfir breytingar á próteini í hvatberum sem fengust með próteingreiningu á L4-L5 mænuhlutum frá í iktsýkisslösuðum dýrum sem oftjáa GRP78 samanborið við Ad- -Gal hópinn um 7 dpi. (C) Ónæmisblotta og súlurit sem sýna meðalfellingarbreytingar (± SEM) á NDUFA9, LONP1, NRF2, MFN2, OPA-1 staðlað í aktín. (Enginn marktækur munur á milli hópa. T-próf ​​nemenda). (D) Skematísk hvatbera með próteinum breytt með oftjáningu GRP78 í L4-L5 mænuhlutum frá iktsýkisslösuðum dýrum auðkennd með gulu (minnkað) eða inbláu (aukið) við 7 dpi.

Mynd 2. Mitophagy er mótað in vivo eftir RA í rottum sem oftjáa GRP78. (A) Ónæmisblettur og samsvarandi súlurit fyrir PINK1 og PARK fold change greiningu á próteinmagni (meðaltal ± SEM) staðlað í aktínmagn, í L4-L5 mænuhlutum RA slasaðra rotta vs.

stjórna (efst) eða frá Ad{{0}}Gal og Ad-GRP78 hópum (neðst) um 7 dpi. (n=4; * p < 0,05, t-próf ​​nemenda). (B) Til vinstri, örmyndir af dæmigerðum MNs á ípsilateral staðnum frá RAslösuðum dýrum sem fengu inndælingu í mænuvökva af AAVrh10-GFP eða AAVrh10-GRP78 hópum við 7 dpi. Sýni voru lituð fyrir COX IV (rautt) og LC3 (grænt) og mótlitað með flúrljómandi Nissl (bláu).

Kvarðarstika=10 µm og stafrænn aðdráttur í innfellingum 10X.

Athugaðu að samstaðsetning sést aðeins í AAVrh10-GRP78 hópnum. Hægri, súlurit sem sýnir greiningu á % samstaðsetningarpunkta COX IV og LC3. Meðaltal ± SEM COX IV og LC3 samstaðsetningar (n=4; ** p < 0.01, t-próf ​​nemenda). (C) Fulltrúar rafeindasmásjármyndir þar sem hvatberar eru aðgreindir innan MNs mænu: a, mynd af MN umfrymi sem sýnir hvatbera stjórnandi dýr; b, mynd af MN umfrymi úr RA-slösuðum rottum úr Ad- -gal hópnum; c, mynd af MN umfrymi úr RA-slösuðum rottum úr Ad-GRP78 hópnum með nokkrum inndældum hvatberum merktum rauðum stjörnum; d, mynd með meiri stækkun er sýnd í (C) sem bendir á stóra hvatbera og ER snertingu. Scale bars are indicated in the figures.

Alls bentu þessar niðurstöður til þess að oftjáning GRP78 gæti framkallað mítófagýín ótengd MNs eftir iktsýki og það gæti verið að stuðla að taugavernd.

3.1.2. GRP78 oftjáning endurheimtir skemmda hvatberavirkni

Við könnuðum síðan frekar áhrif GRP78 oftjáningar á hvatbera sem veldur in vitro líkani af ER streitu þar sem þessi móðgun birtist snemma eftir RA áverka in vivoas sem áður hefur verið greint frá [20,26], og það er áreiðanleg aðferð til að skima ný taugavarnarefni [2,44 ].

Þetta líkan notar tunicamycin (Tun), sem er ER-streituvaldur sem veldur myndun N-asetýlglúkósamíns-lípíða milliefna, sem kemur í veg fyrir glýkósýleringu nýmyndaðra próteina og leiðir til þess að prótein misfellast. Við notuðum það vegna þess að einnig hefur verið greint frá því að stöðvuð seytingarferill sé lykillinn í taugahrörnunarferlinu eftir iktsýki [26].

Við sannreyndum fyrst að kjarnafækkun NSC34motoneuron-líkra frumna með viðeigandi vektor leiddi til framleiðslu á GRP78 (Mynd 3A). Í þessum frumum jók tjáning GRP78 verulega lifun í miðli sem inniheldur Tun (Mynd 3B).

Þrátt fyrir að Tun meðferð framkalli venjulega GRP78 sjálft, er þessi innræna oftjáning frekar seint (um 24 klst) (Mynd S2). Við veltum því líka fyrir okkur hvort við gætum ákvarðað hvort GRP78 oftjáning hafi taugaverndandi áhrif í öðru in vitro líkani sem við greindum áður frá að endurskapi nokkra eiginleika MN dauða eftir iktsýkisskaða [26].

Þetta líkan er byggt á frumuskemmdum af völdum nocodazols, sem truflar fjölliðun örpípla. GRP78 tjáning jók einnig lífvænleika frumna sem ræktaðar voru í viðurvist nocodazols (Mynd 3B).

Síðan metum við virkni hvatbera með því að mæla myndun hvarfgjarnra súrefnistegunda (ROS) í hvatberum með MitoSOX, himnumöguleika hvatbera (∆ψm) með því að nota tetramethylrhodamine metýl ester (TMRM), og O2 neysluhraða, í NSC34 frumum okkar sem verða fyrir ER streitu með eða án GRP78 oftjáningar.

Sem jákvæð viðmiðun notuðum við efavírenz (EFV), sem er mítóeiturefni sem breytir öllum þremur breytunum [45]. Við sáum að MitoSOX-magn jókst smám saman eftir Tun viðbót, náði tölfræðilegri marktekt um 24 klst og að ROS-myndun jókst marktækt í EFV-meðhöndluðum frumum frá fyrstu klukkustund eftir meðferð með tilliti til samanburðarhópa sem fengu burðarefni (Mynd S3A).

Oftjáning á GRP78 leiddi til marktækt lægra magns af ROSin hvatberum með tilliti til GFP-tjáandi frumna 24 klst eftir Tun eða EFV meðferð (Mynd 3C). ∆ψm var hrunið eftir 5 og 24 klst af Tun meðferð og eftir 24 klst af EFV meðferð (Mynd S3B). Endurheimt þessa breytu var náð með GRP78 oftjáningu í Tun- eða EFV-meðhöndluðum frumum (mynd 3D).

Hraði O2 neyslu minnkaði á 80 mínútum af greiningu eftir Tun viðbót í frumunum sem tjá GFP (halli −0.063,R2=0.98), en O2 neysla var stöðugt í GRP78-oftjáandi frumum þrátt fyrir að Tun sé til staðar (halli -0,221, R2=0.99) (Mynd 3E, til vinstri).

Eftir 5 klst. var öndun eðlileg í GRP 78-oftjáandi frumum og verulega skert í frumum sem tjáðu GFP (Mynd 3E, til hægri). Alls benda þessar niðurstöður til þess að GRP78 dragi úr hvatberavruflunum af völdum ER streitu eða eiturverkana á hvatbera.

For more information:1950477648nn@gmail.com