Serum Amyloid P útfelling er viðkvæmur og sérstakur eiginleiki himnulíkrar glomerulopathy með grímubúnum IgG Kappa útfellingum

Tengiliður: emily.li@wecistanche.com

Christopher P. Larsen1, Shree G. Sharma1, Tiffany N. Caza1, Daniel J. Kenan1, Aaron J. Storey2, Ricky D. Edmondson2, Christian Herzog2 og John M. Arthur2

LYKILORÐ:glomerulonephritis; grímuklædd innlán; massagreiningu; himnulíkur glomerulopathy; undirþekjuútfellingar

Cistanche getur bætt nýrnastarfsemi

Himnulíkur gauklakvilli með grímubúnum IgG kappa útfellingum (MGMID) er nýlega lýst mynstur glomerulonephritis með einstaka vefjameinafræði. Mynstrið einkennist af undirþekju og/eða mesangialónæmirútfellingar sem eru "grímaðar", til immúnóglóbúlínlitunar með hefðbundinni ónæmisflúrljómun en sterklega litað fyrir IgG og kappa léttkeðju eftir próteasa meltingu. Sjúklingar með þetta mynstur glomerulonephritis eru oftast ungar konur með próteinmigu og óljósa sögu um sjálfsofnæmissjúkdóma eins og lágtítra andkjarna mótefni. Hér bárum við saman massagreiningarsnið leysirfanga örgreindra glomeruli úr níu MGMID nýrnavefsýnum við átta vefjasýni sem sýna önnur mynstur himnuheilakvilla. Próteinið sem jókst mest í MGMID var amyloid P í sermi. Ónæmislitun sýndi amyloid P í sermi samsett með IgG í gaukla MGMID en ekki með PLA2R-tengdum himnuheilakvilla. Amyloid P í sermi var jákvætt í gaukla af öllum 32 MGMID vefjasýnunum en neikvætt í vefjasýnum af öðrum gerðum himnuheilakvilla eins og þeim sem tengjast PLA2R og THSD7A. Það voru fjögur vefjasýni með gauklasermi amyloid P litun meðal 173 vefjasýnanna sem uppfylltu ekki skilyrði fyrir MGMID eða amyloidosis. Allar fjórar þessar vefjasýni með jákvæðri amyloid P litun í sermi voru með himnumynstur gauklakvilla með IgG kappa útfellingum sem voru aðeins frábrugðnar MGMID vegna skorts á "grímu". Þannig, jákvæð litun innan gauklaútfellinga fyrir amyloid í sermi staðfestir einstakt form glomerulonephritis sem líklega deilir sameiginlegum meinalífeðlisfræðilegum sjúkdómsferli.

Himnulík glomerulopathy með grímubúnum IgG kappa útfellingum (MGMID) er vefjameinafræðilegt mynstur gauklabólgu sem lýst var árið 2014, sem var fyrsta lýsingin á því sem kallað hefur verið grímuð gauklaútfellingar. innlán með IgG kappa takmörkun. Merkilegt nokk, þó að litun komplementþáttar 3 (C3) sé oft áberandi með venjubundinni ónæmisflúrljómun á frosnum vef, grímur Ig litunin oft, sem þýðir að hún sýnir falska neikvæða litun með venjubundinni ónæmisflúrljómun en jákvæða litun þegar hún er endurtekin á paraffín-innfelldum vef eftir próteasa meltingu. Þannig að nema meinafræðingur haldi háum vísitölu gruns um þessa aðila, gæti það verið ranglega greint sem C3 gauklakvilla. Aðrar einingar sem hefur verið lýst til að sýna þetta grímufyrirbæri í gauklaútfellingum eru meðal annars himnufjölgunarhnakkabólga með grímu eintýpískum Ig-útfellingum og krýóglóbúlínískri glomerulonephritis.2,3

Sjúklingar sem reyndust hafa MGMID á vefjasýni eru oftast ungar konur<40 years="" of="" age,="" and="" many="" have="" positive=""> serologic study results such as antinuclear antibodies, although few carry a diagnosis of any well-defined autoimmune disease such as lupus.4 Mean proteinuria in a recent case series of 41 patients was 3.5 g/24 h, and mean serum creatinine was found to be 1.4 mg/dl.4 The deposits of all reported cases that could be tested for IgG subclass were of the IgG1 kappa subclass. Despite this monotypic staining on biopsy, the vast majority of patients tested (>95 prósent) voru neikvæðir fyrir einstofna Igs með rafdrætti próteina í sermi og engin tilvik hafa sést í tengslum við undirliggjandi illkynja blóðsjúkdóma.4

Gert var ráð fyrir að sameiginlegar klínísk meinafræðilegar niðurstöður meðal MGMID-sjúklinga gætu verið vísbending um sameiginlegan sameindameinalífeðlisfræðilegan aðferð sem knýr sjúkdóm þeirra. Ætlun okkar með því að tilkynna þessa aðila fyrst var að skilgreina hóp til frekari greiningar.1 Við lýsum hér tilvist próteinsins amyloid p-þáttarins (SAP) sem finnst einstaklega í útfellingum MGMID glomeruli. Ónæmislitun fyrir SAP í gauklaútfellingum er viðkvæm og sértæk tækni til að greina MGMID sem veitir einnig sjúkdómsvaldandi innsýn.

Mynd 1|Serum amyloid P-component (SAP) er umtalsvert auðgað í örgreindum gaukla frá sjúklingum með himnulíkan glomerulopathy með grímubúnum IgG kappa útfellingum. Stöðluð alger magngreiningargildi sem byggjast á styrkleika frá MaxQuant (Max Planck Institute of Biochemistry, Planegg, Þýskalandi) voru notuð við tölfræðilega greiningu. Striklaðar línur sýna heuristic cutoffs fyrir brotabreytingu og P-gildi. (a) Eldfjallalóð sem ber saman 3 fosfólípasa A2 viðtaka (PLA2R)-jákvæð himnutilfelli við önnur greinir 2 prótein sem eru skýrar útlínur í efsta hægri fjórðungnum. (b) Eldfjallalóð sem ber saman 2 thrombospondin tegund 1 lén sem innihalda 7A (THSD7A)-jákvæð himnutilfelli við önnur greinir 2 prótein sem eru skýrar útlínur með THSD7A sem sýnir mestu fellingarbreytinguna. (c) Eldfjallalóð sem ber saman sýni af himnulíkri gauklakvilla með grímubúnum IgG kappa útfellingum við allar aðrar tegundir himnutilfella auðkennir 6 prótein sem eru skýrar útlínur í efsta hægri fjórðungnum. C6, viðbót þáttur 6; C7, viðbót þáttur 7; CFHR1, komplement þáttur-H-tengt prótein 1; HP1BP3, heterókrómatín prótein 1 bindandi prótein 3; HPRT1, hypoxanthin fosfóríbósýltransferasa 1; IGHG3, Ig þungt stöðugt gamma 3.

NIÐURSTÖÐUR

Massagreining leysirfanga örgreindra glomeruli

Massalrófsgreining á laser-fanga örgreindum gaukla úr 9 tilfellum af MGMID var borin saman við 8 tilvik himnuheilakvilla (MG) þar á meðal 3 tilfelli af fosfólípasa A2 viðtaka (PLA2R)-jákvæðum MG, 2 tilfelli af thrombospondini tegund 1 léni sem inniheldur 7A ( THSD7A)-jákvætt MG og 3 tilfelli af lupus MG. Alls greindust 1695 prótein í þessari greiningu. Framkvæmd var sönnunargreining á prinsippinu til að kanna hvort hægt væri að greina prótein sem taka þátt í meingerð sjúkdóms MG með massagreiningu. Fyrir hverja þekkta himnutegund var magn próteinamismunadrifs borið saman við hópana sem eftir voru með því að nota staðlaða styrkleikamiðaða algilda magngreiningu (iBAQ) gildi. Tölfræðileg greining var gerð með því að nota Welch's t-próf ​​og niðurstöðurnar voru sýndar á eldfjallalóð. PLA2R var marktækt meira í tilfellum af PLA2R-tengdum MG og sýndi sterkustu fellingarbreytinguna (Mynd 1a). THSD7A sýndi sterkustu fellingarbreytingar í THSD7A tengdum MG, að vísu með hærra P-gildi vegna lítillar úrtaksstærðar í þessum hópi (n ¼ 2; mynd 1b). Á heildina litið sýndi þessi sönnunaraðferð greining fram á að massagreiningar á leysir-fanga örgreindum glomeruli geta greint prótein sem eru mikilvæg fyrir meingerð sjúkdóma í himnuheilakvilla.

Næst reyndum við að bera kennsl á prótein sem hugsanlega taka þátt í MGMID meingerð með því að nota þessa aðferð. Alls voru 6 prótín marktækt meira í MGMID sýnunum miðað við hina hópana (tafla 1). Próteinið með mestu faltbreytinguna var SAP (Mynd 1c). Próteinin sem eftir voru samanstóð af IgG Kappa, 3 komplementpróteinum og heterochromatin prótein 1 bindandi prótein 3 (HP1BP3). SAP var talinn vera efsti frambjóðandinn þar sem það greindist í öllum MGMID sýnum og sýndi mestan mun á magni miðað við sýni sem ekki voru MGMID. Öll Ig sem auðkennd er með massagreiningu í leysi-fanga örgreindum gaukla úr tilfellum himnulíkrar gauklakvilla með IgG kappa útfellingum eru sýnd í viðbótartöflu S1. Litrófsfjöldi með sýnatöku allra próteina sem sýndu $1 log2 aukið magn í MGMID sýnum og P-gildi #0.1 eru sýndar í viðbótartöflu S2.

Cistanchegetur bætt signýruvirka

SAP litun í tilfellum himnulíkrar gauklakvilla

Fjölstofna kanínumótefni gegn SAP próteini (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) sýndi sterka jákvæða litun meðfram gauklagrunnhimnunni í tilfellum með MGMID sem komu saman við IgG með confocal greiningu. SAP sýndi ekki samsetningu með IgG í glomeruli frá PLA2R tengdum MG (Mynd 2). Fjölstofna kanínumótefni gegn HP1BP3 var prófað í 4 vefjasýnum með MGMID og sýndi neikvæða litun í gauklaútfellingum í öllum 4 tilfellunum.

SAP litun var framkvæmd á alls 211nýrulífsýnimeð glomerulonephritis (tafla 2). Alls lituðust 36 tilfelli með útfellingar af ónæmisgerð jákvætt fyrir SAP. Öll tilfellin sem lituðust jákvætt deildu ákveðnum vefjameinafræðilegum einkennum, þar á meðal tilvist mesangial- og undirþekjuútfellinga með IgG kappa-takmörkun og engar innkirtla- eða himnufjölgunarbreytingar með ljóssmásjá. SAP var neikvætt í öllum tilfellum, með grímubúnum útfellingum sem voru ekki MGMID, þar á meðal 3 tilfelli af krýóglóbúlínískri glomerulonephritis og 3 tilfellum af himnufjölgunarheklabólgu. Það var einnig neikvætt í öllum 19 tilfellum af fjölgandi gauklabólgu með einstofna Ig útfellingu (PGNMID), þar á meðal tilfellum með IgG1 kappa (4 tilvik), IgG2 lambda (1 tilfelli), IgG 3 kappa (8 tilvik) og IgG3 lambda (6 tilfelli) ). Öll 30 tilfellin af fjölstofna himnuheilakvilla (PLA2R, THSD7A, lupus og segmental) voru neikvæð fyrir SAP. Fleiri tegundir gauklabólgu voru einnig rannsakaðar og voru neikvæðar. Meðal sýkingatengdra glomerulonephritis voru 7 jákvæðir fyrir IgG-litun og 6 sem sýndu vísbendingar um útfellingu undirþekju. Eins og búist var við sýndu öll 6 tilfellin af amyloidosis jákvæða litun í amyloid útfellingum. Hins vegar var óhreint útfellingarmynstur í algjörri mótsögn við kornlitunina sem var til staðar í tilfellum MGMID. Fulltrúar örmyndir af glomeruli á SAP lit frá ýmsum mismunandi nýrnasjúkdómum eru sýndar á viðbótarmynd S1.

Öll 32 tilfellin sem áður voru auðkennd sem MGMID voru jákvæð fyrir SAP. Að auki var jákvæð litun fyrir SAP í gaukla frá 4 af 25 tilfellum himnuheilakvilla með eintýpískri IgG útfellingu sem dulaði ekki samkvæmt venju.

ónæmisflúrljómun, þar á meðal 4 af 13 tilfellum með IgG1 kappa, 0 af 2 tilfellum með IgG1 lambda, 0 af 5 tilfellum með IgG2 kappa, 0 af 4 tilfellum með IgG3 kappa og {{ 12}} af 1 tilfelli með IgG4 kappa. Í heildina voru 32 af 36 (89 prósent) af SAP-jákvæðum glomerulopathy gríma og passa í flokkinn MGMID, en hinir 4 af 36 (11 prósent) voru afhjúpaðir og greindir sem MG með IgG1 kappa útfellingar. Sjúklingar með eingerðar himnuheilakvilla sem duldu ekki en voru jákvæðir fyrir SAP voru 33 ára að meðaltali, með hlutfall kvenna og karla 4:0. Tilfelli með eingerðar himnuheilakvilla sem duldu ekki en voru neikvæð fyrir SAP höfðu meðalaldur 59,3 ár með hlutfall kvenna og karla 15:4.

Tafla 1|Prótein fjölgaði umtalsvert í gaukla hjá sjúklingum meðhimnulíkur glomerulopathymeð grímubúnum IgG kappa útfellingum, eins og sýnt er með massagreiningu

Viðbrögð í sermi við SAP

Sermi frá 22 sjúklingum með MGMID, 12 með PLA2R-jákvæða himnuheilakvilla og 6 eðlilegum samanburðarhópum voru prófuð með tilliti til IgG hvarfgirni við SAP með ensímtengdri ónæmissogandi prófun (ELISA). Þrátt fyrir að einhver breytileiki hafi verið fyrir hendi meðal sjúklinga í hverjum hópi, var enginn marktækur munur á IgG hvarfgirni gagnvart SAP milli hópanna (viðbótarmynd S2).

Mynd 2|Colocalization IgG og sermi amyloid P–component (SAP). (a–c) Ónæmisflúrljómunartilraunir sem gerðar voru á nýrnasýni úr vefjasýni úr sjúklingi sem greindur var með himnulíkan gauklakvilla með grímubúnum IgG kappa útfellingum sýna kornótta gauklagrunnhimnulitun fyrir (a) SAP og (b) IgG. (c) Það er sterk samsetning SAP og IgG í gauklagrunnhimnuútfellingum. (d–f) Ónæmisflúrljómunartilraunir sem gerðar voru á nýrnasýni úr vefjasýni úr sjúklingi með 3 fosfólípasa A2 viðtaka-jákvæða himnuheilakvilla sýna (d) neikvæða gauklahimnulitun fyrir SAP og (e) jákvæða kornótta gauklabotnhimnulitun fyrir IgG. (f) Það er skortur á samsetningu hjá þessum sjúklingi með 3 fosfólípasa A2 viðtaka-tengda himnuheilakvilla. Til að hámarka áhorf á þessa mynd, vinsamlegast sjáðu netútgáfu þessarar greinar í töflu 2|Niðurstöður serum amyloid p component (SAP) litunar í nýrnasýnum

AA, amyloid A; AL, amyloid létt keðja; C3, viðbót þáttur 3; GBM, gauklagrunnhimna; MG, himnuheilakvilli; MGMID, himnulíkur gauklakvilli með grímubúnum IgG kappa útfellingum; MPGN, himnufjölgun; glomerulonephritis; PGMNID, fjölgandi glomerulonephritis með einstofna IgG kappa útfellingum; PLA2R, fosfólípasa A2 viðtaki; THSD7A, thrombospondin tegund 1 lén sem inniheldur 7A.

UMRÆÐA

MGMID er nýlega lýst og einstakt mynstur glomerulopathy sem einkennist af undirþekju- og mesangial útfellingum sem litast fyrir IgG kappa með paraffíni IF (Mynd 3). Sjúklingar með þetta mynstur glomerulopathy hafa tilhneigingu til að vera ungar konur (aldur<40 years)="" and="" often="" have="" vague="" autoimmune="" phenomena.="" we="" report="" here="" the="" discovery="" by="" mass="" spectrometry="" of="" increased="" sap="" in="" the="" glomeruli="" of="" these="" patients="" and="" show="" positive="" staining="" for="" this="" protein="" in="" the="" glomerular="" deposits="" of="" 100%="" of="" cases="" diagnosed="" as="" mgmid.="" positive="" staining="" for="" sap="" was="" also="" tested="" in="" a="" wide="" variety="" of="" igmediated="" glomerulonephritis="" types="" and="" found="" to="" be="" present="" in="" 4="" of="" the="" 173="" cases="" tested="" that="" were="" not="" diagnosed="" as="" mgmid="" or="" amyloidosis.="" all="" of="" these="" cases="" that="" stained="" positive="" for="" sap="" but="" were="" not="" diagnosed="" as="" mgmid="" shared="" histopathologic="" fifindings="" with="" mgmid,="" including="" the="" pattern="" of="" immune="" deposition="" and="" igg1="" kappa="" restriction,="" only="" differing="" by="" the="" fact="" that="" they="" did="" not="" mask="" by="" routine="" immunofluorescence.="" additionally,="" these="" patients="" were="" demographically="" similar="" to="" mgmid="" patients="" in="" that="" they="" tended="" to="" be="" young="">

SAP er 25-kDa pentamerískt prótein innan pentraxínfjölskyldunnar sem er kóðað af APCS geninu og er mikið í sermi og sem hluti af gauklagrunnhimnu.5 Þó að nákvæm virkni SAP sé óljós er það vitað að hafa samskipti í blóðvökva við margs konar prótein, þar á meðal complement efnisþætti, apólípóprótein og stýra storku- og próteingreiningu.6 Það myndar stöðugt kalsíumháð víxlverkun við bindla þess, þar á meðal prótein, lípóprótein og DNA, sem verndar þá gegn niðurbroti. SAP þjónar sem leysanleg mynsturþekkingarsameind sem tekur þátt í meðfæddu ónæmissvörun, sem þekkir margs konar sýkla- og skaðatengd sameindamynstur, þar á meðal örveruhluti og apoptótísk frumurusl.7 Samspil SAP við sýkla- eða skaðatengda sameinda Mynstur stuðlar að úthreinsun apoptótískra frumna með beinni bindingu við complement-þátt 1q (C1q) og virkjun klassíska complement-ferilsins. Þrátt fyrir komplementörvun er vitað að SAP veitir ónæmisstjórnun, dregur úr daufkyrningumbólgainnan vefja með skertri viðloðun æðaþels,8 skertri elastasavirkni,9 og skertri samsetningu til vefja.10 SAP er einnig þekkt fyrir að vera aðal bindandi prótein fyrir DNA og litninga í plasma.11

Í sjúkdómum er SAP best þekktur fyrir að vera hluti af útfellingum amyloidosis. Þó að það sé minna vel rannsakað, eru einnig vísbendingar um að það gæti gegnt hlutverki í mönnum og dýralíkönum af sjálfsofnæmissjúkdómum. SAP mótefni hafa verið greind hjá sjúklingum meðsjálfsofnæmisjúkdóma, og sýnt hefur verið fram á að minni SAP tjáning ýtir undirsjálfsofnæmií múslíkönum. Mótefni gegn SAP eru greind hjá 44 prósentum sjúklinga með rauða úlfa, þar sem mótefnatítrar eru í tengslum við virkni sjúkdómsins.12 Skortur á SAP leiddi til þróunar sjálfsofnæmis í sjálfsofnæmisnæmum C57BL/6 músum og í ósjálfsofnæmismúsum. viðkvæmar 129/Sv mýs þegar þær eru krossaðar með C57BL/ 6 músum (129/Sv x C57BL/6 F2)13 en ekki í 129/Sv stofninum einum saman, sem bendir til þess að undirliggjandi erfðafræðilegt næmi gæti verið nauðsynlegt til að SAP skortur geti framkallað sjálfsofnæmi.14 mýs sýna framleiðslu á kjarnamótefnum, and-einþátta DNA, and-tvíþátta DNA mótefnum og gigtarþáttum. Þeir þróa útbreiðsluónæmirflókin miðluð glomerulonephritis, oftar hjá kvendýrum.13 Í músalíkani af lupus nephritis þar sem gauklabólgu er framkallað með inndælingu virkjaðs sjálfs-DNA í sermi, dró SAP genameðferð með plasmíðferju úr framleiðslu á and-tvíþátta DNA mótefnum , ónæmisfléttuútfellingu og nýrnabólgu, og kom í veg fyrir upphaf nýrnabólgu.15

Mynd 3|Niðurstöður úr nýrnavefsýni í himnulíkum gauklakvilla með grímubúnum IgG kappa útfellingum. Örmyndir úr vefjasýninu sem sýnt er á mynd 2 eru sýndar hér. (a) Hlutabroddar eru til staðar meðfram gauklagrunnhimnunni, með Jones metenamín silfurlitun (upprunaleg stækkun × 400). (b) Rafeindasmásjárskoðun sýnir útfellingar undirþekju sem eru meðfram gauklagrunnhimnu (upprunaleg stækkun×12,000). (c) Glomeruli litur neikvæður fyrir IgG með hefðbundinni ónæmisflúrljómun á ferskum vef (bein ónæmisflúrljómun; upprunaleg stækkun×400). (d) Glomeruli frá sama tilfelli litast jákvætt á paraffín-innfelldum vef eftir próteasa meltingu (bein ónæmisflúrljómun; upprunaleg stækkun×400). (e) Glomeruli sýna litun fyrir kappa og (f) ekki lambda á próteasa-melta paraffín-innfelldu vefnum (bein ónæmisflúrljómun; upprunaleg stækkun×400). Til að hámarka áhorf á þessa mynd, vinsamlegast skoðaðu netútgáfu þessarar greinar á www.nýru-international.org.

Þrátt fyrir takmörkun á léttkeðju sem sést við vefjasýni eru engar vísbendingar um að þessi eining tengist undirliggjandi eitlafjölgunarsjúkdómum eða einstofna Igs í blóðrás.4 MGMID ætti því ekki að teljast vera innan litrófs einstofna gammopathy sem hefur nýrnaþýðingu. tíma. Hlutverk SAP sjálfsmótefna er einnig óvíst. Ólíkt öðrum tegundum himnuheilakvilla með próteini sem er sérstaklega til staðar í ónæmisútfellingunum, eins og PLA2R tengdum sjúkdómi, 16 virðist MGMID ekki vera knúið áfram af sjálfsmótefnum sem beinast gegn SAP, þar sem okkur tókst ekki að greina mótefnaviðbrögð í sermi gegn SAP hjá MGMID sjúklingum . Önnur skýring er sú að IgG kappa er til staðar sem afleiðing af eðlilegri víxlverkun milli þessara 2 próteina frekar en sjálfsofnæmis mótefnavaka-mótefnavíxlverkun, þar sem vitað er að Ig kappa keðjan er hluti af eðlilegu víxlverkun SAP í sermi.6 Þess vegna, þótt gagnlegt sé fyrir vefjagreiningu þessa aðila, þá þjónar prófun fyrir SAP mótefnum í sermi ekki sem óífarandi greining á þessum tíma og undirliggjandi drifkraftur þessa sjúkdóms er enn ráðgáta.

Klínískar niðurstöður í MGMID eru mjög breytilegar, allt frá sjálfkrafa sjúkdómshléi til versnunar til lokastigsnýrusjúkdómurmeð endurkomu í ígræðslu. Afturskyggn greining hefur ekki sýnt nein tengsl á milli þeirrar meðferðar sem notuð er og klínískrar niðurstöðu.4 Uppgötvun SAP-þátttöku í þessum sjúkdómi hefur hugsanlega þýðingu fyrir meðferð. Meðferðir sem beinast beint að SAP hafa sýnt snemma loforð í meðhöndlun amyloidosis.17,18 Að auki benda niðurstöður massagreininga til þess að meðferðir sem miða á komplement fossinn gætu verið gagnlegar til að meðhöndla þessa tegund glomerulonephritis, í ljósi þess að flest prótein sem voru aukin í MGMID eru glomeruli komplement tengdar. Frekari rannsókna er þörf til að bera kennsl á lífmerki um virkni fyrir þennan sjúkdóm, sem og meðferðir.

Ástæðan fyrir því að hylja ónæmisútfellingar í MGMID vefjasýni á venjubundinni ónæmisflúrljómun er ráðgáta. Tilvist SAP í innlánum vekur nýjar mögulegar skýringar á þessu fyrirbæri í tilfellum MGMID. Til dæmis er vitað að víxlverkanir SAP próteins eru mjög háðar Ca2þ,6 og margir flutningsmiðlar og stuðpúðar sem notaðir eru við vinnslu nýrnavefsvefs fyrir ónæmisflúrljómun eru án Ca2þ. Þessi in vitro skortur á Ca2þ gæti leitt til truflunar á ónæmisútfellingum þannig að þær eru ekki lengur tiltækar til að greina með ónæmisflúrljómun á frosna vefnum. Ónæmisfléttuútfellingarnar yrðu áfram tiltækar til greiningar í formalínföstu vefnum, hins vegar vegna formalíns-framkallaðra samgildra efnatengja milli próteina í vefjum.

Við lýsum hér í fyrsta skipti einstakri tilvist SAP í gauklaútfellingum MGMID. Að auki sýnum við að litun ánýrulífsýnifyrir SAP auðkennir tilfelli með klínískt meinafræðilega eiginleika svipaða þeim í MGMID, án grímu, með venjubundinni ónæmisflúrljómun. Miðað við þessar niðurstöður teljum við að jákvæð litun innan gauklaútfellinga fyrir SAP auðkenni einstakt form gauklabólgu sem hefur sameiginlegan meinalífeðlisfræðilegan gang sjúkdómsins. Fram að nýlegri lýsingu á MGMID voru þessi tilfelli greind í fjölmörgum ólíkum flokkum, allt frá C3 gauklakvilla til sýkingatengdrar glomerulonephritis til óhefðbundins himnuheilakvilla. litrófsmælingar til að veita meinalífeðlisfræðilega innsýn í ónæmismiðlaða glomerulonephritis.

AÐFERÐIR

Aðferðir við vinnslu nýrnavefjasýnis

Staðlaðar vinnsluaðferðir fyrir nýrnavefjasýni voru notaðar, þar á meðal ljós, ónæmisflúrljómun og rafeindasmásjárskoðun.19,20 Öll ljóssmásjársýni voru lituð með hematoxýlíni og eósíni, Jones metenamínsilfri, Masson tríkrómi og periodic acid–Schiff hvarfefni. Allir beinir ónæmisflúrljómunarhlutar voru skornir við 4 mm og hvarfast með flfluorescein-merktum fjölstofna kanínum and-manna mótefnum gegn IgG, IgA, IgM, C3, C1q, fíbrínógeni og k- og l-léttum keðjum (Dako, Carpenteria, CA) í 1 klukkustund og skolað; hyljari var settur á með því að nota vatnskenndan festingarmiðil. Valin tilfelli voru lituð fyrir flfluorescein-merktum fjölstofna músa and-manna mótefnum gegn IgG1, IgG2, IgG3 og IgG4 (Sigma-Aldrich, St Louis, MO). Parafín ónæmisflúrljómun var framkvæmd eftir próteasa meltingu eins og áður hefur verið lýst.2,3 Alls voru valin 9 MGMID vefjasýni og 8 samanburðarviðmiðunarsýni með himnuheilakvilla af öðrum gerðum fyrir massagreiningu. Rannsóknaráætlunin var samþykkt af Solutions Institutional Review Board og var í samræmi við Helsinki-yfirlýsinguna.

Cistanche geturtónanýru

Massagreining leysirfanga örgreindra glomeruli

Vefsýni úr nýrnavef úr formalínföstum paraffínvef var skorinn í þykkt 10 mm á Leica PET-himnuramma (Leica, Wetzlar, Þýskalandi). Þessar glærur voru síðan litaðar með hematoxýlíni. Glomeruli voru örkrufin í örskilvinduglös með Leica DM60{{20}}0B smásjá. Örskornu glomeruli voru leyst í 2 prósent natríumdódecýlsúlfati og 0,1M díþíóþrítóli við 99 gráður í 1 klukkustund og unnin með síuaðstoðuðum sýnum (FASP).21 Skýrða lýsatið var flutt á Vivacon 500 þykkni (MWCO 30 kDa; Sartorius , Göttingen, Þýskalandi). Natríumdódesýlsúlfat var fjarlægt með endurteknum þvotti með 8 M þvagefni í 0,1 M tris(hýdroxýmetýl)-amínómetani/Cl, pH 8,5; sýnin voru síðan alkýleruð með 0,05 M joðasetamíði. Jodacetamíð var fjarlægt með 3 þvotti með 8 M þvagefni/0,1 M tris(hýdroxýmetýl)-amínómetani/Cl, pH 8,5, fylgt eftir með 3 þvotti með 0,05 M ammóníumbíkarbónati. Prótein voru melt með trypsíni (raðgreiningargráðu, Promega, Madison, WI) í 40:1 w/w hlutfalli við 37 gráður í 16 klukkustundir. Peptíðum var safnað með skilvindu og afsaltað á C18-Stage oddunum (Thermo Scientific, Waltham, MA).

Melt peptíð voru greind með NanoLC-tandem massagreiningu með því að nota Thermo Orbitrap Fusion Lumos massarófsmæli (Thermo Scientific). Peptíðin voru hlaðin á öfugfasagildru súlu (Integra-frit, New Objective, Woburn, MA) sem innihélt 2,5 mm Waters XSelect (Waters Corp., Milford, MA) hlaðið yfirborðsblendingsresín tengt við 150 mm X 0.075 mm greiningarsúla sem inniheldur sama öfugfasa plastefni og notað var í gildruna. NanoAcquity ultraperformance vökvaskiljunarkerfi (Waters Corp.) var síðan notað til að mynda 60-mínútu halla frá 98:2 til 60:40 jafnalausn A: B hlutfall (buffi A ¼ 0,1 prósent maurasýru , 0,5 prósent asetónítríl; stuðpúði B ¼ 0,1 prósent maurasýru, 99,9 prósent asetónítríl).

Peptíð voru skoluð úr súlunni með samþættum úðaodda (Picofrit, New Objective) og jónuð með rafúða (2.0 kV) fylgt eftir með tandemmassagreiningu með því að nota háorkuárekstur af völdum sundrunar (HCD). Könnunarskannanir á forverum peptíðs voru gerðar við 240K upplausn (við 400 m/z) með 5×10⁵ jónafjöldamarkmiði. Tandem massagreining var gerð með einangrun við 1,6 Th með fjórpólnum, HCD sundrun með eðlilegri árekstraorku upp á 30 og hraðskanna massagreiningu í jónagildrunni. Leitað var í gögnum sem fengust samhliða massagreiningu með nýjasta Uniprot gagnagrunni manna sem inniheldur bæði svissnesku Prot og TREMBLLE færslurnar með því að nota

MaxQuant (Max Planck Institute of Biochemistry, Planegg, Þýskalandi). Sýning gagna var gerð með því að nota Scaffold v4.6 (Proteome Software, Portland, OR). Rangt uppgötvun hlutfall var stillt á 1 prósent fyrir peptíð-til-róf samsvörun. Stöðluð iBAQ gildi frá MaxQuant voru notuð við magngreiningu. iBAQ dreifing fyrir hvert sýni var miðgildi leiðrétt til að stjórna fyrir mismun á hleðslu. iBAQ gildi jöfn núlli voru fjarlægð úr gagnasafninu. Fyrir tölfræðilega tilgátuprófun var 2-sýnishorn Welch's t-próf ​​gert fyrir hvert prótein með því að nota staðlað iBAQ gildi fyrir 2 hópana. Ef prótein fannst aðeins í einum hópi var 1-sýnishorn Welch's t-próf, þar sem lægsta greinda iBAQ gildið var notað sem núlltilgátu.

SAP litun

Formalín-fastir paraffín-innfelldir hlutar, skornir í 3 mm, voru afparafíngreindir og mótefnavaka endurheimt við 99 gráður. Sneiðunum var brugðist við með kanínu fjölstofna and-SAP fjölstofna mótefni (1:400; ThermoFisher, Waltham, MA) fylgt eftir með Rhodamine rauðum X-tengdum geita-and-kanínu aukaefni sem var aðsogað í fastfasa til að tryggja lágmarks krosshvörf við menn IgG (1:100; Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA). Hvert mál var keyrt með jákvæðum og neikvæðum viðmiðum. Liturinn var metinn með hefðbundinni ónæmisflúrljómunarsmásjá. Það var metið jákvætt ef það var jákvæð litun á kornótt háræðalykkja í gaukla og neikvætt ef engin háræðalykkja var

litun í glomeruli. Colocalization IgG og SAP í gauklagrunnhimnum var skoðuð með confocal smásjá með Zeiss LSM 880 confocal laser skanna smásjá (Zeiss Microscopy, Jena, Þýskalandi). Fyrir þessa greiningu var polyclonal (flfluorescein isothiocyanate-conjugered) kanína and-manneskju IgG (1:40; Agilent, Santa Clara, CA) hvarfað með hitauppteknum vef í kjölfar litunar fyrir SAP eins og lýst er hér að ofan. Neikvæð viðmið voru framkvæmd til að tryggja mótefnasérhæfni með því að sleppa frummótefnum. Fjögur tilfelli af MGMID voru prófuð með tilliti til tilvistar HP1BP3 (1:100; Thermo Fisher, Waltham, MA) með immunoperoxidasa litun.

Mótefni í sermi gegn SAP

SAP prótein (R & D Systems, Minneapolis, MN; {{0}}SAB-050) var þynnt í 3 ng/ml í karbónat-bíkarbónat jafnalausn (pH 9,6) og húðað á {{ 6}}well Immulon H2 diskur (Thermo Scientific) yfir nótt við 4 gráður. Plöturnar voru þvegnar x3 með því að nota 200 ml af þvottajafnalausn (1×fosfat-jafnalaus saltlausn og 0,05 prósent tween) og stíflað í 2 klukkustundir með blokkandi jafnalausn (1×fosfat-jafnalaus saltlausn, 0,05 prósent milli, 1 prósent fiskgelatín). Plöturnar voru síðan þvegnar × 3 með 200 ml af þvottajafna. Tuttugu míkrólítrum af þynntu sermi (1:100 í þvottajafna) var bætt við í hverri brunn og ræktað í 2 klukkustundir við stofuhita. Plöturnar voru þvegnar×7 með 200 ml af þvottajafna og síðan bætt við greiningarmótefninu, and-Human IgG-HRP (Jackson ImmunoResearchLaboratories; 309-035-003). Plöturnar voru þvegnar × 7 með 200 ml af þvottajafna. Næst var 3,3',5,5'-tetrametýlbensídínperoxídasa hvarfefni og peroxídasa hvarfefni Sol B blandað í 1:1 hlutfalli og 100 ml var bætt við plötuna. Hvarfið var stöðvað með því að bæta við 100 ml af 2M H2SO4, látið liggja á bekknum í 20 mínútur áður en lesið var við 450 nm. Til að tryggja að SAP próteinið sé bundið við plötuna, notuðum við kanínu and-SAP (Invitrogen, Carlsbad, CA; PA1-28361) í raðþynningu og síðan IgG-HRP gegn kanínu (Jackson ImmunoResearch Laboratories) ; 111-035-144). Viðmiðið sýndi góða fylgni á milli þynningar mótefna og gleypni, með meðalgildi R-kvaðrats upp á 0,95.

Cistanche til að bætanýruvirka

UPPLÝSINGAR

Allir höfundar lýstu ekki yfir hagsmunum í samkeppni.

AUKNINGAR

EFNI viðbótarskrá (PDF)

Mynd S1. Fulltrúar myndir af gaukla SAP litun frá ýmsum nýrnasjúkdómum.

Mynd S2. Anti-SAP serómvirknirannsóknir með ensímtengdri ónæmissogandi prófun.

Tafla S1. Öll Igs auðkennd með massagreiningu í leysir-fanga örgreindum glomeruli frá tilfellum himnulíkra gauklakvilla með IgG kappa útfellingum.

Tafla S2. Litrófsfjöldi með sýnatöku allra próteina sýndi $1 log2 aukið magn í MGMID sýnum og P-gildi # 0.1.

HEIMILDIR

1. Larsen CP, Ambruzs JM, Bonsib SM, o.fl. Himnulíkur glomerulopathy með grímubúnum IgG kappa útfellingum.NýraAlþj. 2014;86: 154–161.

2. Messias NC, Walker PD, Larsen CP. Parafín ónæmisflúrljómun á rannsóknarstofu í nýrnameinafræði: meira en björgunartækni. Mod Pathol. 2015;28:854–860.

3. Larsen CP, Messias NC, Walker PD, o.fl. Himnufjölgunarglomerulonephritis með grímubúnum eingerðum immúnóglóbúlínútfellingum. Nýra Int. 2015;88:867–873.

4. Larsen CP, Boils CL, Cossey LN, o.fl. Klínískir meinafræðilegir eiginleikar himnulíkrar glomerulopathy með grímubúnum IgG kappa útfellingum. Nýra Int Rep. 2016;1:299–305.

5. Emsley J, White HE, O'Hara BP, o.fl. Uppbygging pentamerísks amyloid P efnisþáttar í sermi úr mönnum. Náttúran. 1994;367:338–345.

6. Poulsen ET, Pedersen KW, Marzeda AM, o.fl. Serum amyloid P component (SAP) víxlverkun í plasma manna sem inniheldur lífeðlisfræðilegt kalsíumgildi. Lífefnafræði. 2017;56:896–902.

7. Agrawal A, Singh PP, Bottazzi B, o.fl. Mynsturþekking með pentraxínum. Adv Exp Med Biol. 2009;653:98–116.

8. Bottazzi B, Inforzato A, Messa M, o.fl. Pentraxínin PTX3 og SAP í meðfæddu ónæmi, stjórnun á bólgu og endurgerð vefja. J Hepatol. 2016;64:1416–1427.

9. Li JJ, McAdam KP. Amyloid P hluti úr mönnum: Elastasa hemill. Scand J Immunol. 1984;20:219–226.

10. Cox N, Pilling D, Gomer RH. Serum amyloid P: kerfisbundinn eftirlitsaðili fyrir meðfædda ónæmissvörun. J Leukoc Biol. 2014;96:739–743.

11. Kravitz MS, Pitashny M, Shoenfeld Y. Hlífðarsameindir-C-hvarfandi prótein (CRP), sermi amyloid P (SAP), pentraxin3 (PTX3), mannósabindandi lektín (MBL) og apólípóprótein A1 (Apo A1), og sjálfsmótefni þeirra: algengi og klínísk þýðing í sjálfsofnæmi. J Clin Immunol. 2005;25:582–591.

12. Zandman-Goddard G, Blank M, Langevitz P, et al. And-sermi amyloid component P mótefni hjá sjúklingum með rauða úlfa eru í tengslum við virkni sjúkdómsins. Ann Rheum Dis. 2005;64:1698–1702.

13. Bickerstaff MC, Botto M, Hutchinson WL, o.fl. Amyloid P hluti í sermi stjórnar niðurbroti litninga og kemur í veg fyrir sjálfsofnæmi gegn kjarna. Nat Med. 1999;5:694–697.

14. Gillmore JD, Hutchinson WL, Herbert J, o.fl. Sjálfsofnæmi og glomerulonephritis í músum með markvissri eyðingu á sermi amyloid P component gen: SAP skortur eða stofnsamsetning? Ónæmisfræði. 2004;112:255–264.

15. Zhang W, Wu J, Qiao B, o.fl. Úrbót á nýrnabólgu í úlfa með sermi amyloid P þátt genameðferð með mismunandi aðferðum sem voru mismunandi frá mismunandi stigum sjúkdómsins. PloS One. 2011;6:e22659.

16. Beck LH, Bonegio RG, Lambeau G, o.fl. M-gerð fosfólípasa A2 viðtaka sem markmótefnavaka við sjálfvakinn nýrnakvilla í himnu. N Engl J Med. 2009;361:11–21.

17. Richards DB, Cookson LM, Berges AC, o.fl. Meðferðarhreinsun amyloids með mótefnum gegn amyloid P í sermi. N Engl J Med. 2015;373:1106–1114.

18. Richards DB, Cookson LM, Barton SV, o.fl. Endurtaktu skammta af mótefni gegn amyloid P-hlutanum í sermi hreinsa amyloid útfellingar hjá sjúklingum með altæka amyloidosis. Sci Transl Med. 2018;10.

19. Walker PD, Cavallo T, Bonsib SM. Leiðbeiningar um æfingu fyrir nýrnavefsýni. Mod Pathol. 2004;17:1555–1563.

20. Walker PD. Nýrnavefsýni. Arch Pathol Lab Med. 2009;133:181–188.

21. Wisniewski JR, Zougman A, Nagaraj N, et al. Alhliða sýni undirbúningsaðferð fyrir próteingreiningu. Nat Aðferðir. 2009;6: 359–362.