Farnesýltransferasa hemill LNK-754 dregur úr axonal dystrophy og dregur úr amyloid meinafræði í músum Part 2

Lifandi myndmyndun af taugafrumum

Fyrir tilraunir með lifandi myndmyndun voru taugafrumur útbúnar eins og hér að ofan og húðaðar í 35 mm glerbotna diska (MatTek # P35G-1.5-14C) í 7 daga í ræktun. 10nM LNK-754 eða lonafarnib var síðan bætt við skilyrt miðil, viðmiðunarræktun var meðhöndluð með DMSO sem burðarefni. Eftir 48 klukkustunda meðferð var efnið skipt út fyrir skilyrt miðil frá ómeðhöndluðum samhliða taugafrumum. 25nM af LysoTracker-Green DND-26 (#L7526, Invitrogen) var bætt við skilyrta miðilinn og taugafrumur voru ræktaðar í 30 mínútur við 37 gráður.

Taugafrumur eru mikilvægur hluti taugakerfisins, fær um að taka á móti, vinna úr og senda upplýsingar og eru efnislegur grunnur greind og hegðun mannsins. Ónæmi er mikilvæg trygging fyrir mannslíkamanum til að standast sjúkdóma. Það getur greint og eyðilagt sýkla og óeðlilegar frumur og viðhaldið heilsu líkamans.

Rannsóknir sýna að sterk tengsl eru á milli taugafrumna og ónæmiskerfisins. Taugafrumur geta haft áhrif á ónæmiskerfið með því að losa margs konar taugaboðefni eins og noradrenalín, adrenalín o.s.frv. Þessi taugaboðefni geta breytt virkni ónæmisfrumna, aukið útbreiðslu og virkni ónæmisfrumna og bætt ónæmi líkamans. Á sama tíma getur ónæmiskerfið einnig haft áhrif á starfsemi taugafrumna í gegnum ýmsar leiðir. Ónæmisfrumur geta seytt ýmsum frumudrepum og hormónum sem hafa áhrif á vöxt, þroska og virkni taugafrumna í gegnum ónæmisleiðir.

Að auki geta sálfræðilegir og félagslegir þættir haft áhrif á ónæmi og taugafrumuvirkni. Neikvæðar tilfinningar eins og streita, kvíði og þunglyndi geta haft slæm áhrif á ónæmiskerfið og taugafrumurnar og dregið úr ónæmi líkamans. Jákvæðar tilfinningar, jákvæð félagsleg tengsl og heilbrigður lífsstíll geta stuðlað að heilbrigðri þróun ónæmis og taugafrumna.

Til að draga saman, það er gagnvirkt og gagnkvæmt stuðningssamband milli taugafrumna og ónæmis. Að viðhalda andlegri heilsu, horfast í augu við lífið á jákvæðan hátt og tileinka sér góðar lífsvenjur geta stuðlað að friðhelgi líkamans og heilbrigðum þroska taugafrumna. Það má sjá að við þurfum að bæta minni okkar. Cistanche deserticola getur bætt minni verulega, því Cistanche deserticola getur einnig stjórnað jafnvægi taugaboðefna, svo sem aukið magn asetýlkólíns og vaxtarþátta. Þessi efni eru mjög mikilvæg fyrir minni og nám. Að auki getur kjöt einnig bætt blóðflæði og stuðlað að súrefnisgjöf, sem getur tryggt að heilinn fái nægilega næringarefni og orku og þannig bætt heilaþrótt og úthald.

Smelltu vita leiðir til að bæta heilastarfsemi

Tímabilsmyndataka af taugafrumum var gerð með Ti2 breiðsviðs smásjá. Myndataka hófst strax eftir 30 mínútur og stóð ekki lengur en í 30 mínútur. Lýsingar 1- voru teknar á hverri mínútu og 20–30 aðskilin svæði á hvern rétt voru tekin upp á innan við 30 mínútum. Fjarlægðar- og hraðamælingar LysoTracker agna og kymograph greiningar voru gerðar með NIS Elements hugbúnaði og lýst í smáatriðum hér að neðan. Í aðskildum tilraunum var 1μM Lysosensor-Green DND-189 (#L7535, Invitrogen) bætt við skilyrt miðil og teknar myndir af lifandi taugafrumum voru teknar í ekki lengur en 15 mínútur með Nikon A1 confocal smásjá með 60X hlutlægu (NA 1.4) og NIS Elements hugbúnaður.

Lifandi myndgreining á heilavef

{{0}}mánaðargamlar 5XFAD mýs voru sprautaðar daglega í 3 vikur og eftir að meðferð lauk voru mýsnar svæfðar og þær geymdar með lausn sem innihélt 1M KCl, 1M MgCl2, 0.1mM kynúrenat , 0,01mM DL-2-Amínó-5-fosfónpentansýru, 5mM glútaþíon, 25mM glúkósa, 125mM NaCl, 1,4mM NaH2PO4 og 25mM NaHCO3.

Heilar voru síðan krufðir hratt í ísköldu súrefnisríku ACSF sem innihélt 2,5mM KCl, 85mM NaCl, 1,25mM NaH2PO4, 25mM NaHCO3, {{10}},5mM CaCl2, 4mM 4 MgCl2, 75mM glúkósi, 2mM súkrósa, 2mM 50uM C6H7NaO6, 0.1mM kynúrenat, 0.01mM DL-2-Amínó-5-fosfónpentansýru og 5mM glútaþíon. 300 μm kórónusneiðar voru fengnar með því að nota Compresstome VF-200 titrandi míkrótóm (Precision Instruments) og látnar hvíla í 30 mínútur til bata við 32 gráður í súrefnisríkri ACSF lausn sem innihélt eftirfarandi 2,5 mM KCl, 85 mM NaCl, 1,25 mM NaH2PO4, 25mM NaHCO3, 0,5mM CaCl2, 4mM 4 MgCl2, 75mM súkrósa, 25mM glúkósa, 50uM C6H7NaO6, 0,1mM kynúrenat, 0,01mM DL2-amínó-5-amínó-5-glúkósa ogfónatómfósýra.

Sneiðarnar voru síðan fluttar í 35 mm glerbotna diska (MatTek # P35G-1.5-14C) sem innihéldu súrefnisríkt ACSF með 25nM LysoTracker-Green og 1:10,000 þynningu upp á 1mg/ mL Tiazine Red (#S570435, Sigma Aldrich) sem var að öðru leyti eins og ACSF sem notað var á batatímabilinu. Lífvænleiki sneiðar var staðfestur með því að nota tímaskemmdarmynd af vefjum. Sneiðar voru ræktaðar með LysoTracker-Green og Tiazine Red í 15 mínútur við stofuhita og síðan voru heilasvæði í heilaberknum mynduð strax í sömu lausn við 32 gráður á Nikon A1 confocal smásjá með 60X hlutfalli (NA 1.4) og NIS Elements hugbúnaði fyrir ekki lengur en 30 mínútur.

Heilaútdráttur og ónæmisbletting

Mýs voru svæfðar með inndælingu í kviðarhol af xýlazíni (15mg/kg) og ketamíni (100mg/kg), gegnflætt með fosfat-bufferuðu saltvatni (1XPBS) með fenýlmetýlsúlfónýlflúoríði (20ug/ml), leupeptin (0,5 ug/ml), natríumorthovanadat (20μM) og dítíótreítól (0,1mM), fylgt eftir með því að fjarlægja heila. Allir stuðpúðar sem notaðir voru við próteinútdrátt innihéldu próteasahemla kokteil III (#535140, Millipore) og Halt fosfatasahemli (#78420, Thermo Fisher Scientific). Hemibrain vefur var vigtaður og handvirkt einsleitur með því að nota dounce homogenizer 1:10 (w/v) í 1XPBS.

Eftir einsleitni voru ljósötin skilin í skilvindu við 20,8{{10}}0g í 30 mínútur við 4 gráður. Leysanlegi hluti (ofurvökvi) var fjarlægður, og kögglan var endurleyst með pípettrun í geislaónæmisútfellingarprófun (RIPA) jafnalausn [50mM Tris, 0,15M NaCl, 1% oktýlfenoxýpólýetoxýetanól (IGEPAL), 1mM EDTA, 1mM EGTA, 0% SDS, og. % natríumdeoxýkólat við pH8] til að rækta á ís í 30 mínútur.

Sýnin voru hljóðlát (Misonix XL{{0}}) í 20 sekúndur á ís og síðan skilin í skilvindu við 20.800g í 30 mínútur við 4 gráður. RIPA-leysanlegi hluti (ofurvökvi) var fjarlægður og kögglan var endurleyst í 5M guanidíni (pH 8,0) til greiningar á óleysanlegum próteinum. Hvert sýni var hljóðbeitt í 20 sekúndur á ísnum, snúið í 1 klukkustund við stofuhita og síðan skilið í skilvindu við 20.800g í 30 mínútur við 4 gráður. Te bicinchoninic acid (BCA) próf (#23225, Thermo Fisher Scientific) var notað til að mæla próteinstyrk hvers sýnis.

Fyrir western blot, var 20g af próteini af hverju sýni hlaðið á 4-12% NuPAGE (Invitrogen) hlaup og aðskilið með því að nota MOPS jafnalausn við minnkaðar og eðlislægar aðstæður. Próteinin voru flutt á pólývínýlíden tvíflúoríð himnu og þróuð með Pierce ECL (enhanced chemiluminescence; Thermo Fisher Scientific). Þróuðu merkin voru sýnd með því að nota ProteinSimple FCR (FluorChem R) og síðari efnaljómandi merki voru magngreind með því að nota AlphaView hugbúnað (ProteinSimple). Allar blettur voru greindar með því að nota Local Background Correction tólið nema HDJ-2 blotið, sem var greint með Background Link tólinu í tengslum við Multi-regional Background Correction (AlphaView hugbúnaður).

A 42 ELISA

Til að mæla A 42 í hemibrain einsleitni úr 5XFAD músum, var notað Enzyme-LinkedImmunosorbent-Assay (ELISA) (Thermo Fisher Scientific, KHB3441) í sölu eftir leiðbeiningum framleiðanda til að greina guanidín og PBS-leysanlegt A 42 í hemibrain. Til að mæla A 42 í heila hAPP/PS1 músa var notuð ELISA sem fæst í verslun (h amyloid 42 ELISA high næm, Te Genetics Company, Zurich, Sviss). ELISA var framkvæmt í samræmi við samskiptareglur framleiðanda.

Ónæmisflúrljómun í heilavef músa

Eftir gegnflæði var heili dreginn út og hemibrain fest í 10% formalíni og síðan frystingu í 30% súkrósalausn í 1XPBS. Frjósandi rennandi míkrótóm var notað til að uppskera 30-μm kransæða- eða sagittal hluta. Hlutar voru settir í röð í 12-brunnsplötu í frostverndarlausn (1xPBS, 30% súkrósa og 30% etýlen glýkól) og geymdir við -20 gráður þar til þeir eru notaðir. Ónæmisflúrljómunarlitun var framkvæmd með því að þvo hluta þrisvar sinnum í 1XTBS og síðan rækta hluta í 16 mM glýsíni í 1XTBS í 1 klukkustund við stofuhita. Eftir 3 þvotta til viðbótar í 1XTBS voru hlutar lokaðir í 5% geitasermi í 0,25% Triton X-100 í 1XTBS í 2 klukkustundir við stofuhita.

Hlutarnir voru síðan ræktaðir yfir nótt í frummótefnum í lausn af 0.25% Triton X-100, 1% sermi albúmíns úr nautgripum og 1XTBS við 4 gráður. Auka ónæmislitun var síðan framkvæmd með asna AlexaFluor-merktum aukamótefnum í styrkleikanum 1:1000 (Thermo Fisher Scientific). ProLong Gold (#P36934, Thermo Fisher Scientific) var notað til að festa hluta áður en þeir voru teknir upp á Ti2 breiðsviðssmásjá eða Nikon A1 leysiskönnun confocal smásjá til að mæla mynd með því að nota Nikon NIS Elements hugbúnað til töku.

Allar skráningarstillingar voru þær sömu milli arfgerða og allar myndir voru teknar innan sama myndgreiningartímabils fyrir einstakar tilraunir (Northwestern University Center for Advanced Microscopy og Nikon Imaging Centre).

Myndafjöldi

Músarheila

Ónæmisflúrljómun magngreiningar á ónæmislitun heilavefs músa var framkvæmd á 3-5 hlutum á hvert dýr, frá Bregma hnitum um það bil -0,94 til -2,55 mm, sem voru teknar af myndum með 10X hlutlægu á Ti2 breiðsviðs smásjá. Magngreiningar, þar á meðal stærðar- og styrkleikaþröskuldar, voru gerðar með því að nota Nikon NIS-Elements Software (Northwestern University Nikon Imaging Center).

Það fer eftir merkinu, þröskuldar voru stilltir með því að nota General Analysis tólið sem byggir á stærð hluta, lögun og birtuskilum og síðan voru búnar til tvöfaldar grímur fyrir hverja rás og svæði sem vekur áhuga. Þröskuldur var framkvæmdur sérstaklega á hverri rás til að einangra áhugaverð merki með því að fínstilla merki-til-suð hlutfall og útrýma ósértækum bakgrunnsmerkjum. Til að reikna út LAMP1, BACE1 eða LysoTracker-Grænt þakið svæði, sem og LAMP1 og Lysosensor flúrljómunarstyrksmælingar í frumtaugafrumum, voru áhugaverð svæði rakin handvirkt með því að nota NIS-Elements og tvöfalt lag var búið til fyrir hvert áhugasvæði.

Til að reikna út hlutfall LAMP1 á móti A 42, var flatarmál LAMP1 í dystrophic neurites staðlað í flatarmál A 42 á einstaklingsgrunni og meðalhlutföll á mús milli meðferðarhópa voru magngreind. Fylgnistuðlagreining Pearsons fyrir BACE1 og LAMP1 var gerð með því að nota NIS-Elements á grunni hvers veggskjölds á hámarksstyrksvörpun á 30μm Z-stafla myndum sem teknar voru með Nikon A1 leysiskönnun confocal smásjá með 1μm skrefstærð.

Til að reikna út hlutfall LysoTrackerGreen og Tiazine Red, var flatarmál LysoTracker-Green í dystrophic neurites staðlað við flatarmál Tiazine Red á einstaklingsgrunni og meðalhlutfall á mús var magnmælt milli meðferðarhópa. Fjórir kransæðahlutar frá Bregma hnitum um það bil -1,70 til -2,55 mm voru notaðir til að reikna út flatarmál eða styrkleika hvers merkis á hverju heilasvæði fyrir hverja mús. Greining á veggskjölduhúðuðu svæði og veggskjöldstærð var gerð með því að nota að meðaltali fimm hluta á mús frá Bregma hnitum um það bil -0,94 til -2,55 mm. Hlutaval, myndöflun, myndrakning og magngreiningar voru framkvæmdar af einstaklingi sem var blindaður fyrir meðferðarhópa og arfgerðir.

Aðal taugafrumur

Til magngreiningar á LAMP1 ónæmislitun í föstum frumtaugafrumum músa, voru semas rakin handvirkt á grundvelli formfræði með því að nota NIS-Elements og tvíundir gríma var búin til fyrir hvert áhugasvæði og rás. Þröskuldur var notaður til að fínstilla LAMP1 merki og greina LAMP1 í taugafrumur, þar á meðal bæði dendrites og axon, með því að einangra pixla af LAMP1 jákvæðum fyrir túbúlínpixla.

Cell soma LAMP1 merki voru útilokuð frá heildar LAMP1 svæði til að greina LAMP1 blöðrur í taugafrumur. Til greiningar á LysoTracker-Green hreyfigetu í taugafrumum voru myndir magngreindar með því að nota NISElements. Hraða og fjarlægð heildar LysoTrackerGreen agna í hverjum ramma var rakin með því að nota sjálfvirka hreyfirakningareiginleikann í NIS-Elements. Þröskuldur var stilltur og settur á allar kvikmyndir byggðar á stærð og flúrljómunarstyrk LysoTracker-Green agna til að útrýma bakgrunnshljóði.

Fyrir myndun kímórita var tímaskemmdarmynd af stökum taugafrumum framkvæmd á 60X samrænum smásjá og axon voru auðkennd formfræðilega. Hlutfall af tíðni agna sem hreyfðust í framhlið eða afturábak, eða kyrrstöðu, var magnmælt með því að deila fjölda agna fyrir hvern hóp með heildarfjölda agna. Fyrir kymograph greiningar voru hreyfanlegar agnir skilgreindar með hraða yfir 0,1μM/sek.

tölfræðigreining

GraphPad Prism hugbúnaður v8 var notaður til að framkvæma tölfræðilegar greiningar, þar á meðal dreifigreiningu (ANOVA) með posthoc prófum þegar borin voru saman fleiri en tvö sýni og ópöruð t-próf ​​þegar aðeins var verið að bera saman tvö sýni. Sérstakar prófunarupplýsingar, þar á meðal fjöldi endurtekna, gerð posthoc prófana og P gildi eru tilgreindar í myndsögum. Allar stærðir eru teiknaðar við meðaltal±SEM. Mikilvægi var ályktað þegar P gildið var minna en 0.05, gefið til kynna með *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001.

For more information:1950477648nn@gmail.com