Tjáningarmynstur -túbúlíns, inversíns og markhóps þess misheppnaðs-1 og formgerð frumbrjóstahimnunnar í eðlilegum nýrnaþroska og sjúkdómum
Mar 10, 2022
Ágrip:Tjáning -túbúlíns í tímatíma, inversion og disheveled-1 (DVL-1) próteina sem tengist Wnt-merkjaleiðinni og frumgerð cilia voru greind við þróunnýru(14.–38. þroskavika), heilbrigt eftir fæðingu (1.5- og 7-ára) og sjúklega breyttur maðurnýru,þar á meðal fjölblöðruvandamálnýru(MCDK), focal segmental glomerulosclerosis (FSGS) og nýrnaheilkenni af finnskri gerð (CNF). Greiningin var gerð með tvöföldu ónæmisflúrljómun, rafeindasmásjárskoðun, hálfmagns- og tölfræðilegum aðferðum. Umfrymistjáning á -túbúlíni, hvolfi og DVL-1 sást í nærlægum píplum (pct), fjarlægum píplum (dct) og glomeruli (g) í greindum vefjum. Á meðannýruþróun, heildartjáning -túbúlíns, inversion og DVL-1minnkaði, en á eftirfæðingu jókst lítillega. Hæstu tjáningar -túbúlíns og inversion einkenndu dct og g, en há DVL-1 einkenndi pct. -túbúlín, inversion og DVL-1 tjáningarmynstur í MCDK, FSGS og CNFnýruverulega frábrugðin heilbrigðu stjórninni. Miðað við heilbrigtnýru, sjúklega breyttnýruhafði dysmorphic primary cilia. Mismunandi tjáningarferli -tubulin, inversion og DVL-1 á meðannýruÞróun gæti bent til þess að skipta á milli kanónískra og noncanonical Wnt-merkja sé nauðsynleg fyrir eðlilegtnýruformgerð. Aftur á móti trufla tjáningu þeirra í sjúklegumnýrugæti tengst óeðlilegum aðal cilia, sem leiðir til langvarandinýrnasjúkdóma.
Leitarorð:nýrnaþroski manna; -túbúlín; inversin; DVL-1; MCDK; FSGS; CNF; nýru, nýru
CISTANCHE mun bæta nýrna-/nýrnasjúkdóm
Kynning
Þróun endanlegs eða metanephricnýruhefst á fimmtu meðgönguviku (GW), sem síðan aðgreinir sig stöðugt til að mynda varanleg nýru [1,2]. Merkjavíxlverkanir milli metanephric mesenchyme og þvagrásarbrumsins tryggja réttnýruþróun við nýrnamyndun. Í stuttu máli framkallar þvagrásarbruminn mesenchymal-to-epithelial transition (MET) í metanephric mesenchyme, sem þéttist og myndarnýrublöðrur, þar á eftir koma kommulaga og S-laga líkamar og leiða að lokum til gauklamyndunar [3]. Í staðinn veldur mesenchyme frekari greiningu á þvagrásarknappinum. Metanephric nýrun verða starfhæfar útskilnaðareiningar á 11. viku þroska mannsins. Hins vegar er nýrnamyndun lokið innan 34. til 36. viku fósturþroska, þegar mörgum greiningarviðburðum er lokið, en frekara aðgreiningarferli nýrna heldur áfram inn eftir fæðingu [4,5]. Truflanir á þessum flóknu milliverkunum leiða til ýmissa meðfæddra frávika í nýrum og þvagfærum (CAKUT), þar á meðal dysplasia, fjölblöðru nýrnasjúkdómur, fjölblöðruvandamál.nýrnasjúkdómur(MCDK), sem leiðir þar af leiðandi til langvarandinýrnasjúkdómur(CKD) [6].
Í þessari rannsókn var lögð áhersla á aðalútlit cilia og Wnt-merkjaferilinn, sem gegnir mikilvægu hlutverki við eðlilega nýrnamyndun og ínýruviðgerðarferli, eftir bráða eða langvarandinýrnasjúkdómur[7]. Tilvist aðal cilia á nýrnamyndun og mikill fjöldi þroskanýrugallar sem koma fram hjá sjúklingum með brjóstholssjúkdóm benda á að ósvikin aðal virkni cilia sé nauðsynleg fyrir eðlilegt ástandnýrulíffæramyndun [8,9]. Aðal cilium er frumulíffæri sem byggir á örpíplum sem er mikilvægt fyrir vefjajafnvægi, þar sem -túbúlín er grunnþátturinn [10]. Tap á -túbúlínasetýleringu í ódauðlegum frumum kallar á þekju-til-mesenchymal umskipti (EMT), sem gefur því til kynna að asetýlerað -túbúlín sé mikilvægt við stöðugleika örpípla [11]. Meðan á þróun mannsins stendur, gerir aðal cilia-miðlaða Wnt ferillinn frumufjölgun, aðgreiningu og vefjamótun kleift [12]. Umtalsverður fjöldi barna með skerta virkni cilia og truflað Wnt-boðferil þróar langvinnan nýrnasjúkdóm, þar sem meðfæddnýrusjúkdómar eru ábyrgir fyrir næstum helmingi tilfella [13]. Algengasta meðfædda blöðrusjúkdómurinn hjá börnum er fjölblöðruvandamálnýrnasjúkdómur(MCDK) [14]. Margar blöðrur sem hafa ekki samskipti [15] og skortir eðlileganýruparenchyma eru einkennandi smásjárniðurstöður fyrir MCDK. Focal segmental glomerulosclerosis (FSGS) er einn algengasti gauklasjúkdómurinn sem leiðir til lokastigsnýrnasjúkdómur[16]. Í upphafi er FSGS einkennandi fyrir að vera brennidepill, tekur aðeins til minnihluta glomeruli og segmental, sem felur í sér breytingar á aðeins hluta gauklahringsins [17]. Meðfædd nýrnaheilkenni af finnskri gerð (CNF) er sjaldgæft sjálfsfrumna sem erfist með víkjandi hættinýrnasjúkdómurtáknað með fæðingarfaraldri umfangsmikils próteintaps [18], sem tengist blöðrumyndun nærpípla [19]. Margar tegundir frumra gauklasjúkdóma þróa próteinmigu vegna skemmda gauklasíunarhindrunarinnar [20]. Töluvert magn rannsókna gefur til kynna að meiðsli og truflun á starfsemi fræfrumna hafi innri hlutverk í meingerð nýrnabilunar próteinmigu [21]. Rannsókn Vukojevic o.fl. sýnir aukinn fjölda ciliated og illa aðgreindra podocytes í CNF [22]. Fyrri rannsóknir gáfu til kynna að Wnt/-catenin boðleiðin gegni grundvallarhlutverki við að stilla truflun á frumufrumuvirkni með próteinmigu [23]. Það eru tvær helstu Wnt-merkjaleiðir, önnur þekkt sem canonical -catenin-dependent og önnur noncanonical, -catenin óháð. Á meðan á mús stendurnýruþróun, kanónísk Wnt-merki er virk á þvagrásaroddunum og í S-laga líkama [24]. Ennfremur hefur Wnt með kanónískum merkjum þýðingu við að viðhalda MET meðan á nýrnamyndun stendur [25]. Það er nefnilega nauðsynlegt að binda próteinkomplexið sem inniheldur Dvl við himnuviðtakann fyrir virkjun Wnt ferilsins, á meðan slökkt er á lykilþáttum þessarar ferils leiðir til snemma burðarmálsdauða vegna skorts á nýrnasvæðinu ínýru[25].
Prótein sem skiptir sköpum sem sameindaskipti á milli kanónískra og noncanonical Wnt-boðaleiða reyndist vera inversion [26]. Þótt víxlverkun ýmissa próteina við snúning hafi greinst, hefur nákvæm virkni þess ekki enn verið fullkomlega skýrð. Ínýruþekjufrumur, inversion er staðsett í aðal cilia, virkar sem ciliary prótein [27]. Að auki myndar inversion stöðugt flókið með túbúlíni í ræktunnýrufrumur, og þær mynda sér stað í lífinu [27,28]. Viðsnúningur virðist gegna mikilvægu hlutverki í fyrstu formgerð pronephric kerfisins og vinstri-hægri samhverfuákvörðun meðan á þroska stendur [29,30]. Mikilvægur atburður fyrir bæði kanónískar og ógildar Wnt-merkjaleiðir við nýliðun umfrymis Dvl til frumuhimnunnar. Þar sem fyrri niðurstöður sýndu að inversion og Dvl sameinast í nýrnaþekjufrumum, má velta því fyrir sér að inversion gæti einnig haft hlutverk í boðefnaskilum sem ekki eru kanónísk. Vanstjórnun á Wnt-merkjaboðum sem miðlað er af inversion veldur afbrigðilegri útbreiðslu í píplum [31]. Erfðafræðilegar prófanir leiddu í ljós DVL-1 stökkbreytingu hjá sjúklingum með sjálfstætt ríkjandi Robinow-heilkenni, sem sýndi ólíka sjúkdóma hjá sumum sjúklingum sem tengjast þvagfærum ognýrufrávik [32].
CISTANCHE MUN BÆTA NÝRA/NÝRASKILUN
Þróunartjáningarmynstur -túbúlíns, inversion og DVL-1 hefur verið rannsakað í mismunandi dýralíkönum. Þannig hefur tjáning þeirra í pronephros af Xenopus laevis verið staðfest með því að nota intravital smásjárskoðun [31], á meðan þeir fundust í frumulínum fengnar úr músa nærliggjandi pípulaga frumum með því að nota confocal smásjá og massagreiningu [33]. Að auki sýndu ljóssmásjárskoðun og tvöföld ónæmisflúrljómun tilvist þeirra í köflum músanýru[34]. Rannsóknir á inversion knockout músum greindu frá stækkuðum, dreifðum blöðrum ínýrumerg og heilaberki í tengslum við inverse inversion situs [35]. Hjá mönnum var stökkbreyting á inversion kynnt með ungbarna nýrnabólgu sem leiddi til þess að meðgöngu lauk [36]. Þrátt fyrir fjölmargar rannsóknir ánýru-túbúlín, inversion og DVL-1 tjáningarmynstur og virkni, eftir því sem við best vitum, hefur tjáningarmynstur þessara próteina í fósturvef manna og vefjum eftir fæðingu ekki verið rannsakað enn og leitt til fylgni. Að auki hefur ekki verið greint frá vísbendingum um tjáningu inversion og DVL-1 í fyrstu þróun mannsins. Þess vegna miðar þessi rannsókn að því að greina staðbundið og tímabundið tjáningarmynstur -túbúlíns, inversion og DVL-1 á fósturstigi og eftir fæðingu heilbrigðra mannanýru, sem og ínýruvefjum MCDK, FSGS og CNFnýruí því skyni að koma á hugsanlegum týndum tengslum milli þessara aðila. Við leggjum nefnilega til að trufluð tjáningarmynstur -túbúlíns, inversion og DVL-1 próteina gæti verið undirliggjandi blöðrumyndunarferli og óeðlileg virkni frumblóma sem leiðir til langvarandinýrnasjúkdóma.
Niðurstöður
Greining á þroska og eftirfæðingunýruvefir voru gerðar á greinilega aðgreindum byggingumnýru:proximal convoluted tubules (pct), distal convoluted tubules (dct) og glomeruli (g). Á greindum þroskastigum og eftir fæðingunýruvefir, -tubulin, inversion og DVL-1 sýndu jákvæð tjáningarmynstur en með mismunandi styrkleika, dreifingu og magni. Greining á meinafræðilegumnýrnavefaf MCDK, FSGS og CNF var gerð á heildarmyndafjölda jákvæðu frumanna samanborið við heilbrigðan nýrnavefsstjórnun.
2.1. Ljóssmásjárskoðun, rafeindasmásjárskoðun og ónæmisvefjaefnafræði (-Túbúlín) á heilbrigðum og sjúklega breyttum nýrnavef frá mönnum eftir fæðingu
2.1.1. Heilbrigt nýrnaljós eftir fæðingu
smásjá eftir fæðingunýruvefur sýnir vel skilgreindannýrumannvirki, með greinilegum mun á merg og heilaberki og myndun pct, dct og g á cortical svæðinu. Ónæmisvefjaefnafræðileg litun á -túbúlíni sýnir tilvist einn aðal cilium í miðju apical frumuyfirborðs hverrar pípulaga frumu og í 0.018 prósent ± 0,00014 prósent SD á yfirborði gaukulfrumna. Rafeindasmásjárskoðun sýnir tilvist aðeins einnar aðal cilium sem kemur frá grunnhlutanum við apical frumuyfirborð píplunnar (Mynd 1a).
2.1.2. CNF
Flest greindu g eru smærri og lobulated (80 prósent), en minnihlutinn er af eðlilegri stærð eða ofstærð (20 prósent, n=100). Segmental eða global sclerosis af g finnst, en pct og dct eru að hluta til útvíkkuð og húðuð með rýrnunarþekju. Útbyggingarlega séð sést tap á örverum og lækkun á frumuhæð með fjölbrotakjarna. Í fræfrumum tapast fótaferlar á dreifðan hátt. Pípulaga aðal cilia eru óskipulögð, sérstaklega í blöðrum nærpíplanna, sem sýna breytingar á lengd og umfrymisstöðu (Mynd 1b).
2.1.3. MCDK
Í nýrnavef má finna sporadískt óþroskað og þroskað g.Nýravefur er fylltur með fjölmörgum sporöskjulaga blöðrum. Dálkaþekjufrumur þekja blöðrurnar og eru umkringdar lausum bandvef. Ónæmisvefjaefnafræðileg litun á -túbúlín sýnir margar langar og óskipulagðar frumhlífar á yfirborði þekjufrumna (mynd 1c).
2.1.4. FSGS
Í 90 prósentum af g finnst umfangsmikil mænusigg (n=100), sem tengist millivefsvefjamyndun og merki um pípuskemmdir. Minnkun á hæð þekjufrumna með tapi á microvilli er að finna í rafeindasmásjánni, á meðan æðaþelsfrumur og mesangial svæði hafa reglulega öfgabyggingu. Í rafeindasmásjánni sést afar langur og óskiptur (dreifður) cilium á yfirborði fjarpípulaga frumunnar (Mynd 1e). Fótfrumur sýna dreifða tap á fótaferlum með víðtækum örvöðvavef. Ónæmisvefjaefnafræðileg litun á a-túbúlín sýnir margar langar og óskipulagðar frumhlífar á yfirborði þekjufrumna (mynd 1c).
2.2. Ónæmisvefjaefnafræðileg litun á 心Tubulin, Inversion og DVL-1- og tölfræðileg greining á þroskandi og heilbrigðum mannanýrum eftir fæðingu
Á 14., 15. og 16. meðgönguviku,nýruvefur er sýndur með mismunandi þroskastigum nýrnamyndunar: frá metanephric bollum,nýrublöðrur stigum til að stjórna S-laga nýrum og mynda þannig nýrnasvæðið í ytri heilaberki (Mynd 2). Hægt er að sjá aðgreining á pct, dct og g á svæðum í heilaberki nærnýrumedulla. Á 22. GW urðu hlutar merg og heilaberki greinilega áberandi, en í 38. GW,nýrumannvirki virðast mjög aðgreind, innihalda þroskuð form af pct, dct og g
2.2.1. a-Túbúlín
Á meðan á þroska stendur kemur a-túbúlín sterkt fram í öllum þroskaheftumnýrumannvirki, fyrst og fremst sjónrænt formi aðal cilia á yfirborði parietal þekjufrumna í Bowman hylkinu, g, pct og dct. Innannýruvefjum, 82—97 prósent af pct frumum tjá a-túbúlín, en í dct lækkar tjáning úr 99 prósentum í 72 prósent í 38. GW (sjá mynd 3, töflu 1). Meðal mismunandi þroskastiga er sterkasta tjáning a-túbúlíns að finna í g á 16. GWnýru, sem inniheldur 93 prósent af jákvæðum frumum. mjúkur 14., 15. og 22. GW (sjá mynd 3a,b, töflu 1), um 70 prósent af g frumum tjá a-túbúlín, en minnst tjáning sést í 38. GW (p < 0,01)="" með="" 34="" prósent="" af="" jákvæðu="" frumunum="" (mynd="" 3c).="" í="">nýruvefja (1.5-ára og 7-áranýru), er sterkasta ónæmissvörun fyrir a-túbúlíni sést á apical frumuyfirborði pct og dct (Mynd 3d-f). A-túbúlín tjáningin er einnig til staðar í perkjarna umfrymi dct og parietal þekjufrumum Bowmans hylkis. a-tubulin blettir alltnýrumannvirki með að meðaltali 50 prósent af jákvæðum frumum í pct, 94 prósent í dct og 85 prósent í g (Mynd 3f). Dct blettir verulega frábrugðnir pct (p < 0,0001).="" öll="" rannsökuð="" mannvirki="" litast="" jákvætt="" fyrir="" a-túbúlín,="" með="" 77="" prósent="" jákvæðra="" frumna="" í="" pct,="" 72="" prósent="" í="" dct="" og="" 58="" prósent="" í="" g="">
Mynd 3. Ónæmisflúrljómunarlitun á -túbúlíni og DAPI í nýrnavef í mönnum og eftir fæðingu (a–e). Nýru af 14., 15./16., 38. GW (a–c);nýruaf 1.5- og 7-ára börnum (d,e). Jákvæð litun á -túbúlíni (örvar) er sýnd í hverri byggingu í heilaberki í gegnum þroska- og eftirfæðingarfasa (a–e), nærlægar píplar (pct), fjarlægar píplar (dct) og glomeruli (g). Upplýsingar um aðal cilia í pct (d) og dct (a–c, e) eru sýndar sem innfellingar með hærri stækkun (hvítur kassi). Stækkun ×40, kvarðastöng 100 µm. Dreifing -Tubulin jákvæðra frumna eftir byggingu á mismunandi þroskastigum og eftir fæðingu er sýnd á línuriti (f). Línurit (g) (heildarfjöldi próteinjákvæðra frumna í sköpuðum byggingum) sýnir próteintjáningu sem tengist þroskatíma (línuleg aðhvarf) og innbyrðis tengsl -Túbúlíns við DVL-1 í gegnum þróun og þroska (Two-Way ANOVA fylgt af með Posthoc próf SIDAK). Gögn eru sýnd sem meðaltal ± SD.
Dreifing -túbúlínjákvæðra frumna eftir byggingu á mismunandi þroskastigum og eftir fæðingu er sýnd á línuriti (f). Línurit (g) (heildarfjöldi próteinjákvæðra frumna í sköpuðum byggingum) sýnir próteintjáningu sem tengist þroskatíma (línuleg aðhvarf) og innbyrðis tengsl -túbúlíns við DVL-1 í gegnum þróun og þroska (tvíhliða ANOVA fylgt af með Post hoc próf Sidak). Gögn eru sýnd sem meðaltal ± SD.
2.2.2. Tvöfalt ónæmisflúrljómunarlitun til inversion og DVL-1 og DAPI kjarnalitun í þroskandi og heilbrigðum nýrum eftir fæðingu Inversiontjáning í þróun og nýrnavef
Í 14., 15. og 16. GW sýnir inversion sterka korntjáningu í g og væga korntjáningu í umfrymi pct og dct (Mynd 4a,b), en í 22. og 38. GW (sjá mynd 4c) jákvæð tjáning sést í g (tafla 1). Á milli 14. og 22. GW, um 50 prósent af frumuútgáfunni. Í 16. GW tjá pct frumur snúning í 73 prósentum frumna, en lækka í 29 prósent frumanna (p < 0,05)="" í="" 38.="" gw="" (sjá="" mynd="" 4f).="" jákvæð="" tjáning="" umsnúnings="" er="" að="" finna="" í="" um="" það="" bil="" 80–90="" prósentum="" dct="" og="" g="" frumna="" í="">nýruvefjum 14. og 16. GW, með lægstu tjáningu í dct af 38. GW (p < 0.05,="" p="">< 0,0001,="" í="" sömu="" röð)="" þar="" sem="" 66="" prósent="" frumna="" voru="" jákvæðar.="" í="">nýru, pct litast mjög við apical frumuhimnu, en dct litast aðallega á grunnfrumuhimnu og í perkjarna umfrymi (Mynd 4d,e). Á því stigi fundum við tjáningu umsnúnings í öllum rannsóknumnýrumannvirki, þar á meðal pct, dct og g, með meðaltjáningu jákvæðra frumna upp á 92 prósent fyrir pct, 88 prósent fyrir dct og 90 prósent fyrir g (Mynd 4f). Við sáum ekki marktækan mun á merkisstyrk snýringartjáningar milli mannvirkja. Hæsta tjáning umsnúnings er að finna í g, að meðaltali 94 prósent jákvæðra frumna (Mynd 4f). Marktækur munur er að bera saman litun g (þar sem 94 prósent frumna litast jákvætt) við pct, þar sem 58 prósent frumna litast jákvætt (p < 0.01)="" og="" við="" dct,="" þar="" sem="" 49="" prósent="" frumna="" eru="" jákvæð="" (p="">< 0,0001,="" mynd="">
DVL-1 tjáning í nýrnavef sem þróast og eftir fæðingu
Væg til sterk tjáning DVL{{0}} sést í umfrymi pct, dct og g á fósturskeiði (sjá mynd 4a–c, töflu 1). Í pct, tjá 76–86 prósent frumna DVL-1 í 14.–22. GW, en í 38. GW eru 57 prósent jákvæðra frumna (Mynd 4g). Í dct 14. og 15. GW tjáir 68–70 prósent frumna DVL-1, í 16. og 22. GW lækkar fjöldi jákvæðra frumna í 42–5{{41} } prósent, en í 38. GW tjáningu (p <0,001), sést="" í="" 19="" prósentum="" dct="" frumna.="" tjáning="" dvl-1="" eykst="" í="" g="" í="" gegnum="" fósturstig:="" í="" 14.="" gw="" er="" það="" 6="" prósent,="" en="" í="" 15.,="" 16.="" og="" 22.="" gw="" eykst="" það="" í="" 10="" prósent="" (p="">< 0,01).="" í="" 38="" gw="" tjá="" 14="" prósent="" g-frumna="" dvl-1="" (mynd="" 4="" g).="" eftir="" fæðingu="" dreifist="" dvl-1="" ónæmissvörun="" í="" umfryminu="" (tafla="" 1)="" bæði="" í="" pct="" og="" dct="" (mynd="" 4d,e).="" merkið="" er="" að="" finna="" í="" öllum="" rannsökuðum="" mannvirkjum="" en="" aðallega="" í="" perkjarna="" umfrymi.="" styrkur="" dvl-1="" tjáningar="" er="" marktækt="" hærri="" í="" pct="" samanborið="" við="" dct="" og="" g="" (p="">< 0,01).="" 39–45="" prósent="" af="" frumunum="" í="" pct="" og="" dct="" tjá="" dvl-1,="" en="" í="" g="" eru="" 21="" prósent="" frumanna="" jákvæðar="" (mynd="" 4="" g).="" við="" fundum="" ekki="" marktækan="" mun="" á="" hlutfalli="" ónæmisvirkra="" frumna="" í="">nýrumannvirki. Hlutfall DVL-1 ónæmisvirkra frumna er 34 prósent í pct, 36 prósent í dct og 27 prósent í g, í sömu röð (Mynd 4g).
Mynd 4. Tvöföld ónæmisflúrljómun litun á inversion (grænt), DVL-1 (rautt) og DAPI (blátt) í nýrnavef sem þróast og eftir fæðingu (14.–38. GW, 1.5- og {{6} }}árgamall nýrnavefur). Jákvæð litun (örvar) er sýnd í hverri byggingu á öllum stigum þroska (a–c) og eftir fæðingu (d, e). Sameinaðir hljóðnemar ásamt byggingum sem vekur áhuga í heilaberki: nærlægum krókapíplum (pct), fjarlægum krókapíplum (dct) og hnoðrum (g). Colocalization of inversion/DVL-1 (örvahaus) er sýnd í sameinuðum örmyndum. Neikvæðar stýrilitanir eru sýndar sem innfellingar á inversion og DVL-1 (a). Raðafrumur má sjá sem mjög litaðar frumur nálægt dct. Upplýsingar eru sýndar sem innfellingar með hærri stækkun. Stækkun ×40, kvarðastöng 100 µm. Kvik jákvæð frumudreifing á inversion og DVL-1 í nýrnabyggingum (pct, dct, g) í gegnum þróunarstig og eftir fæðingu er sýnt á línuritum (f,g). Línurit (h) sýnir tjáningu próteina (heildarfjöldi jákvæðra frumna í byggingum) sem tengist þroskatíma (línuleg aðhvarf) og innbyrðis tengsl umsnúnings við DVL-1 í gegnum þróun og þroska (tvíhliða ANOVA fylgt eftir með Post hoc prófi Sidak ). Gögn eru sýnd sem meðaltal ± SD.
Samtjáning á inversion og DVL-1 sést í umfrymi nýrna g, dct og pct meðan á þróun stendur (sjá mynd 4a–c, sameining). Eftir fæðingu einkennir samtjáning inversion og DVL-1 mismunandi frumuhólf pípulaga frumna í pct og dct, en samtjáning í g einkennist af sterku algengi inversion tjáningu (sjá mynd 4d, sameinast ). Á 7-árinu eftir fæðingu nýru, sést samtjáning öfugsnúnings og DVL-1 í pípulaga frumum dct og pct, og í g þar sem öfugtjáning er örlítið ríkjandi í samanburði við DVL-1 (Mynd 4e, sameining).
2.2.3. Mismunur á tjáningu á -Tubulin, Inversion og DVL-1 milli mismunandi þroska nýrnastiga og nýrna eftir fæðingu
Fjöldi -túbúlín-jákvæðra frumna í hlutfalli af nýrnavef fósturs var tölfræðilega marktækt hærri í samanburði við nýrnavef 7-ára barna (13. (p < 0).0{="" {11}}1),="" 15.="" (p="">< 0.0001)="" og="" 16.="" (p="">< 0.00001)="" gw).="" dct="" á="" fyrstu="" stigum="" fósturs="" (13.,="" 15.,="" 16.="" og="" 22.="" gw)="" hafði="" fleiri="" jákvæðar="" frumur="" í="" samanburði="" við="" 38.="" gw="" og="" 1.5-="" ára="" nýrnavef="" barna="" (p="">< 0,0001,="" í="" sömu="" röð,="" mynd="" 3f).="" þegar="" mismunandi="" þroskaþrep="" voru="" borin="" saman="" fundum="" við="" lægra="" stig="" umhverfustjáningar="" í="" pct="" 13.="" (p="">< 0,0001),="" 15.="" (p="">< 0,00001),="" 22.="" (p="">< 0,001)="" og="" 38.="" (p="">< 0,0001)="" gw="" í="" samanburði="" við="">nýruvefur frá 1.5-ára barninu. Í dct fannst tölfræðilega marktæk lægri tjáning umsnúnings þegar 16. GW var borinn saman við 38. GW nýrnavef (p < 0.0001).="" ennfremur="" sást="" minni="" tjáning="" umsnúnings="" í="" dct="" í="" nýrnavef="" 7-ára="" barna;="" borið="" saman="" 13.,="" 15.="" (p="">< 0,001,="" bæði),="" 16.="" og="" 1.5-árs="" nýrnavef="" við="" dct="" af="" 7-árs="" gömlum="" nýrnavef="" (p="">< 0,00001,="" í="" sömu="" röð,="" mynd="" 4f).="" merki="" dvl-1="" tjáningar="" í="" gegnum="" mismunandi="" stig="" leiddi="" í="" ljós="" að="" hlutfall="" af="" 13.="" (p="">< 0.01),="" 15.,="" 16.="">< 0.001,="" respectively)="" and="" 22nd="" (p="" <="" 0.0001)="" gw="" had="" higher="" expression="" of="" immunoreactive="" cells="" compared="" to="" the="" pct="" of="" 7-year-old="" children="" kidney="" tissue.="" dvl-1="" immune-expression="" in="" dct="" of="" the="" kidney="" from="" 13th="" and="" 15th="" gw="" was="" significantly="" higher="" than="" in="" the="" 38th="" gw="" tissue="" (p="" <="" 0.0001,="" respectively,="" figure="">
2.2.4. Tengsl milli tjáningar á -túbúlíni og snúningi yfir í DVL-1 í nýrnavef sem þróast og eftir fæðingu
-Tjáning túbúlíns og öfugsnúnings var borin saman við DVL-1 tjáningu á öllum þroskastigum og í nýrnavef eftir fæðingu. -túbúlín var með tölfræðilega hærri tjáningu á öllum stigum sem sáust, samanborið við tjáningu DVL-1 (p < 0.001,="" mynd="" 3g).="" í="" gegnum="" öll="" stigin="" sem="" sáust="" hafði="" inversion="" hærri="" tjáningu="" samanborið="" við="" dvl-1="" (p="">< 0,0001,="" mynd="" 4="">
2.2.5. Samanburður á immunohistochemical litun við -Tubulin, útgáfu og DVL-1- og tölfræðileg greining á meinafræðilega breyttum nýrnavef (MCDK, CNF, FSGS) -Tubulin Munurinn á -tubulin litun í MCDK, FSGS og CNF var tölfræðilega marktækur í samanburði til heilbrigðs nýrnavefs eftir fæðingu sem samanburðarhóp (p < 0.0001,="" í="" sömu="" röð).="" dysplastic="" nýrnavefur="" hafði="" marktækt="" meiri="" tjáningu="" samanborið="" við="" samanburðarhópinn,="" en="" fsgs="" og="" cnf="" sýndu="" marktækt="" minni="" tjáningu="" á="" -túbúlíni="" samanborið="" við="" heilbrigða="" stjórn="" (mynd="">
Inversion
Inversion er tjáð í umfrymi óskipulagðra þekjufrumna og pípla MCDK (Mynd 5a). Í CNF einkennir inversion tjáning g og dct, en það sýnir sig minna í pct blöðrum (Mynd 5b). Í FSGS kemur inversion sterkt fram í g og dct en minna ákaft í pct blöðrum (Mynd 5c). Staðbundin tjáning umsnúnings sýndi tölfræðilega marktæka hærri litunartíðni í heilbrigðum nýrnavef (mynd 5g) samanborið við MCDK, FSGS og CNF (p < 0.0001,="" í="" sömu="">
Mynd 5. Tvöföld ónæmisflúrljómun litun á inversion (grænt), DVL-1 (rautt) og DAPI (blátt) í meinafræðilegum nýrnavef í MCDK (a), CNF (b) og FSGS (c): píplum (t) , glomeruli (g), pct blaðra (c), hæð pct þekjufrumna (*). Uppbygging og frumusamstaðsetning inversion og DVL-1 (örvahausar) eru sýndar í sameinuðu hlutunum með smáatriðum í innfellingum með hærri stækkun. Neikvæðar stýrilitanir eru sýndar sem innfellingar á inversion og DVL-1 (a). Stækkun ×40, kvarðastika 10{{20}} µm. Tengsl -túbúlíns (d) og snúnings (e) við DVL-1 tjáningu í MCDK, FSGS og CNF (tvíhliða ANOVA fylgt eftir með post hoc prófi SIDAK). Munurinn á hæð þekjufrumna (f) á FSGS, CNF og MCDK pct samanborið við heilbrigða stjórn (einstefnu ANOVA fylgt eftir með Tukey's post hoc prófi, n=50). Munurinn á heildarprósentu jákvæðra frumna af -túbúlíni, inversion og DVL-1 í MCDK, CNF og FSGS samanborið við heilbrigða stjórn (g–i), einstefnu ANOVA fylgt eftir með Tukey's post hoc prófi). Gögn eru sýnd sem meðaltal ± SD. Marktækur munur er sýndur með p-gildi (* p < 0,05,="" **="" p="">< 0,01,="" ****="" p="">< 0,0001).="" dvl-1="" dvl-1="" kemur="" aðeins="" fram="" í="" óskipulögðum="" mcdk-píplum,="" en="" í="" cnf="" einkennir="" tjáning="" þess="" dct="" og="" g="" (mynd="" 5a,b).="" í="" fsgs="" sést="" dvl-1="" sem="" væg="" viðbrögð="" í="" g,="" dct="" og="" pct="" (mynd="" 5c).="" heilbrigður="" nýrnavefur="" litaður="" með="" dvl-1="" sýndi="" marktækt="" hærra="" hlutfall="" litunar="" (mynd="" 5="" klst)="" í="" mótsögn="" við="" mcdk="" og="" fsgs="" (p="">< 0,0001,="" bæði),="" á="" meðan="" enginn="" marktækur="" munur="" fannst="" fyrir="">
2.2.6. Tengsl á milli tjáningar á -túbúlíni og snúningi í DVL-1 í meinafræðilega breyttum nýrnavef (MCDK, CNF, FSGS)Í MCDK, FSGS og CNF er -túbúlín litað marktækt hærra en DVL-1 (p < 0.0001,="" í="" sömu="" röð,="" mynd="" 5d).="" inversion="" litaðist="" marktækt="" hærra="" samanborið="" við="" dvl-1="" í="" mdck="" (p="">< 0,0001)="" og="" í="" fsgs="" (p="">< 0,01,="" mynd="">
2.2.7. Mismunur á hæð þekjufrumu í nærliggjandi, krókóttum pípum á milli heilbrigðrar stjórnunar og sjúklega breytts nýrnavefs (MCDK, CNF, FSGS)Hæð pct þekjufrumna (n {{0}} í hverjum hópi) var borin saman á milli píplafrumna í heilbrigðum nýrnavef og sjúklega breyttra nýrnavefs (Mynd 5b,c,f). Meðalhæð þekjufrumna í HC var 12,91 µm ± 1,847 µm og var marktækt hærri miðað við CNF og FSGS (p < 0}.0001,="" í="" sömu="" röð).="" meðalfrumuhæð="" í="" cnf="" pct="" var="" 9,011="" µm="" ±="" 1,453="" µm,="" en="" í="" fsgs="" var="" 8,114="" µm="" ±="" 0,9248="" µm.="" pct="" þekjufrumur="" mcdk="" sýndu="" ekki="" marktækar="" breytingar="" á="" hæð="" (12,17="" µm="" ±="" 1,476="" µm)="" samanborið="" við="">
2.2.8. Munur á lengd frumhimnuhjúps milli heilbrigðrar stjórnunar og sjúklega breytts nýrnavefs (MCDK, CNF, FSGS)
Aðallengd cilium (n= 50 í hverjum hópi) var borin saman á milli HC og sjúklega breyttra nýrnavefs (mynd 6c). Heilbrigður nýrnavefur og MCDK voru litaðir með -túbúlíni til að fullvissa um sérhæfni litunar á -tubúlíni (Mynd 6a,b). Í heilbrigðum nýrnavef var aðal cilium 5,065 µm ± 1,229 µm langur, en í MCDK voru CNF og FSGS marktækt lengri (p<0.0005, respectively).="" primary="" cilium="" length="" in="" mcdk="" was="" 9.908="" µm="" ±="" 2.434="" µm,="" in="" cnf="" 13.65="" µm="" ±="" 3.218="" µm,="" while="" in="" fsgs="" was="" significantly="" longer,="" 18.29="" µm="" ±="" 4.717="" µm,="" when="" compared="" to="" hc=""><0.0001) and="" other="" pathological="" kidney="" tissues="" of="" mcdk=""><0.0001) and="" cnf=""><>
Umræða
Markmið rannsóknarinnar var að kanna ónæmisvefjafræðilega tjáningu á a-túbúlíni, inversion og DVL-1 í fóstri.nýruvefjum og nýrnavef eftir fæðingu. Ennfremur vildum við kanna hvort tjáning og litamynstur a-túbúlíns, inversion og DVL-1 sé truflað í mismunandi nýrnasjúkdómum samanborið við heilbrigða stjórn. Nefnilega, þrátt fyrir mikinn áhuga hinna rannsakenda á hlutverki a-túbúlíns, inversion og DVL-1 við nýrnaþroska, hafa flestar fyrri rannsóknir notað dýr eða in vitro tilraunalíkön. Eftir því sem okkur er kunnugt er þetta fyrsta rannsóknin sem sýndi tjáningu og staðsetningu a-túbúlíns ásamt inversion og DVL-1 í nýrum fósturs og eftir fæðingu, og hafði kannað tjáningu nefndra próteina í nýrum sjúkdóma, eins og MCDK, FSGS og CNF. Við greindum einnig breytingar á lengd og útliti cilia með ljós- og rafeindasmásjá þar sem fyrri rannsókn okkar hefur þegar gefið til kynna að truflanir á cilia geti tengst blöðrumyndun í FSGF og CNF [19].
Í kanónísku Wnt-merkjaleiðinni, binding Wnt bindla við viðtaka nýtir Dvl [37]. Ferlum MET og planar frumuskautunarferilsins á fyrstu stigum nýrnamótunar er stjórnað af Wnt boðunum. Með því að miðla Wnt ferlinu, stjórna aðal cilia frumufjölgun, aðgreiningu og formgerð vefja [12] með því að skipuleggja frumufrumu og frumustefnu sem og lengingu pípulaga [2,38]. Í rannsókn okkar voru -túbúlín, inversion og DVL-1 öll til staðar í nýrnabyggingum og öll sambyggð ekki aðeins við nýrnaþroska fósturs heldur einnig í nýrnavef frá 1.5- og {{9 }}ára gömul börn. Þessar niðurstöður eru í samræmi við virkjun Wnt-merkjaferilsins sem sannað var að átti sér stað þegar meðan á píplumyndun stóð [39]. Auk þess hafa niðurstöður okkar leitt í ljós að tjáning -túbúlíns og inversion eru gagnkvæm tengd DVL-1 og að þær sýna tölfræðilega marktækan mun á tjáningarmynstri þeirra. Það er í fylgni við tilraunalíkön, þar sem stökkbreyting á fullri Dvl próteinfjölskyldunni í músum leiðir til skorts á magamyndunarferli, á meðan stökkbreytingar sem ná ekki til allrar próteinfjölskyldunnar sýna galla í staðsetningu hnúta ásamt líffæragöllum [40] . Fyrri niðurstöður benda til þess að inversion hafi hlutverk í frumuflutningi í Xenopus pronephros. Þar sem sá hluti tengist spendýralykkju Henle og fjarpíplum, gæti þetta bent til mikilvægis snúnings við nýrnaþroska hjá mönnum líka [41]. Í samræmi við þá forsendu leiddu fyrri rannsóknir í ljós að stökkbreyting á inversion geninu gæti leitt til nýrnabólgu af tegund 2, sem er miðlað af óeðlilegri DVL-1 tjáningu [42]. Þrátt fyrir að hlutverk frumslóða sé umdeilt í stjórnun Wnt-merkjaferilsins, komumst við að því að -túbúlín kom saman með inversion og DVL-1 í greindu nýrnasýnunum. Ennfremur bentu fyrri rannsóknir á að aðal cilium ásamt inversion stjórnar niðurbroti Dvl með því að hafa áhrif á Wnt-merkjaleiðina [43]. Í nýrnasjúkdómum í mönnum sem tengjast þróun blöðru hefur óeðlileg staðsetning og virkni frumhimnuhlífa sést [19]. Að sama skapi staðfesti þessi rannsókn einnig formfræðilegar breytingar á frummyndun cilia við meinafræðilegar aðstæður eins og CNF, FSGS og MCDK. Fyrri niðurstöður viðurkenndu að ofvirkjun á kanónísku Wnt ferlinum í kjölfar nýrnaskemmda leiðir til óafturkræfra byggingarbreytinga á nýrnavef [44]. Þvert á móti fékk aðal cilium það hlutverk að skipta úr kanónískri yfir í noncanonical Wnt leið til að aðstoðanýruviðgerð. Ennfremur reyndist ofvirkjun á kanónískum Wnt ferli í ígræddum nýrnavef hafa jákvætt forspárgildi í átt að bandvefsmyndun í nýrum [45]. Ef hið kanóníska Wnt-feril er ríkjandi á kostnað þess sem ekki er kanónískt, styður það kenninguna um nýrnatrefjun sem niðurstöðu. Niðurstöður okkar um lækkuð -túbúlín og öfug tjáningu í CNF og FSGS gefa til kynna óvirkni Wnt-ferilsins sem er ekki kanónísk, sérstaklega þar sem báðar aðstæður hafa tilhneigingu til að leiða til lokastigs.nýrnasjúkdómur.Nefnilega er talið að eðlileg staðsetning og virkni frumstíls gæti verið þáttur í að viðhalda reglulegri Wnt-feril og því forsenda eðlilegs þroska. Aftur á móti, ef Wnt ferillinn er aukinn, getur það leitt til óstjórnaðrar frumufjölgunar og aðgreiningar sem leiðir til krabbameinsvaldandi áhrifa [46]. Eins og áður hefur verið lýst er kanóníska Wnt leiðin nauðsynleg til að hefja MET og myndun nýrnahettunnar, en truflun hans gæti leitt tilnýruofvöxtur [47]. Niðurstöður okkar styðja þessa hugmynd með því að sýna lægstu tjáningu DVL-1 með hæstu tjáningu -túbúlíns í MCDK í samanburði við heilbrigða stjórn. Þessar niðurstöður geta falið í sér minnstu virkjun á kanónísku Wnt ferlinum, sem gæti verið undirliggjandi orsök fyrir fjarveru nýrnamyndunar. Aftur á móti gæti hæsta -túbúlíntjáningin með lægstu DVL-1 tjáninguna útskýrt niðurstöður margra blaðra þar sem engin skipulögð lenging og frumuskautun er stýrt af Wnt ferli sem er ekki kanónísk. Fyrri rannsóknir höfðu einnig sýnt að inversion hamlar kanónískum Wnt-boðaleiðinni með því að miða á Dvl fyrir niðurbrot [26]. Þetta skref í víxlverkun þeirra reyndist nauðsynlegt til að hamla kanónískum Wnt-merkjum við viðhald eðlilegrar pípulengingar og staðsetningar. Inversion stökkbreyting leiðir til uppstýringar á kanónískum Wnt-boðum, sem í kjölfarið olli óeðlilegri fjölgun í pípulaga frumum. Sýnt hefur verið fram á að þetta skref skipti sköpum í blöðrumyndun [42], á meðan útsláttur á inversion í músum leiðir til fjölblöðru nýrnasjúkdóms [48]. Samkvæmt kenningunni umnýrucystógenis, inversion er talið „mycoprotein“, vegna staðsetningar þess að aðal cilia innýrupípulaga frumur. Í rannsókn okkar voru frumblóðþurrkur til staðar á apical frumuyfirborði pípulaga frumna á öllum greindum stigum, en á fósturskeiðum var tjáning -túbúlíns sterkari en eftir fæðingu.
CISTANCHE MUN BÆTA NÝRA/NÝRAVERKI
Fyrri rannsóknir hafa sýnt að virkni cilia getur haft áhrif á vanstjórnun á -túbúlíni meðan á þroska stendur, sem getur leitt til blöðrumyndunar, óeðlilegs nýrnaþroska og hugsanlegs langvinns nýrnasjúkdóms í æsku [31,49]. Þetta er í samræmi við niðurstöður okkar um stytta og mismyndandi frumhlífar sem sjást í MCDK eða með mörgum og afar ílengdum eða sundruðum cilia sem finnast í víkkuðum píplum CNF og FSGS samanborið við heilbrigða stjórn. Til að styðja þá staðreynd að kanónískar og ekki kanónískur Wnt-boðaleiðir, sem stjórnast af aðal cilia, eru taldar nauðsynlegar fyrir eðlilegan nýrnaþroska, fundum við marktækt minni litun á inversion og DVL-1 í MCDK samanborið við heilbrigða stjórn. [31,49]. Mismunandi tjáningarmynstur gangverki -túbúlíns, inversion og DVL-1 á mismunandi nýrnaþroskastigum getur bent til þess að skipt sé á milli kanónísks og noncanonical Wnt-merkjaferils við eðlilega nýrnamyndun. Við leggjum til að skipting þeirra ákvarði umritun í kanónískum leið eða röð frumuflutnings og skautunar við nýrnaþroska í ókynjaðri boðleið. Jafnvægi þeirra og tjáning í öllum rannsökuðum nýrnabyggingum gefur til kynna mikilvægt hlutverk þeirra í eðlilegum nýrnaþroska. Við eðlilegan nýrnaþroska (frá 13. GW til 38. GW) minnkar heildartjáning -túbúlíns, inversion og DVL-1 þar sem nýrnavefur fær þroskað formgerð. Hjá 1.5- og 7- ára gömlum nýrnavef sýndu -túbúlín og inversion smávægilega aukningu á tjáningu sem styður þá staðreynd að ókynhneigð Wnt ferillinn helst virk eftir fæðingu. Þvert á móti, DVL-1 er viðvarandi með minnkuðu tjáningarmynstri sem gæti bætt niðurstöðunni um að kanóníska Wnt-ferillinn er þagnaður í heilbrigðum nýrnavef. Sem afleiðing af sjúklegum nýrnasjúkdómum gætu þekjufrumur nýrna brugðist við endurkomu EMT og bandvefsmyndunar [50] sem tengist endurvirkjun á kanónísku Wnt ferlinum [44]. Þess vegna gætu truflanir á -túbúlíni, inversion og DVL-1 sem finnast í sjúkum nýrum verið undirliggjandi meinafræðilegur gangur og afleiðing þess að skipt var úr noncanonical yfir í canonical Wnt feril í nýrum sem er að þróast sem vísar til skiptanna á milli afturkræfs nýra yfir í óafturkræf nýra. skemmdir. Ennfremur breytingar á fæðingu þeirra og eftir fæðingunýrutjáningarmynstur gæti tengst skertri nýrnastarfsemi á fullorðinsárum, sem leiðir til meðfæddra sjúkdóma og langvarandi nýrnabilunar.
4. Efni og aðferðir
4.1. Mannasýni
Sýnum af nýrnavef fósturs var safnað eftir meðgöngumissi á 14., 15., 16., 22. og 38. GW á kvensjúkdóma- og fæðingadeild Háskólasjúkrahússins í Split. Allt áunnið fósturefni var skoðað af meinafræðingi og voru eingöngu notaðir vefir án merki um frávik, blöðrur eða dauða í legi og með eðlilegt karyogram við rannsóknina. Sjúkraskrár mæðra voru skoðaðar áður en sýnatöku var tekin og ef um heilsufarsvandamál var að ræða sem gætu haft áhrif á útkomu meðgöngu voru nýrnavefur útilokaðir frá rannsókninni. Þroski var ákvarðaður af höfuðummáli, kviðummáli og lærleggslengd [51] í fylgni við tíðadagatöl sjúklinga. Sýnum af 1.5- og 7-árs gömlum nýrnavef var safnað eftir dauða fyrir slysni. Sýnin voru fengin á meinafræðideild Háskólasjúkrahússins í Split. Sýnin af fjölblöðrudysplastískum nýrnavef (MCDK) voru fengin eftir meðgöngumissi, focal segmental glomerulosclerosis (FSGS) og nýrnaheilkenni af finnskri gerð (CNF) vegna nýrnabrottnáms. Allt aflað efni var skoðað og metið af meinafræðingi sem flokkaði greiningarnar. Rannsóknarbókunin var samþykkt af siðanefnd læknadeildar háskólans í Split (20. maí 2016) í samræmi við Helsinki-yfirlýsinguna og uppfærslur hennar (flokkunarnr.: 003-08/16-03/0001, skráningarnúmer: 2181-198-03-04-16-0024, 20. maí 2016) [52].
4.2. Ónæmisvefjaefnafræði
Festing vefsýnis sem safnað var var unnin með 4 prósent paraformaldehýði í fosfat-bufferuðu saltvatni (PBS) í 24 klst við 22 ◦C. Eftir þurrkun í 100 prósent etanóli voru sýni felld í paraffín, eins og áður hefur verið lýst [53]. Sýni voru skorin í 5 µm þykka hluta með því að nota míkrótóm og síðan sett á smásjárgler. Til að staðfesta varðveislu vefja var tíundi hver hluti litaður með hematoxýlíni og eósíni [54]. Depart-feminization og ónæmisvefjaefnafræði voru framkvæmd eins og áður hefur verið lýst [2,55,56]. Eftir skolun í PBS voru smásjárgler ræktaðar yfir nótt með aðal mótefnum í rakaklefa við 22 ◦C (StainTray glærulitunarkerfi; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Bandaríkjunum). Aðalmótefni sem notuð voru voru kanínur einstofna and-alfa túbúlín mótefni (þynning 1:1000; ab179484, Abcam, Cambridge, Bretlandi), kanínu fjölstofna mótefni gegn umhverfingu (þynning 1:100; ab65187, Abcam, Cambridge, Bretlandi), einstofna músa DVL -1 mótefni (1:150 þynning; sc-8025, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA) og kanínum fjölstofna and-gamma tubulin mótefni (til að sannreyna aðal cilia-sértæka litun með alfa- túbúlín, 1:500 þynning; ab11321, Abcam, Cambridge, Bretlandi). Eftir skolun í PBS voru önnur mótefni gefin í klukkutíma eins og skráð er: asna gegn kanínu IgG H&L, Alexa Fluor 488 (þynning 1:400; ab150073, Abcam, Cambridge, Bretlandi) og geitamótmús IgG H&L, TRITC (þynning) 1:400; ab6786, Abcam, Cambridge, Bretlandi) 4',6-diamidino-2-fenýlindól tvíhýdróklóríð (DAPI) var notað til að lita kjarnana og eftir 2-mínúta ræktun, glærur voru þvegnar í PBS og lagðar yfir með uppsetningarmiðli og áklæði. Komið var í veg fyrir ósértæka litun með því að nota próteinblokk (ab64226; Abcam, Cambridge, Bretlandi) áður en aðal mótefnanotkunin var notuð. Sem neikvæð viðmiðun var foraðsogspróf framkvæmt, en nákvæmni aukamótefnanna var athugað með því að sleppa aðalmótefnum úr litunaraðferðum.
4.3. Rafeindasmásjárskoðun
Festing ánýruvefjum var framkvæmt í 4 prósent paraformaldehýði í 24 klst, fylgt eftir með eftirbindingu í 1 prósent osmíumtetroxíði í 1 klst. Afvötnunarferlið var framkvæmt með etanólröð og endað með innfellingu í LX 112 plastefni [22]. Eins míkrómetra þunnir hlutar voru litaðir með tólúidínbláum og rannsakaðir til að velja ofurþunna hluta. Ofurþunnir hlutar með þykkt 0.05 míkrómetra voru skoðaðir eftir litun með úranýl asetati og blýsítrati. JEOL 1200 EX smásjá var notuð til að ná örljósmyndunum.
4.4. Erfðagreining
Eins og áður hefur verið lýst [19], með því að nota hvítfrumur úr útlæga blóðinu, var erfðafræðilegt DNA dregið út. Arfhreinn stökkbreyting í NPHS1 geninu fannst (c.1096A > C; p.Ser366Arg) sem staðfesti greiningu á meðfæddu nýrnaheilkenni af finnskri gerð (CNF) [57].
CISTANCHE MUN BÆTA NÝRA/NYRA SÝKNING
4.5. Gagnagreining
Hlutagreiningin var gerð á FL flúrljómunarsmásjá þar sem notuð voru 3 FL flúrljómunarrásir (Olympus BX51, Tokyo, Japan). Myndir voru teknar með stafrænni myndavél DP71 (Olympus, Tókýó, Japan) með mikilli (×40) stækkun. Aðeinsnýruheilaberki sem innihélt proximal convoluted tubules (pct), distal convoluted tubules (dct) og glomeruli (g) voru áhugaverðar. Myndir voru síðan unnar með ImageJ hugbúnaði (Rasband, WS, ImageJ, US National Institute of Health, Bethesda, MD, Bandaríkjunum, https://imagej.nih.gov/ij/ (sótt 15. október 2018), 1997–2021. ) og Adobe Photoshop (Adobe Inc., San Jose, Kaliforníu, Bandaríkjunum) til frekari úttektar. Áður en frumutalning fór fram var tólið skipt rásum ImageJ notað. Eftir það var upprunalega ónæmisflúrljómunar smásjámyndin dregin frá með rauðu eða grænu rásinni (eftir því hver upprunalega rásin var) með því að nota myndreiknivélina ImageJ tólið til að koma í veg fyrir merkisleka. Gildi undir viðmiðunarmörkum 50 voru talin neikvæð. Við töldum ónæmisvirk merki í frumum með að minnsta kosti 20 byggingum (pct, dct eða g) á hverju stigi eða jákvæður heildarfjöldi frumna á hverja örmynd af fjölblöðrudysplastinýruvefjum, FSGS og CNF. Við flokkuðum frumur sem jákvæðar ef ónæmisflúrljómunarmerkið safnaðist á einhverju stigi himnunnar, umfrymis eða kjarna yfir gildi 50 mælt á ImageJ hugbúnaði með þröskuldsskipun. Neikvæðar frumur voru flokkaðar sem frumur þar sem engin ónæmissvörun var til staðar. Tveir óháðir rannsakendur greindu gögnin.
4.6. Hálfmagnsgreining
Styrkur -tubulin, inversion og DVL-1 litunarmerkja var metinn af tveimur óháðum rannsakendum sem notuðu ImageJ hugbúnað. Heildarmerkisstyrkur var mældur eftir að myndin var stillt á 8-bitagerð; eftir það var styrkleiki merkjalitunar metinn í 20 pct, dct og g með því að mæla útlínusvæði byggingarinnar. Ef niðurstöður milli úttektaraðila voru mismunandi, skýrði þriðji óháður rannsakandi vafan. Hámarksmerkjastyrkur fyrir -túbúlín var 84.125 ± 3.214 SD, fyrir inversion var 71.50 ± 2.715 SD og fyrir DVL-1 80.916 ± 1.875 SD. Hæsta mettun merkjalita á smásjá ljósmyndunum var merkt sem 3 (66,66–99,99 prósent af heildarmyndarstyrk), fylgt eftir með 2 (33,33–66,66 prósent) fyrir millistyrk merkis og 1 (0,33 prósent –33,33 prósent) fyrir lágan merkistyrk (tafla 1.).
4.7. Tölfræðigreining
Til að ákvarða mun á stigum og mannvirkjum var Kruskal–Wallis prófið gert, fylgt eftir með Dunn's post hoc með því að nota GraphPad Prism hugbúnað (Graphpad Software Inc., San Diego Kaliforníu, Bandaríkjunum, www.graphpad.com (sótt 15. október) 2018.)). Fjöldi jákvæðra frumna var gefinn upp í prósentum sem meðalgildi ± staðalfrávik (SD), en tölfræðileg marktekt var viðurkennd við p < 0,05.="" fjöldi="" greindra="" mannvirkja="" var="" 4200="" í="" 35="" sýnum,="" með="" heildarfjölda="" 135.256="" frumur="" taldar.="" við="" notuðum="" 2-way="" anova="" með="" post="" hoc="" prófi="" sidak="" til="" að="" prófa="" mun="" á="" tjáningu="" á="" -tubulin,="" inversion="" og="" dvl-1="" á="" mismunandi="" þroskastigum.="" til="" að="" rannsaka="" próteintjáningu="" varðandi="" þroskatíma="" notuðum="" við="" línulega="" aðhvarf.="" einhliða="" anova="" á="" eftir="" tukey's="" post="" hoc="" prófi="" var="" notað="" til="" að="" kanna="" muninn="" á="" tjáningu="" -tubulin,="" inversion="" og="" dvl-1="" hjá="">nýruvefjum samanborið við vefi MCDK, FSGS og CNF. Munur á tjáningu próteina á milli MCDK, FSGS og CNF var rannsakaður með 2-leið ANOVA og síðan Sidak's post hoc prófi. Einhliða ANOVA fylgt eftir með Tukey's post hoc prófi var notað til að meta muninn á lengd cilia og þekjufrumnahæð á pct milli heilbrigðrar viðmiðunar og sjúklegrar.nýruvefjum. Gögnin voru sýnd sem meðalgildi ± staðalfrávik (SD) með tölfræðilegum mun viðurkenndum við p <>
