Tjáning á immúnóglóbúlíni G í nærliggjandi píplum þekjufrumum úr mönnum

Tengiliður: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Netfang:audrey.hu@wecistanche.com

ZHENLING DENG o.fl

Ágrip. Nærliggjandipípulagaþekjufrumur (PTEC) hafa meðfædda ónæmiseiginleika og framleiða bólgueyðandi þætti, chemokines og komplementþætti sem knýja fram þekju-mesenchymal umskipti (EMT). Fyrri rannsóknir okkar leiddu í ljós að mesangial frumur og podocytes úr mönnum gátu myndað og seyta immúnóglóbúlíni (Ig)A og IgG, í sömu röð. Markmið þessarar rannsóknar var að meta tjáningu Igs í PTEC. Í fyrsta lagi greindist IgG í umfrymi, frumuhimnu og holrýmiPTECí eðlilegum nýrnaberki meðónæmisvefjaefnafræði. Í öðru lagi greindust umritun Ig gena og V(D)J endurröðun í stökum PTEC með hreiðri PCR og Sanger raðgreiningu. Í þriðja lagi greindust Ig , Igκ og Igλ greinilega í ódauðlegri PTEC línu (HK-2) með ónæmislitun og Western blotting, þar sem RP215 (mótefni sem binst aðallega IgG sem ekki er af B frumum) var notað. Að auki greindust Ig , Igκ og Igλ genafrit, íhaldssamt V(D)J endurröðun á Ig breytilegu svæðinu, endurröðunarvirkjandi gen 1/2 og virkjunar-framkallaður cýtidín deamínasi allt í HK-2 frumum. Þessar upplýsingar bentu til þess að PTECs gætu tjáð IgG á svipaðan hátt og B frumur. Ennfremur var IgG tjáning uppstýrt af TGF-1 og gæti tekið þátt í EMT.

Leitarorð:nærliggjandipípulagaþekjufrumur, einfruma, HK‑2, IgG, þekjuvefjaskipti

Cistanche tubulosa kemur í veg fyrir nýrnasjúkdóm, smelltu hér til að fá sýnishornið

Kynning

Nærliggjandipípulagaþekjufrumur (PTEC) eru algengustu frumugerðin ínýruog gegna mikilvægu hlutverki í nýrnaviðgerð og/eða framgangi langvinnra nýrnasjúkdóma. PTECs hafa ónæmisfræðilega virkni með því að tjá marga Toll-like viðtaka (TLR), eins og TLR 1, 2, 3, 4 og 9 (1,2), og sameindir tengdar frumustarfsemi sem sýnir mótefnavaka, þar á meðal MHCII, CD74, CD80 , og geisladiskur 86 (3). Þessir meðfæddu ónæmiseiginleikar PTEC gera þeim kleift að bregðast við margs konar áreiti, með tilheyrandi framleiðslu og losun lífvirkra miðla, þar á meðal bólgueyðandi frumudrepna, krabbameinslyfja og viðbótarþátta, sem knýja fram millivefsbólgu og bandvefsbólgu (4). PTECs tjá einnig Fc-viðtaka nýbura og varðveita getu sértækrar pH-háðrar bindingar og blóðkorna ímmúnóglóbúlíns (Ig)G (5). Hins vegar, eftir því sem við best vitum, er enn óþekkt hvort PTECs tjá Igs.

Áður var sett fram tilgáta að Ig væri eingöngu framleitt af þroskuðum B frumum og plasmafrumum og að Ig virki sem mótefni til að þekkja og hlutleysa ýmsa sýkla. Hins vegar hefur þessari kenningu verið mótmælt undanfarna áratugi, þar sem sífellt fleiri vísbendingar hafa greint frá því að Ig, þar á meðal IgA, IgG og IgM, geti verið framleitt og seytt af öðrum en B frumum, svo sem þekjukrabbameinsfrumum úr mönnum (6,7) og eðlilegar frumur sem ekki eru B-frumur (8,9), sem og á ónæmissérhæfðum stöðum, svo sem í augum (10), miðtaugafrumum (11,12), fylgju (13) og eistum og epididymis (14)

Svipað og B-frumuafleidd Ig (B-Igs), eru ekki B-Ig einnig afurðir Ig genaumritunar og endurröðunar og sýna klassískt V(D)J endurröðunarmynstur með núkleótíðviðbótum á mótunum og líkamsstökkbreytingum (7, 11,14). Öfugt við B-Igs sýna non-B-Igs takmarkað V(D)J endurröðunarmynstur og minni fjölbreytni (7). Í virkni, hafa ekki B-Ig ekki aðeins náttúrulega mótefnavirkni í húð og slímhúð (8) heldur geta þau einnig virkað sem vaxtarþættir til að stuðla að frumufjölgun og viðloðun og geta aukið upphaf og meinvörp krabbameins með því að bindast integrínum ( 15-17). Til dæmis, RP215 viðurkennt krabbamein IgG framkvæmir krabbameinsvaldandi hlutverk sitt með því að hafa samskipti við integrin 6 4 flókið og virkja FAK og Src ferla (15).

Fyrri rannsókn okkar sýndi fram á að mesangial frumur (18) og podocytes (19) geta myndað og seytt IgA og IgG og tekið þátt í frumuvexti og frumuviðloðun in vitro. Þessi rannsókn miðar að því að meta tjáningarmagn Igs í PTECs og kanna hugsanlegt hlutverk þess í þekju-mesenchymal umskipti (EMT).

Áhrif cistanche: gagnast nýru

efni og aðferðir

Frumuræktun og meðferð.Ódauðleg PTEC lína HK-2 var keypt frá American Type Culture Collection. HK-2 frumur voru ræktaðar í DMEM/F12 ásamt 100 U/ml penicillíni, 0,1 mg/ml streptómýsíni (allt Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.) og 10 prósent nautgripasermi (FBS; Ástralskur uppruna; Biological Industries USA, Inc.) við 37˚C í andrúmslofti sem inniheldur 95 prósent loft og 5 prósent CO2. Til að forðast truflun á Ig í FBS var efnið skipt út fyrir serumfrítt æti 24-48 klst. fyrir frumuuppskeru. HK‑2 frumur voru meðhöndlaðar með mismunandi styrk (2, 5 og 10 ng/ml) af TGF‑1 (Sigma‑Aldrich; Merck KGaA).

Einstök PTEC einangrun og cDNA myndun.Nýrnasýni úr mönnum af stórsæjum eðlilegum heilaberkisvef var tekið úr sjúklingi (karlkyns, 31 árs) sem gekkst undir nýrnabrottnám vegna nýrnakrabbameins án augljósrar nýrnabilunar. Einfrumu dreifa var útbúin með því að melta nýrnaberki með 1 mg/ml kollagenasa I (Sigma-Aldrich; Merck KGaA) við 37˚C í 20 mín. PTECs voru flokkuð með því að nota phycoerythrin (PE)-conjugated anti-CD10 (cat. no. 312203) og allophycocyanin (APC)-conjugated anti-CD13 (cat. no. 301705; bæði BioLegend, Inc.) með flúrvirkjaðri flokkun BD FACSAria II sérpöntunarkerfi) eins og áður hefur verið lýst (20). Samsvarandi samsætuviðmiðunarmótefni (cat. nr. 400111 og 400119; bæði BioLegend, Inc.) voru notuð til að útiloka ósértæka litun. Tvöfalt jákvætt merktar lifandi frumur voru einangraðar sem PTEC. Eitt PTEC var handvirkt valið undir öfug ljóssmásjá með háræðapípettu og var síðan flutt yfir í 0,2 ml þunnveggað PCR rör sem innihélt leysistuðpúða (21). Einstök PTEC RNA útdráttur og cDNA nýmyndun voru framkvæmd samkvæmt áður lýstum aðferðum (21). Alls voru fimm stak PTEC notuð til að greina umritun og endurröðun Ig gena.

PCR mögnun.Heildar-RNA var dregið úr HK-2 frumum, einkjarna frumum í útlægum blóði [PBMC, einangruð úr 31 árs gömlum kvenkyns heilbrigðum gjafa með Ficoll (cat. nr. 7111011; Dakewe Biotech., Ltd.) ] og nýrnaberki (frá sama sjúklingi og notaður var í stakri PTEC einangrun) með TRIzol® hvarfefni (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.), og styrkur RNA var metinn með NanoDrop litrófsmæli (NanoDrop; Thermo Fisher Scientific, Inc.) . Í kjölfarið var 2 µg heildar-RNA umritað í öfugt við cDNA með því að nota RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (cat. nr. K1622; Thermo Fisher Scientific, Inc.). PCR var framkvæmt með því að nota primera sem miðuðu að föstum svæðum Ig , Igκ, Igλ og virkjunar-induced cytidine deaminasa (AID). Nested PCR var framkvæmd til að magna upp breytilegt svæði Ig , lágþéttni lípópróteinviðtakatengt prótein 2 (LRP2) og endurröðunarvirkjunargen (RAG)1 og RAG2. PCR afurðirnar voru aðskildar með rafdrætti á 1,0 prósent agarósa hlaupi og voru sýndar með því að nota GelRed (cat. nr. 41003; Biotium, Inc.). Primerarnir fyrir AID, RAG1/2, og stöðugu svæðin Ig , Igκ, Igλ sem notuð eru í þessari rannsókn vísa til grunna sem Jing et al (19) notuðu. Primers á Ig breytilegu svæðinu vísa til primera sem van Dongen o.fl. (22). Hinir primerarnir sem notaðir eru fyrir PCR eru skráðir í töflu SI. Hitahringrásarskilyrðin eru skráð í töflu SII.

Sanger raðgreining og greiningar á raðgreiningargögnum.PCR afurðir Ig breytilegu svæðisins sem fengust úr stökum PTEC, HK‑2 frumum og PBMCs voru klónaðar í pGEM‑T Easy Vector System I (cat. nr. A1360; Promega Corporation), sem var umbreytt. inn í TOP10 hæfar frumur (CB104; Tiangen Biotech Co., Ltd.). Í stuttu máli var 5 µl bindingarafurðum bætt við 30 µl TOP10 hæfar frumur, ræktaðar á ís í 30 mínútur, hitasjokkaðar við 42˚C í 90 sekúndur og ræktaðar á ís í 5 mínútur. Síðan var 500 µl LB bætt við og látið standa við 37˚C í 40 mínútur áður en hluti af bakteríuvökvanum var sáð á Petri diska húðuð með 0,1 mmól/l IPTG og 20 µg/ml X-Gal. Réttunum var snúið við við 37˚C yfir nótt. Alls voru 5-16 hvítar þyrpingar í hverju sýni valdar af handahófi og raðaðar með ABI 3730XL erfðagreiningartæki (Applied Biosystems; Thermo Fisher Scientific, Inc.). Endurraðaðar V(D)J raðir voru bornar saman við þær í grunnleitarverkfærinu fyrir staðbundin jöfnun (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/) til að bera kennsl á þá kímlínugenhluta og -mót sem passa best við eftir klippingu á grunni .

Western blot greining.HK-2 frumur voru lýsaðar í TSD lýsisbuffi [1 prósent SDS, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 50 mM DTT] sem innihélt próteasahemla kokteil (Applygen Technologies Inc.), hljóðbeitt við ísvatn í 1 mín ( vinna 5 sek og hvíla 15 sek; 3 sinnum) og lýsað í 30 mínútur við stofuhita. Eftir skilvindu við 12,000 xg í 10 mínútur við 4˚C, var próteinstyrkur frumulýsis ákvarðaður með BCA setti (Applygen Technologies Inc.). Í kjölfarið var 5X afoxandi hleðslubuffi bætt við lysatið, soðið við 100˚C í 10 mínútur og sýnin voru strax notuð til Western blot greiningar. Sermi, notað sem jákvæð viðmiðun fyrir Ig, var einangrað frá heilbrigðum gjafa (sama gjafa og notað í PBMC) með skilvindu við 2.103 xg í 10 mínútur við stofuhita.

Áhrif cistanche: gagnast nýru

Western blotting var framkvæmd samkvæmt stöðluðum aðferðum. Í stuttu máli voru 3{{40}} µg prótein aðskilin með SDS-PAGE á 10 prósent hlaupum og voru flutt yfir á nítrósellulósahimnu. Í kjölfarið var himnan stífluð í 5 prósenta undanrennu við stofuhita í 1 klst og var hún ræktuð með frummótefnum við 4˚C yfir nótt, þar á meðal kanínur and-manna Ig (cat. no. ab109489; 1:1,{{8} }), kanína and-mann-Ig 4 (cat. no. ab109493; 1:1,000), anti-Igκ (cat. no. ab124727; 1:10,000), and- Igλ (kat.nr. ab124719; 1:20,000), kanínu-and-mann-aktín (cat. nr. ab8227; 1:2,000) (allt frá Abcam), og RP215 einstofna mótefni (mAb) (gefin af prófessor Xiaoyan Qiu, Peking háskólanum, Peking, Kína; 1:1,000), sem auðkenndi sérstaklega kolvetnatengda myndefni á non-B-Ig . Himnan var síðan ræktuð með geitum gegn kanínu (cat. no. 926-32211) eða and-mús (cat. no. 926-32210) IgG-IRDyeTM680CW auka mótefni (bæði 1:10,{{37}; LI-COR Biosciences) við stofuhita í 1 klst. Merkið var greint með því að nota Odyssey Imaging kerfið og Odyssey V3.0 hugbúnaðinn (bæði LI-COR Biosciences). ImageJ hugbúnaður (útgáfa 1.8.0; National Institute of Health) var notaður fyrir hálf-magngreiningu.

IgG hreinsun og massagreiningu.Eftir að HK‑2 frumur höfðu verið ræktaðar í DMEM/F12 án FBS í 48 klst, var ræktunarfrumvökvanum safnað eftir skilvindu við 2,103 xg í 10 mínútur við 4˚C. Frumufljótandi vökvinn var hreinsaður með sækniskiljun með prótein G Sepharose, samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda (cat. nr. 17-0618-02; Thermo Fisher Scientific, Inc.). Skolið var örsíuað til að skipta út skolunarjafnalausninni (0,1 M glýsín; pH 2,4) fyrir PBS. Hreinsuðu próteinin voru aðskilin með SDS-PAGE á 10 prósent hlaupum, greind með Western blotting og greind frekar með massagreiningu, framkvæmd af Beijing Protein Innovation Co., Ltd.

Ónæmisflúrljómun.HK‑2 frumur voru ræktaðar á hyljara, sem voru festar í köldu óþynntu asetoni í 5 mínútur við stofuhita. Í kjölfarið voru skyggnurnar þvegnar tvisvar í PBS og stíflaðar með 5 prósent FBS/PBS við stofuhita í 20 mínútur, eftir það voru þær ræktaðar með frummótefnum við 4˚C yfir nótt. Mótefnin voru þau sömu og notuð í western blotting: Kanína and-mann-Ig (1:150), and-mann-Igκ (1:250), and-mann-Igλ (1:250) og RP215 mAb (1:200) ); PBS var notað sem neikvæð viðmiðun. Eftir þvott í PBS voru skyggnurnar ræktaðar með flúorescein ísótíósýanati-merktu geita-anti-kanínu (cat. no. A11008) eða geita and-mús (cat. no. A11001) IgG mótefni (1:1,000; Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.) við stofuhita í 1 klst. Kjarnar voru litaðir með DAPI. Myndir voru teknar undir Leica DFC300 FX flúrljómunarsmásjá (Leica Microsystems GmbH).

Ónæmisvefjaefnafræðileg litun.Nýrnaberki með krabbameini var safnað frá fjórum karlkyns sjúklingum (38-49 ára) með nýrnakrabbamein. Venjulegur nýrnabarkar með krabbameini eftir nýrnabrottnám voru festir með 10 prósent formalíni í 48 klst. við stofuhita og síðan settir inn í paraffín. Paraffín-innfelld nýrnasýni úr mönnum voru skorin í 3-µm hluta og afparaffínhreinsuð og endurvötnuð í gegnum röð stigaðra etanólstyrks. Mótefnavaka endurheimt var framkvæmd með því að sjóða í 0.05 M Tris-EDTA (pH 9,0) í hraðsuðukatli í 3 mín. Hlutarnir voru síðan ræktaðir með 3 prósent H2O2 lausn í 10 mínútur við stofuhita til að útrýma innrænum peroxidasa og ræktaðir með venjulegu geitasermi (cat. nr. ZLI-9022, ZSGB-BIO, Kína) í 30 mínútur við stofuhita til að loka á ósérhæfða bindistaðir mótefna við stofuhita. Í kjölfarið var óbein ónæmisvefjaefnafræðileg litun gerð með frummótefnum við 4˚C yfir nótt, þar á meðal RP215 mAb (1:200; 5 µg/ml), kanína and-mann-Ig (1:2,000), and-manneskju. Igκ (1:1,000), and-manneskju Igλ (1:1,000) (sömu mótefni og notuð eru í Western blotting). Hlutar án frummótefna voru notaðir sem neikvæð viðmið. Glerurnar voru síðan ræktaðar með óþynntum piparrótarperoxidasamerktum aukamótefnum (cat. nr. PV-6001 og PV-6002; bæði OriGene Technologies, Inc.) við stofuhita í 30 mínútur. Tengd mótefni fundust með því að nota díamínóbensidín. Að lokum voru glærurnar mótlitaðar með hematoxýlíni. Myndir voru teknar með ljóssmásjá (x200 stækkun). Tölfræðigreining. Gögnin eru sett fram sem meðaltal ± staðalfrávik og voru greind með SPSS 20.0 fyrir Windows (IBM Corp.). Allar tilraunir voru endurteknar 3 sinnum. Munurinn á milli margra hópa var greindur með einhliða ANOVA og Tukey's posthoc prófi. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

Áhrif cistanche: gagnast nýru

Niðurstöður

IgG tjáning í nýrnapíplum þekjufrumum í nýrnaberki.Eðlilegir nýrnaberki, sem safnað var frá gjöfum sem gangast undir nýrnabrottnám vegna nýrnafrumukrabbameins, voru notaðir til að ákvarða IgG tjáningu í nýrnapíplum þekjufrumum með ónæmisvefjaefnafræði með því að nota mótefni gegn Ig , Igκ, Igλ og RP215 (sem er aðallega mótefni binst ekki-B-IgG). Jákvæð litun á IgG þungum og léttum keðjum greindist ekki aðeins í PTECs heldur einnig í fjarlægum þekjufrumum í píplum, annað hvort í umfrymi, frumuhimnu eða pípulaga holrými (mynd 1).

Umritun og V(D)J endurröðun IgG í stakum PTEC. Til að koma í veg fyrir truflun á afgangsblóði, bindingu og transcytosis IgG af PTEC í nýrnaberki, og til að fá beinar vísbendingar um tjáningu IgG í PTEC, voru stakar PTECs flokkaðar frá nýrnaberki manna með CD10 og CD13 sammerkingu með flæði frumugreining (20). Eins og sýnt er á mynd 2A, voru CD10/CD13 tvöfalt jákvæðar PTECs 4,1 prósent af lífvænlegum frumum í sýninu. Einangruðu PTEC-efnin voru staðfest frekar með því að nota sértæka merkjagenið LRP2 og B-frumumengun var eytt með CD19. Afrit af breytilegu svæði Ig voru mögnuð í fimm stökum PTEC með hreiðri PCR (mynd 2B og C). Niðurstöður Sanger raðgreiningar leiddu í ljós að PTECs sýndu virka og íhaldssama VDJ endursamsetningu IgG þungrar keðju (tafla I), sem gefur til kynna að IgG tjáning gæti átt sér stað í PTEC.

Tjáning IgG þungrar og léttrar keðju í HK-2 frumum. Þar sem erfitt var að greina tjáningu IgG próteina í einni PTEC og fá nóg af PTEC fyrir western blotting, var HK-2 frumulínan, sem samanstendur af ódauðlegum PTEC, valin til að staðfesta tjáningu IgG próteins enn frekar. Ónæmisflúrljómunargreining sýndi jákvæða litun á Ig, Igκ og Igλ í umfryminu og sterkari jákvæða litun á RP215 aðallega í umfrymi og frumuhimnu (mynd 3A).

Í kjölfarið var tjáning IgG þungra og léttra keðja í HK-2 frumum greind með Western blotting við afoxandi aðstæður. Til að útrýma FBS truflunum í ræktunarmiðlinum var efnið sem innihélt FBS þurrkað með samsvarandi mótefnum og litað neikvætt. Markaðsbundið IgG mótefni gat greint IgG úr sermi en ekki IgG af HK-2. Aftur á móti gæti RP215 greint HK-2-afleitt IgG, en ekki IgG í sermi. Bæði auglýsing IgG mótefni og RP215 gátu greint Ig við 55 kDa. Ig 4 (36 kDa) band greindist í HK-2 frumum, í samræmi við fyrirhugaðan mólmassa. Ennfremur sáust Igκ (25 kDa) og Igλ (50 kDa, dimer) tjáning í frumulýsunum (mynd 3B). Í kjölfarið var IgG í frumufrumvökvanum hreinsað með próteini G, staðfest með Western blotting og raðgreint með massagreiningu, sem sýndi fram á að 55-kDa bandið innihélt brot af Igκ keðjunni og Ig þunga keðju breytilegu svæðinu, samkvæmt National Center for Gagnagrunnur um líftækniupplýsingar (NCBI) (mynd 3C-E). Þessar upplýsingar bentu til þess að HK-2 frumur mynduðu og seyttu IgG próteini.

Umritun og V(D)J endursamsetning IgG þungra og léttra keðja í HK-2 frumum. Umritun Ig gena og virk V(D)J endurröðun er forsenda Ig tjáningar. Til að staðfesta tjáningu IgG í HK‑2 frumum voru Ig , Igκ og Igλ afrit metin með því að magna upp stöðug og breytileg svæði í HK‑2 frumum (mynd 4A og B). Raðgreining á stöðugum PCR afurðum sýndi mikla samsvörun við birta röð í NCBI gagnagrunninum. T-A klónun og Sanger raðgreining sýndu að Ig í HK-2 frumum sýndi íhaldssama V(D)J endurröðun með VH4-4/D2-8/JH5. Aftur á móti kom fram fjölbreytileiki V(D)J endurröðunar í PBMCs, sem útrýmdu primer bias (tafla II). Líkt og B frumur sýndi HK-2-afleidd IgG dæmigerða afkastamikla V(D)J endursamsetningu með V-D og D-J mótunum (mynd 4C). Ennfremur greindust líkamsstökkbreytingarnar í HK-2-afleiddu Ig (bil, 6,8-8,4 prósent) með 7 af 15 heitum reitamótefnum (RGYW/WRCY, W=A/T, R= A/G, Y=C/T) birtast með stökkbreytingum.

Að auki greindust AID-afrit (nauðsynlegur þáttur fyrir líkamsofstökkbreytingu og flokksskipta endursamsetningu í B frumum), og RAG1 og RAG2 [nauðsynleg fyrir V(D)J endurröðun] í HK-2 frumum (mynd 4B), sem gefur til kynna að vélbúnaðurinn sem liggur að baki Ig-myndun í HK-2 frumum gæti verið svipaður og í B-frumum.

TGF‑1 stjórnar IgG tjáningu í HK‑2 frumum. HK‑2 frumur voru örvaðar með ýmsum styrkjum af TGF‑1 í 48 klst. Ónæmisflúrljómun litun leiddi í ljós að umfrymis IgG sýndi aukna jákvæða litun samanborið við samanburðarhópinn (mynd 5A). Western blotting staðfesti að IgG var marktækt uppstýrt af TGF-1 (P<0.05; fig.="" 5b="" and="">

Áhrif cistanche: gagnast nýru

Umræða

Þessi rannsókn sýndi fram á að PTECs tjáðu IgG með genaumritun og virkri íhaldssamri V(D)J endurröðun, sem var svipað og ekki-B-IgG. TGF-1 uppstýrði IgG tjáningu í HK2 frumum.

Til að kanna hvort PTECs tjáðu IgG, var IgG fyrst greint í umfrymi, frumuhimnu og holrými PTECs í eðlilegum nýrnaberki manna með ónæmisvefjafræði; niðurstöðurnar bentu til þess að PTECs mynduðu og seyttu IgG. Þetta er öfugt við venjulega meinafræðilega skoðun okkar, þar sem ekkert augljóst IgG fannst í PTEC. Þetta gæti stafað af mjög veikri PTEC-litun, sem var of lítil til að hægt væri að greina hana, sérstaklega í ónæmistengdum gauklasjúkdómum þar sem Igs eru mjög jákvætt í gaukla og PTEC-litun gæti tapast óviljandi en tilbúnar. IgG transcytosis frá blóðrásinni með PTEC um Fc viðtaka var að hluta til útilokuð, þar sem skýr litun á IgG með RP215 sást í frumuhimnu og umfrymi. Þessar niðurstöður bentu til þess að PTEC-afleitt IgG væri svipað öðru en B-IgG og gæti verið með einstakar glýkósýleraðar epitopur, sem hægt er að þekkja sérstaklega af RP215 í stað verslunarmótefna gegn IgG (15). Niðurstaðan að aðeins hluti af pípulaga þekjufrumum tjáir IgG má skýra með kraftmikilli tjáningu við mismunandi frumulotur, sem var svipað tjáningarmynstri IgA frá mesangial frumu (18). Samlitun IgG með pípulaga merkjum (eins og aquaporin 1 og aquaporin 3) væri gagnlegt fyrir frekari rannsóknir til að auka niðurstöður þessarar rannsóknar.

Einfrumu RNA raðgreining getur greinilega sýnt umritun tiltekins gena í tiltekinni frumu. Afrit af Ig keðjunni og V(D)J endurröðun greindust í stökum PTEC. Þrátt fyrir að aðeins fimm stak PTEC hafi verið notuð var ferlið strangt þar sem nýrnaberki var safnað langt frá æxlinu og hver einasta fruma var flokkuð með frumuflæðismælingu með tveimur PTEC-sértækum merkigenum, endurstaðfest með þriðja sértæka merkigeninu (LRP2) og B-frumumengun var eytt. Niðurstöðurnar leiddu í ljós að PTEC eru ekki aðeins til staðar með IgG gena umritum heldur einnig klassískri V(D)J endurröðun á breytilegu svæðinu sem B frumur, eins og afkastamikill V(D)J endurröðun með V-D og D-J mótum (mynd 4), sem gefur til kynna að PTECs hafi möguleika á að framleiða IgG. Að auki sýndi íhaldssamari V(D)J endurröðunin að PTECs koma fram með IgG gena umritum og V(D)J endurröðun sem eru svipuð öðrum non-B frumum.

HK-2, ódauðleg PTEC lína, er auðvelt að rækta í miklu magni. Þessi rannsókn staðfesti IgG prótein tjáningu í ræktuðum HK-2 frumum; IgG greindist í HK-2 frumum með bæði ónæmisflúrljómun og Western blotting. Ig 4, undirflokkur Ig , greindist einnig við bandstærð í samræmi við spáð mólmassa. Massagreining leiddi í ljós að próteinið sem var hreinsað úr frumufljótandi vökva með því að nota prótein G innihélt brot af Ig þunga keðju breytilegu svæðinu og IgK keðju, sem gefur vísbendingar um IgG seytingu með PTEC. IgG umritun í HK‑2 frumum studdi enn frekar IgG tjáningu í PTEC og íhaldssöm V(D)J endurröðun með IGHV4‑4/IGHD2‑8/IGHJ5 í HK‑2 frumum studdi enn frekar nærveru IgG í HK‑2 frumum svipað til annarra frumna sem ekki eru B.

Þessi rannsókn rannsakaði einnig undirliggjandi gangverk IgG framleiðslu í PTEC með því að skoða umritun RAG1, RAG2 og AID í HK-2 frumum. Í ljós kom að RAG1, RAG2 og AID voru umrituð í HK-2 frumum. Að auki hafa RAG1, RAG2 eða AID umrit áður greinst í fjölmörgum öðrum frumum sem ekki eru B frumur, svo sem fræfrumum (19) og nokkrum krabbameinsfrumulínum (23). Þessar niðurstöður bentu til þess að frumur sem ekki eru B frumur, þar með talið PTEC, gætu haft svipaða aðferð við myndun Ig og B frumur. Hins vegar þarf frekari rannsókn hvort AID og/eða RAG1/2 séu nauðsynleg gen fyrir PTEC-afleidd IgG. Auk þess eru CD4 T frumur með eggbúshjálp mikilvægar til að stjórna B-frumuaðgreiningu kímstöðvar í plasmafrumur og styðja við framleiðslu Igs (24). Óbirt gögn okkar leiddu í ljós að ekki B-Ig greindust enn í T- og B-frumu-skorti NOD-SCID-músum, sem bendir til þess að non-B-Igs voru ekki algjörlega háð T-hjálparfrumum. Hvort T-hjálparfrumur séu nauðsynlegar til að PTEC geti tjáð IgG krefst frekari rannsókna.

TGF-1 hefur lykilónæmisbælandi hlutverk í Ig framleiðslu. Til dæmis, TGF-1 framkallaði IgA flokkaskipti og seytingu í örvuðum B frumum í milta músa (25) og B frumum í hálskirtlum (26). McIntyre et al (27) sýndu fram á að TGF-1 örvaði sértækt IgG2b seytingu með lípópólýsykru-virkjuðum B frumum líklegast með því að örva IgM til IgG2b flokkaskipta. Duan et al (28) sýndu fram á að TGF-1 jók IgA tjáningu með því að hækka umritunarþáttinn Ets-1 í þekjukrabbameinsfrumum. Þessi rannsókn sýndi fram á að TGF-1 stýrði IgG tjáningu í HK-2 frumum. Í ljósi þess að aðeins IgG greindist í HK-2 frumum var tilgáta sett fram að TGF-1 valdi IgG tjáningu óháð Ig flokkaskiptum. Stýrikerfi IgG framleiðslu með TGF-1 þarfnast frekari rannsóknar.

PTECs gegna mikilvægu hlutverki í pípulaga millivefjatrefjun í gegnum EMT og TGF-1 virkar sem meistaramiðlari. Í þessari rannsókn jók viðbót TGF-1 við ræktaðar HK-2 frumur IgG tjáningu, sem gefur til kynna að HK-2-afleitt IgG gæti tengst EMT á jákvæðan hátt. Fyrri rannsóknir hafa greint frá því að krabbamein-IgG hafi verið tengt meinvörpum og stuðlað að EMT með því að minnka E-cadherin í munnvatnskirtilsblöðrukrabbameini (29) og lungnakrabbameini (30). Það er þess virði að kanna hvort PTEC-afleitt IgG geti þjónað hlutverki við EMT í nýrnapíplum og millivefsvefjamyndun við sjúkdómsástand, svo sem blóðþurrð/endurflæðisskaða eðalangvinnan nýrnasjúkdóm.

Að lokum, eftir því sem við best vitum, var þessi rannsókn sú fyrsta til að sýna fram á að PTEC getur tjáð og seytt IgG og TGF-1 getur aukið IgG tjáningu í HK-2 frumum. Hins vegar krefst hugsanlegs hlutverks PTEC-afleiddu IgG í tubulointerstitial fibrosis frekari rannsókna.

Áhrif cistanche: gagnast nýru

Fjármögnun

Þessi rannsókn var studd af styrkjum frá National Natural Science Foundation of China (styrk nr. 82070736, 91642109 og 81870488), Hainan Natural Science Foundation (styrkur nr. 819QN355), Hainan Medical University Scientific Research Cultivation Foundation (styrk nr. HYPY201926), og helstu stuðningsverkefni National Natural Science Foundation Major Research Program (styrkur nr. 91642206).

Aðgengi gagna og efnis

Gagnasöfnin sem notuð eru og/eða greind í yfirstandandi rannsókn eru fáanleg hjá samsvarandi höfundi ef sanngjarnt er óskað.

Framlag höfunda

Sem samsvarandi höfundar, YW og XQ hugsuðu og hönnuðu rannsóknina. ZD tók þátt í rannsóknarhönnuninni, framkvæmdi vefjafræðilegar tilraunir og einfrumutilraunir, útbjó sýni fyrir massagreiningu, greindi gögn og skrifaði handritið. ZJ tók þátt í rannsóknarhönnuninni, flestum tilraunum varðandi IgG tjáningu í HK-2 frumum og viðeigandi gagnagreiningu. YG, JM, HD og YL gerðu frumulínutilraunir að hluta. ZC og YP völdu viðeigandi tilvik fyrir einfrumutilraunir í samræmi við klíníska eiginleika. HY og ZS tóku þátt í einfrumutilraunum. SW tók þátt í ónæmisvefjaefnafræðilegri litun, greindi gögn um litun á vefjum og samdi og endurskoðaði handritið. YW, ZD og ZJ staðfestu áreiðanleika allra hrágagnanna. Allir höfundar fóru yfir handritið og endurskoðuðu gögnin. Allir höfundar lásu og samþykktu lokahandritið.

Siðfræðisamþykki og samþykki til þátttöku

Þessi rannsókn var í samræmi við meginreglur Helsinki-yfirlýsingarinnar og var samþykkt af læknasiðanefnd þriðja háskólasjúkrahússins í Peking (samþykki nr. S2020121) og framkvæmd í samræmi við bókunina. Allir gjafar gáfu nýrnaberki af sjálfsdáðum og veittu skriflegt upplýst samþykki áður en þeir gáfu nýrnaberki til rannsóknarinnar. Allar aðferðir voru framkvæmdar í samræmi við viðeigandi leiðbeiningar og reglugerðir. Þessi sýni voru algjörlega nafnlaus. Mannssermi og PBMC, sem notuð voru sem jákvæð viðmið í western blotting eða öfugumritun-PCR í þessari rannsókn, voru fengin úr blóði heilbrigðs sjálfboðaliða, sem veitti skriflegt upplýst samþykki fyrir sýnatöku.

Áhrif cistanche: gagnast nýru

Heimildir

1. Schlondorff DO: Yfirlit yfir þætti sem stuðla að meinafræði versnandi nýrnasjúkdóms. Nýra Int 74: 860-866, 2008.

2. Donadio ME, Loiacono E, Peruzzi L, Amore A, Camilla R, Chile F, Vergano L, Boido A, Corrieri M, Bianciotto M,et al: Tolllíkir viðtakar, ónæmispróteasóm og stjórnandi T frumur hjá börnum með Henoch-Schonlein purpura og frumkvilla IgA nýrnakvilla. Pediatr Nephrol 29: 1545-1551, 2014.

3. Breda PC, Wiech T, Meyer-Schwesinger C, Grahammer F, Huber T, Panzer U, Tiegs G og Neumann K: Nýrnapípulaga þekjufrumur í nýrum hafa ónæmisbælandi virkni með því að knýja fram bólgusvörun CD4 plús T frumu. Am J Physiol Renal Physiol 317: F77-F89, 2019.

4. Liu BC, Tang TT, Lv LL og Lan HY: Nýrnapípluskaðar: Drifkraftur í átt að langvinnum nýrnasjúkdómum. Nýra Int 93: 568-579, 2018.

5. Kobayashi N, Suzuki Y, Tsuge T, Okumura K, Ra C og Tomino Y: FcRn-miðluð transcytosis af immúnóglóbúlíni G í nærliggjandi pípulaga þekjufrumum úr mönnum. Am J Physiol Renal Physiol 282: F358-F365, 2002.

6. Qiu X, Zhu X, Zhang L, Mao Y, Zhang J, Hao P, Li G, Lv P, Li Z, Sun X,et al: Þekjukrabbamein í mönnum seyta immúnóglóbúlíni g með óþekkt sérhæfni til að stuðla að vexti og lifun æxlisfrumna. Cancer Res 63: 6488-6495, 2003.

7. Zheng J, Huang J, Mao Y, Liu S, Sun X, Zhu X, Ma T, Zhang L, Ji J, Zhang Y,et al: Umrit af immúnóglóbúlíngenum hafa sérstaka VHDJH endurröðunareiginleika í þekjukrabbameinsfrumum manna. J Biol Chem 284: 13610-13619, 2009.

8. Jiang D, Ge J, Liao Q, Ma J, Liu Y, Huang J, Wang C, Xu W, Zheng J, Shao W,et al: IgG og IgA með hugsanlega örverubindandi virkni eru tjáð af eðlilegum húðþekjufrumum manna. Int J Mol Sci 16: 2574-2590, 2015.

9. Zhu Z, Zhang M, Shao W, Wang P, Gong X, Ma J, Qiu X og Wang B: Immunoglobulin M, ný sameind af hjartavöðvafrumum músa. Int J Biochem Cell Biol 88: 172-180, 2017.

10. Niu N, Zhang J, Sun Y, Wang S, Sun Y, Korteweg C, Gao W og Gu J: Tjáning og dreifing á immúnóglóbúlíni G og viðtökum þess á stað með ónæmisréttum: Augað. Cell Mol Life Sci 68: 2481-2492, 2011.

11. Huang J, Sun X, Mao Y, Zhu X, Zhang P, Zhang L, Du J og Qiu XY: Tjáning immúnóglóbúlíngena með klassískri V-(D)-J endurröðun í taugafrumum í heila músa. Int J Biochem Cell Biol 40: 1604-1615, 2008.

12. Niu N, Zhang J, Guo Y, Zhao Y, Korteweg C og Gu J: Tjáning og dreifing á immúnóglóbúlíni G og viðtökum þess í taugakerfi mannsins. Int J Biochem Cell Biol 43: 556-563, 2011.

13. Li J, Korteweg C, Qiu Y, Luo J, Chen Z, Huang G, Li W og Gu J: Tvö öfgafræðileg dreifingarmynstur immúnóglóbúlíns G í fylgju manna og virkni áhrif. Biol Reprod 91: 128, 2014.

14. Huang J, Zhang L, Ma T, Zhang P og Qiu X: Tjáning á immúnóglóbúlíngeni með klassískri V-(D)-J endurröðun í eistum og epididymis músa. J Histochem Cytochem 57: 339-349, 2009.

15. Tang J, Zhang J, Liu Y, Liao Q, Huang J, Geng Z, Xu W, Sheng Z, Lee G, Zhang Y,et al: Flöguþekjukrabbameinsfrumur í lungum tjá ekki kanónískt glýkósýlerað IgG sem virkjar integrin-FAK boð. Cancer Lett 430: 148-159, 2018.

16. Cui M, You L, Zheng B, Huang X, Liu QF, Huang J, Pan B, Qiu X, Liao Q og Zhao Y: Mikil tjáning á glýkósýleruðu immúnóglóbúlíni G af krabbameini spáir fyrir um slæmar horfur í kirtilkrabbameini í brisi. J Cancer 11: 2213-2221, 2020

17. Cui M, Hu Y, Zheng B, Zhang S, Zhang X, Wang M, Qiu XY, Liao Q og Zhao YP: Krabbameinsúrleitt immúnóglóbúlín G: Nýtt merki fyrir mismunagreiningu og spá um bakslag í kalkkirtilskrabbameini. Clin Endocrinol (Oxf) 92: 461-467, 2020.

18. Deng H, Ma J, Jing Z, Deng Z, Liang Y, AL, Liu Y, Qiu X og Wang Y: Tjáning immúnóglóbúlíns A í mesangial frumum manna og áhrif þess á frumufrumu og viðloðun. Mol Med Rep 17: 5272-5282, 2018.

19. Jing Z, Deng H, Ma J, Guo Y, Liang Y, Wu R, AL, Geng Z, Qiu X og Wang Y: Tjáning á immúnóglóbúlíni G í fræfrumum manna og hlutverk þess í lífvænleika og viðloðun frumna. Int J Mol Med 41: 3296-3306, 2018.

20. Van der Hauwaert C, Savary G, Gnemmi V, Glowacki F, Pottier N, Bouillez A, Maboudou P, Zini L, Leroy X, Cauffiez C,et al: Einangrun og lýsing á frumulíkani af nærliggjandi pípulaga þekjufrumum úr mannsnýrum með CD10/CD13 tvöföldum merkingum. PLoS One 8: e66750, 2013.