Estrógenvirkni glýkósíða frá Cistanche Deserticola sem estrógenviðtaka hjálparefni in vitro

KYNNING

Cistanche deserticola("Rou Cong Rong" á kínversku), hefðbundið kínverskt jurtalyf sem fyrst var skráð íShenNongBenCaoJing, hefur verið notað til að meðhöndla nýrnaskort, getuleysi, hægðatregðu í öldrun og blóðskorti í þúsundir ára.[1] Það er aðallega dreift í eyðimerkursvæðum í Norðvestur-Kína, eins og Gansu og Xinjiang.[2]Nútíma lyfjafræðirannsóknir sýndu fram á að C. deserticola getur stuðlað að víðtækri lyfjavirkni, svo sem hormónastjórnun, ónæmisstýrandi, andoxunarlyf, taugaverndandi, bólgueyðandi ogestrógenvirkni.[3,4] Glýkósíð frá Cistanches(GCs) voru talin einn af helstu virku efnisþáttunum með ýmis líffræðileg áhrif.

Estrógenviðtakar (ERs) og ER eru undirgerðir ER sem gætu stjórnað lífeðlisfræðilegri starfsemi.[7] Þessi prótein gætu stjórnað umritun markgena með því að bindast tengdum DNA-stýringarröðum í frumukjarna. Báðar undirgerðirnar koma greinilega fram í hjarta- og æðakerfi og miðtaugakerfi.[8,9] ER er aðallega til í mjólkurkirtlum, legi, eggjastokkum, beinum, karlkyns æxlunarfærum og blöðruhálskirtli. ER er aðallega til staðar í blöðruhálskirtli, eggjastokkum og þvagblöðru.[10,11] Þar að auki eru nokkur algeng lífeðlisfræðileg hlutverk fyrir þessar tvær undirgerðir, svo sem í þróun og starfsemi eggjastokka og verndun hjarta- og æðakerfisins.[ 12,13] Fyrri rannsóknir í hópnum okkar leiddu í ljós estrógenlíkan aðferð GCs með efnaskiptagreiningaraðferðinni.[14] Í samfelldri rannsókn greindum við gangverk estrógenvirkni GCs á MCF-7 frumulínum sem tengjast ER.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA TIL BÆTTAESTROGENIC virkniPHGS75% ECH 30% ACT 12%

EFNI OG AÐFERÐIR

Hljóðfæri

ECO-170P-230 útungunarvélin var frá New Brunswick Scientific (China) Co., Ltd., Bio-Rad 680 örplötulesarinn og rafskautatækin voru frá Bio-Rad Laboratories, Inc., CX21 smásjáin var frá Olympus Co., Ltd., GIS-2019 hlaupmyndakerfi var frá Tanon Science and Technology Co., Ltd., flatbotnplatan var frá Corning Inc., EPICS-XL flæðifrumumæling var frá Beckman-Coulter Inc. og StepOnePlus Real-Time pólýmerasa keðjuverkun ( PCR) kerfið var frá Thermo Fisher Scientific.

Efni og hvarfefni

GCs voru útbúin á rannsóknarstofu okkar eins og aðferðin sem áður var greint frá, [14] og hreinleiki GCs var ákvarðaður vera 52% (akteósíð var notað sem merki til að ákvarða GCs) með útfjólubláum litrófsmælingu. Estradíól (E2) var keypt frá Yuanye Biotechnology Co., Ltd. (Shanghai, Kína). Fóstursermi (FBS) og RPMI-1640 voru frá Gibco Co., Ltd., 96-brunn flatbotnplata var frá Corning Inc., og dímetýlsúlfoxíð (DMSO) og 3-[4,5-dímetýl-2-þíasólýl ]‑2,5‑dífenýltetrasólíumbrómíð (MTT) var keypt frá Sigma-Aldrich Corporation. TRIzol hvarfefni, Reverse Transcription (RT) Kit og TB Green™ RT-PCR Kit voru keypt frá TaKaRa Co., Ltd., Dalian, Kína. Anti-ER Rabbit pAb, anti-ER Rabbit pAb og -actin mótefni voru keypt frá Wanlei Biotechnology Co., Ltd. Öll önnur algeng efni voru keypt frá stöðluðum viðskiptabirgðum.

Undirbúningur sýnis

Undirbúningur glýkósíða af Cistanches stofnlausn

GC útdráttur var leystur upp í DMSO til að búa til stofnlausn með styrkleika 0.1051 g/ml og geymdur við 4 gráður. Fenólrautt RPMI-1640 var notað til að þynna stofnlausnina í mismunandi styrki fyrir notkun.

Undirbúningur estradíól stofnlausnar

E2 útdráttur var leystur upp í DMSO til að búa til stofnlausn með styrkleika 0,27 mg/ml og geymdur við 4 gráður. Fenólrautt RPMI-1640 var notað til að þynna stofnlausnina í mismunandi styrki fyrir notkun.

Undirbúningur á koldextranmeðhöndluðu sermi úr nautgripafóstri

Hundrað millilítrum af FBS var blandað saman við 250 mg af virku koladufti og 25 mg af dextrani. Eftir ræktun í 45 mínútur við 55 gráður var blandan skilin í skilvindu við 4 gráður, 1000 rpm í 15 mínútur. Fljótandi vökvinn var síaður með Millipore Express PES himnu til að fá koldoxtran-meðhöndlaða (CDT)-FBS og geymt við -20 gráður.

Frumuræktun

MCF-7 frumulínur úr brjóstakrabbameini í mönnum voru fengnar úr American Type culture Collection (ATCC). Þar að auki voru frumurnar ræktaðar með RPMI-1640 miðli sem innihélt 10% FBS og 1% penicillín-streptomycin við 37 gráður undir rakaðri 5% CO2 andrúmslofti. Frumur voru ræktaðar í fenólrauðu RPMI-1640 miðlinum sem innihélt 5% CDT-FBS 4 dögum fyrir MTT prófun svo hægt væri að hreinsa estrógenið í frumunum.

Frumufjölgunargreining á estradíóli á MCF-7 frumulínum

Frumufjölgun var mæld með MTT prófun fyrir MCF-7 frumur.[15,16] E2 var leyst upp í RPMI-1640 ræktunarmiðli sem innihélt 0.1% DMSO í lokastyrk {{27 }}.1, 1, 10, 100 og 1000 nM. MCF-7 frumulínur voru ræktaðar í fenólrauðum RPMI-1640 miðli í 4 daga. Eftir þvott með fosfat-bufferuðu saltvatni (PBS) þrisvar sinnum var 100 µL af FBS-fríu RPMI-1640 miðli bætt í 96 brunna plötur með 1,5 × 104 í hverri brunn og ræktað við 37 gráður í 24 klst. Í kjölfarið voru frumurnar meðhöndlaðar með ýmsum styrkjum af E2 lausninni í 72 klst. Síðan var 100 µL af MTT lausn (0,5 mg/ml) bætt í hvern brunn. Frumur voru ræktaðar í 4 klst. Að lokum var 150 µL af DMSO bætt við til að leysa upp formazan kristallana. Gleypið var mælt við 570 nm með örplötulesara og útbreiðsluhraði (PR) var reiknaður út.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA TIL AÐ BÆTTA KYNFERÐ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Frumufjölgunargreining á glýkósíðum af Cistanches á MCF-7 frumulínum

Frumufjölgun var mæld með MTT prófun fyrir MCF-7 frumur. GCs voru leyst upp í RPMI-1640 ræktunarmiðlum sem innihéldu 0,1% DMSO í lokastyrknum 0.0175, 0,175, 1,75, 17,5 og 175 µg /ml. MCF-7 frumulínur voru ræktaðar í fenólrautt RPMI-1640 miðli sem innihélt 5% CDT-FBS í 4 daga. Eftir þvott með PBS þrisvar sinnum var 100 µL af FBS-fríu RPMI-1640 miðli bætt í 96 brunna plötur með 1,5 × 104 í hverri brunn og ræktað við 37 gráður í 24 klst. Í kjölfarið voru frumurnar meðhöndlaðar með ýmsum styrkjum af GCs lausninni í 24, 48 og 72 klst. Síðan var 100 µL af MTT lausn (0,5 mg/ml) bætt í hvern brunn. Frumur voru ræktaðar í 4 klst. Að lokum var 150 µL af DMSO bætt við til að leysa upp formazan kristallana. Gleypið var mælt við 570 nm með örplötulesara og PR reiknað út. Fenólrautt RPMI-1640 og miðill sem inniheldur E2 (2,725 × 10−3 µg/ml) voru neikvæði og jákvæði hópurinn, í sömu röð.

Frumufjölgunargreining á glýkósíðum af Cistanches með fulvestrant á MCF-7 frumulínum

Frumufjölgun var mæld með MTT prófun fyrir MCF-7 frumur. GCs voru leyst upp í RPMI-1640 ræktunarmiðlum sem innihéldu 0,1% DMSO í lokastyrk 1,75, 17,5 og 175 µg/ml. MCF-7 frumulínur voru ræktaðar í fenólrautt RPMI-1640 miðli sem innihélt 5% CDT-FBS í 4 daga. Eftir þvott með PBS þrisvar sinnum var 100 µL af FBS-fríu RPMI-1640 miðli bætt í 96 brunna plötur með 1,5 × 104 í hverri brunn og ræktað við 37 gráður í 24 klst. Í kjölfarið voru frumurnar meðhöndlaðar með ýmsum styrkjum af GCs lausninni og ræktaðar með fulvestrant (6,06 × 10-5 µg/ml) í 48 klst. Síðan var 100 µL af MTT lausn (0,5 mg/ml) bætt í hvern brunn. Frumur voru ræktaðar í 4 klst. Að lokum var 150 µL af DMSO bætt við til að leysa upp formazan kristallana. Gleypið var mælt við 570 nm með örplötulesara og PR reiknað út. Fenólrautt RPMI-1640 og miðill sem inniheldur E2 (2,725 × 10−3 µg/ml) voru neikvæði og jákvæði hópurinn, í sömu röð.

Frumuhringsprófun

GCs voru leyst upp í RPMI‑1640 ræktunarmiðlum sem innihéldu 0,1% DMSO í lokastyrk 1,75, 17,5 og 175 µg/ml. MCF-7-frumulínur voru ræktaðar í fenólrauðu fríu RPMI-1640 miðli sem innihélt 5% CDT-FBS í 4 daga. Eftir þvott með PBS þrisvar sinnum var 1 ml af FBS-fríu RPMI-1640 miðli bætt í 6-brunn plötur með 2,5 × 105 í hverri brunn og ræktað við 37 gráður í 24 klst. Í kjölfarið voru frumurnar meðhöndlaðar með ýmsum styrkjum af GCs lausninni og ræktaðar með fulvestrant (6,06 × 10-5 µg/ml) í 48 klst. Í kjölfarið var frumunum safnað saman og þvegið með PBS þrisvar sinnum, skilið í skilvindu við 4 gráður, 1000 rpm í 10 mínútur og festar með 70% etanóli við -20 gráður, yfir nótt. Eftir þvott með PBS tvisvar voru frumurnar litaðar með PI lausn (50 mg/ml) sem innihélt 1 mg/ml af RNase A og 0,1% Triton X-100 í 30 mínútur í myrkri við 4 gráður. Frumuhringurinn var greindur með flæðifrumumælingu og útbreiðslustuðullinn (PI) var reiknaður út sem hér segir. Fenólrautt RPMI-1640 og miðill sem inniheldur E2 (2,725 × 10−3 µg/ml) voru neikvæði og jákvæði hópurinn, í sömu röð.

PI {{0}} (S + G2 M)/(G0 /G1  + S + G2 M) × 100%

RNA einangrun og rauntíma megindleg pólýmerasa keðjuverkunargreining

Til að mæla magn mRNA var RT-megindleg PCR (qPCR) próf notuð. Heildar frumu-RNA var dregið út með TRIzol hvarfefni. Fyrir qPCR var RNA öfugt umritað í cDNA úr 4 µg af heildar RNA með því að nota RT sett. RT-PCR greiningar voru gerðar með því að nota TB Green™ RT-PCR Kit. Allar samskiptareglur voru framkvæmdar samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. Grunnparið sem notað var til mögnunar á ER var 5'-GGGAAGTATGCTATGGAATCTG-3' (áfram) og 5'-TGGCTGGACACATATAGTCGTT-3' (aftur); grunnparið sem notað var til mögnunar á ER var 5'-AGTGCCGCTCTTGGAGAGCTG-3' (áfram) og 5'-CCTGGGTCGCTGTGACCAGA-3' (aftur). PCR-skilyrði fyrir ER og ER voru 94 gráður í 3 mínútur og fylgt eftir af 37 og 40 lotum, í sömu röð, 94 gráður í 30 s, 58 gráður í 2 mínútur og 72 gráður í 2 mínútur. Grunnparið sem notað var til mögnunar á GAPDH var 5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3' (áfram) og 5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3' (aftur). PCR skilyrðin fyrir GAPDH voru 94 gráður í 3 mínútur, fylgt eftir af 30 lotum af 94 gráðum í 30 s, 58 gráður í 2 mínútur og 72 gráður í 2 mínútur. Í hvert skipti sem RT-qPCR tilraun var endurtekin oftar en tvisvar. Til þess var GAPDH notað sem innra eftirlit. Hlutfallsleg genatjáning ER /ER transfectants um samanburðarfrumur var reiknuð: 2−(∆∆Ct).

Western blotting

Tjáning ER og ER próteina var greind með Western blot greiningu sem tilkynnt aðferð með minniháttar breytingum. Í stuttu máli voru MCF-7 frumurnar ræktaðar í 6-brunn plötum með 2,5 × 105 frumum í hverri brunn og meðhöndlaðar með GCs í lokastyrknum 1,75, 17,5 og 175 µg/ml í 48 klst. Eftir ræktun voru heilfrumuútdrættirnir útbúnir með því að nota RIPA jafnalausn sem innihélt 1 mM PMSF. Prótein í heilfrumuútdrættinum voru aðskilin með 12% natríumdódecýlsúlfat-pólýakrýlamíð hlaup rafdrætti og síðan flutt yfir í pólývínýlíden tvíflúoríð himnur. Himnan var stífluð með 5% (w/v) undanrennu sem var leyst upp í TBST stuðpúða og ræktuð með frum- og aukamótefnum til skiptis. Tengd mótefni sáust.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA TIL BÆTTAESTROGENIC virkniPHGS75% ECH 30% ACT 12%

tölfræðigreining

Niðurstöðurnar voru gefnar upp sem meðaltal og staðalfrávik og tölfræðileg marktekt var gerð með því að nota Student's t-test með SPSS 21.0 hugbúnaði (IBM Co., Ltd. America). P<0.05 was considered statistically significant. 

NIÐURSTÖÐUR

Eftir 24 klst af E2 meðferð var fjölgun MCF-7 frumna aukin [Mynd 1a]. 10nM af E2 lausn gæti örvað vöxt frumanna augljóslega (123,89%). Hins vegar, með aukningu á styrk E2, veiktist frumufjölgunargetan. Þess vegna var 10nM ákjósanlegur styrkur E2 í þessari tilraun. GCs hópur í styrknum 1,75, 17,5 og 175 µg/mg gæti aukið fjölgun MCF-7 frumulína á tíma- og skammtaháðan hátt og sýndi marktækan mun á neikvæðum hópi [Mynd 1b]. Í samanburði við neikvæða hópinn sýndi E2 hópurinn augljósa fjölgun (120,06%). Samsettur lyfjahópur (CMG) (fulvestrant með E2 eða GCs) í CDT-FBS miðli var ræktaður með MCF-4 frumum. Eftir 72 klst

ræktun, gæti CMG leitt til halla PR samanborið við einstaka lyfjahópinn (IMG) (P< 0.01) [Figure 1c]. Flow cytometry analysis showed that GCs could slightly increase the PI value suggesting that GCs could advance G0/G1 phase cells to S and G2/M phase [Figure 2 and Table 1] and promote cell DNA synthesis. The result indicated that the mechanism of GCs on MCF‑7 was similar to that of E2. In CMG  (fulvestrant with GCs), the PI value of cell PI declined to that of IMG slightly (P < 0.05). RT‑PCR analysis indicated that the expressions of ERα and ERβ mRNA were increased compared with the control group  (P  <  0.01) in a dose‑dependent manner after being treated with different concentrations of GCs for 48 h [Figure 3a and b]. Western blot result indicating that after treatment with various concentrations of GCs for 48  h, contents of ERα and ERβ proteins in MCF‑7 increase with the GCs increased in a dosage‑dependent manner [Figure 3c‑e]. 

NIÐURSTAÐA

Í þessari rannsókn voru áhrif GCs á útbreiðslu og frumuhring MCF-7 mæld með aðferð MTT og flæðifrumumælingar, í sömu röð.GCs gætu aukið útbreiðslu MCF-7 frumnavið styrkleikann 1,75, 17,5 og 175 µg/ml eftir ræktun í 72 klst. Hins vegar hefur aukningin tilhneigingu til að hægja á sér þegar CC og fulvestrant eru notuð saman. GCs gætu aukið PI gildi MCF-7 frumna, minnkað frumuna í G1 fasanum og aukið frumurnar í S og G2 fasa.

Fulvestrant er ER-sértækur mótlyfi, sem hindrar kjarnastaðsetningu ER með því að skerða viðtakadimerization og orkuháðan kjarnaflutning.[17] Í þessari rannsókn hefur niðurstaða staðfest að fulvestrant getur veikt útbreiðslu GCs á MCF-7 frumum, og það gæti haft áhrif á frumuhringbreytingu. Þess vegna gaf þessi rannsókn til kynna estrógenvirkni GCs, og einnig er ER

skotmark GCs. Í RT-PCR og western blot tilrauninni jókst mRNA og prótein tjáning ER og ER í MCF-7 frumum með aukningu á GC styrk. Þess vegna,GCs geta gegnt hlutverki í estrógenvirknisamkvæmt uppstýrðu mRNA og próteinum ER og ER.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA TIL BÆTTAESTROGENIC virkniPHGS75% ECH 30% ACT 12%