Áhrif Cistanche Tubulosa útdráttar á æxlun karlkyns hjá streptósótósín-níkótínamíði völdum sykursýkisrottum

Leitarorð:sykursýki; ófrjósemi;Cistanche tubulosaútdráttur(CTE);echinacoside(ECH);bólgueyðandivirkni;andoxunarefnivirkni;steramyndunáhrifum

Fyrir frekari upplýsingar um kosti cistanche extract dufts

1. Inngangur

Sykursýki (DM) er ástand þar sem glúkósa í blóði hækkartil óhagkvæmni brissins til að framleiða nóg insúlín, eða vanhæfni líkamans til að nota þaðá áhrifaríkan hátt. Samkvæmt WHO fjölgaði sykursýki úr 108 milljónum árið 1980í 422 milljónir árið 2014 [1]. Það eru fjórir meginflokkar: fyrir sykursýki (stig fyrir sykursýki), tegund 1(þar sem brisið nær ekki að framleiða insúlín), tegund 2 (líkaminn notar ekki insúlín) og meðgöngusykursýki (sem kemur fram á meðgöngu). Oxunarálag á sér stað vegna ójafnvægis á milliframleiðsla hvarfgjarnra súrefnistegunda (ROS) og andoxunarefna [2] leiðir að lokum til sykursýkisástandsins.Fylgikvillar sykursýki eru meðal annars bilun í nýrum, taugaskemmdir, blindu, heilablóðfall, hjartaárás, fósturdauða og ófrjósemi. [1]. Rannsóknir sýna að sæðiskjarnar, deoxýríbónsýru (DNA),og hvatberar voru verulega skemmdir hjá karlkyns sykursýkissjúklingum [3]. Oxunarálag á meðanflutningur sæðis mun breyta ferli karlkyns æxlunarkerfis [4,5]. 

Ferlið við sæðismyndun er stjórnað af undirstúku-heiladingul-kynkirtli (HPG)ás. Gonadótrópín-losandi hormónið (GnRH) framleitt af undirstúku örvarframleiðsla gulbúsörvandi hormóns (LH) og eggbúsörvandi hormóns (FSH). Leydig frumur finnastvið hlið sáðpíplanna og framleiða testósterón undir stjórn LH. FSH kveikirframleiðsla mótefnavakabindandi próteins (ABP) sem hjálpar til við að losna við karlhormónið. Þannig ófrjósemiog önnur vandamál koma aðallega upp vegna truflana sem verða á HPG ásnum. Stjórnun ásamsetning streptósótósíns og nikótínamíðs veldur sykursýki hjá tilraunarottum. Streptósótósíner efnasamband sem er eitrað fyrir insúlínframleiðandi frumur í brisi og nikótínamíð er avatnsleysanlegt vítamín sem verndar frumur frá algjörum skemmdum [6]. Cistanche tubulosaer eyðimerkurplöntutegund einnig þekkt sem "Rou Cong-Rong" [7]. Það ersníkjudýr sem ekki er klórófyll sem vex aðallega á rótinniCalotropis proceratré og ervíða í þurru landi Gansu, Qinghai, Xinjiang, Mongólíu, Íran og Indlandi. Hið sameiginleganafn áCistanche tubulosaer "Desert Hyacinth". Það er almennt viðurkennt í kínverskri hefðbundinni læknisfræðiog hefur hlotið nafnið "Ginseng of the Desert". Það er mikið notað á lækningasviði tilmeðhöndla sjúklega hvítabólgu, mikla mæling, langvinna nýrnasjúkdóma, hægðatregðu, getuleysi ogófrjósemi. Efnafræðilegir þættir íCistanche tubulosasamanstanda af óstöðugum fenýletanóíð glýkósíðum(PHG), iridoids, lignans, rokgjarnar olíur, alditols, oligosaccharides, and polysaccharides [8]. Námsýna að echinacoside frá þessari jurt verndar skemmdu vefjafrumur með því að stjórna ROS gildum [9]. Þetta efnasamband framleiðir andoxunarefni, æðaslökun og bólgueyðandi virkni ásamttaugavörn og forvarnir gegn beinþynningu [10,11]. Þessari rannsókn var ætlað að kanna áhrif afCistanche tubulosaútdráttursem inniheldur ECH átruflun á æxlun á streptósótósín-níkótínamíð-völdum sykursýkisrottum.

2. Efni og aðferðir

2.1. Efni

ECH og CTE voru keypt frá Sinphar Pharmaceutical Co., Ltd (Yilan, Taívan). Ítarlegriglycation endproducts (AGEs) voru keyptar frá Biovision (San Francisco, CA, Bandaríkjunum). LC-540og TM3 frumulínur voru keyptar frá Rannsókna- og þróunarstofnun matvælaiðnaðarins(Hsinchu, Taívan). Fimm vikna gamlar Sprague-Dawley (SD) karlkyns rottur voru keyptar fráNational Laboratory Animal Center (Taipei, Taívan). Feed Lab mataræði® var keypt af PMINutrition International, Inc. (Taipei, Taívan). 2,2-dífenýl-1-píkrýlhýdrasýl (DPPH) fékkstfrá Sigma (St. Louis, MO, Bandaríkjunum). Metanól og 4-(2-hýdroxýetýl)-1-píperasínetansúlfónEinnig var keypt sýra (HEPES) frá Sigma. Dulbecco's breyttur Eagle medium/F12 ogtrypsín-EDTA voru fengin frá GIBCO (New York, NY, Bandaríkjunum). 3-(4, 5-dímetýlþíasól-2-ýl)-2,5-dífenýltetrasólíumbrómíð (MTT), díklóró-díhýdró-flflúoresceín díasetat (DCFH-DA), dímetýlsúlfoxíð (DMSO) og nítróblátt tetrasólíum (NBT) voru keypt frá Sigma. Glúkósa ensímsett voru fengin frá Kyokutoseiyaku, Tokyo, Japan. Keypt voru insúlín ELISA settfrá Mercodia AB Inc., Sylveniusgatan 8A (Uppsala, Svíþjóð). T-PER vefjapróteinútdrátturHvarfefni var keypt frá Thermo Scientific (Chicago, IL, Bandaríkjunum). Kjarnorkuvopn gegn mönnum/mús/rottumfactor-kappa B NF-κB fjölstofna mótefni voru keypt frá Santa Cruz Biotechnology, SantaCruz, CA, Bandaríkin And-mús/rottuviðtaki fyrir háþróaða glýkingarendaafurðir (RAGE) fjölstofnamótefni, StAR fjölstofna mótefni gegn mönnum/mús/rottum og gegn mönnum/mús/rottumCytochrome P450 17A1 einstofna mótefni voru keypt frá Gene Tex (Irvine, CA, Bandaríkjunum).CYP11A1 fjölstofna mótefni gegn mönnum/mús/rottum voru fengin úr frumumerkjumTækni (Beverly, PA, Bandaríkin). Easy-Blue hvarfefnið var keypt frá Invitrogen, Thermo FisherScientific (Carlsbad, CA, Bandaríkin). Agarósa og DNA merki 100 bp voru fengin frá Promega,Corporation (Madison, WI, Bandaríkjunum). RNeasy Lipid Tissue Mini Kit var keypt frá QIAGEN,Hilden, Þýskalandi.

5 prósent CO2 útungunarvél (CO2 útungunarvél, Napco 5410, Taívan). TM3 frumulínan var ræktuð í Dulbecco'sbreytt Eagle medium (DMEM) ásamt glúkósa (4,5 g/L), natríum pýruvati (0,5 mM),L-glútamín (2,5 mM), natríumbíkarbónat (1,2 g/L), 4-(2-hýdroxýetýl)-1-píperasínetansúlfónsýrusýru (HEPES, 15 mM), og fósturkálfasermi (FCS, 10 prósent) eða hrossasermi (5 prósent) við 37◦C í 5 prósentumCO2 útungunarvél.

Ákvörðun á frumulífvænleika Echinacoside (ECH): 3-(4, 5-dímetýlþíasól-2-ýl)-2,5-dífenýltetrasólíumbrómíð (MTT) hvarfefni var notað til að prófa frumulífvænleika. Frumustyrkurinnvar breytt í 2× 105frumur / ml í 96-brunnsplötu. Síðan, 20µL af ECH (þynnt í 2 prósent af miðli)var bætt við og ræktað í 24 klst við 37◦C í 5 prósent CO2 útungunarvél. Síðar, 100µL af MTT hvarfefni varbætt við og ræktað í 4 klst við 37◦C við dimmu aðstæður. Gleypið var mælt við 570 nm(ELISA lesandi, Dynatech MR5000, Kloten, Sviss).Hlutfallsleg lífvænleiki frumna ( prósent )=[(Asýni við 570 nm− Aautt við 570 nm)]/[(Aeftirlit í 570− Aautt í 570)] × 100.

Greining á innihaldi hvarfefna súrefnistegunda (ROS):

Hólfnúmerið var stillt til2 × 105frumur/mlí 12-brunnsplötu sem inniheldur 2 prósent FBS. Þá, 50µL/mL af ECH, RES og AGEvar bætt við plötuna og ræktuð við 37◦C í 24 klst. Eftir 24 klst., 20 ,70 -díklórfluorescein-díasetat(DCFH-DA) var bætt við og ræktað við 37◦C í 30 mín. Eftir skilvindu (400× g, 5 mín.),

og AGE var bætt við og ræktuð við 37◦C í 5 prósent CO2 útungunarvél í 24 klst. Eftir, 400µL af T-PERvar bætt við, skafið af frumunum og skilið í skilvindu við 125,000× g í 20 mín (4◦C). Yfirvatniðvar safnað og geymt kl−80 ◦C (−80 ◦C frysti, Nuaire, Plymouth, MN, Bandaríkjunum) til frekari greiningar.

Bicinchoninic acid (BCA) setti var notað til að mæla magn próteina. Síðan, 10µL af staðlaðri frumulausnog 200µL af BCA hvarfefni var bætt við 8-brunnsplötur og ræktað við 37◦C í 5 prósent CO2 útungunarvélí 30 mín. Gleypið var mælt við 562 nm. Próteinauðkenningargreining var framkvæmdmeð natríumdódecýlsúlfat (SDS)-pólýakrýlamíð hlaupi (SDS-PAGE) rafdrætti. Sýnishorn voruútbúið með því að bæta próteinlýsati við próteinhleðslubuff og Western blot greining var framkvæmdtil að greina sérstök prótein.

2.2.2. In Vivo greining

Hönnun dýralíkana: Sextíu 4-vikugamlar Sprague–Dawley (SD) karlkyns rottur voru keyptar fráNational Laboratory Animal Center (Taipei, Taívan). Hver rotta var hýst fyrir sig í sótthreinsiefnibúr úr ryðfríu stáli við stjórnað hitastig (23± 1 ◦C) og rakastig (40–60 prósent) með 12 klstljós/12 klst myrkur hringrás. Matur og vatn var útvegað að vild. Hver rotta var tamuð í fyrstuviku og gefið nagdýrafæði 5001 á rannsóknarstofu sem aðalfæði. Allar aðferðir fylgdu staðlinumumönnunar- og notkunarnefndar dýrastofnana (IACUC samþykki nr. 101026) á landsvísuTaiwan Ocean University, Taívan. Eftir tamningu var rottum skipt í tvo hópa: viðmiðunarhópinnhópur (Con) sem var fóðraður með rannsóknarmataræði 5001 og sykursjúkahópurinn sem var fóðraður með fituríku mataræði(HFD, 40 prósent) fyrir alla tilraunina. Eftir að hafa verið fóðraður með HFD í 4 vikur, sykursýkishópurinnrottum var sprautað með streptósótósíni (65 mg/kg) (STZ) til að framkalla sykursýki (DM). Innan15 mín eftir inndælingu STZ var nikótínamíð (230 mg/kg líkamsþyngdar) sprautað. Viku eftir inndælingu,Glúkósaþolpróf til inntöku (OGTT) var framkvæmt til að ákvarða árangursríka örvun sykursýkiMellitus (DM). Eftir það var dýrunum skipt í sex hópa: viðmiðið (fóðrað með rannsóknarmataræði5001); DM hópur (DM plús 45 prósent HFD); DMR hópur (DM auk rósíglítazóns: 0,571 mg/kg líkamsþyngdar) auk 45 prósenta HFD;DME1 hópur (DM auk CTE: 80 mg/kg BW) auk 45 prósent HFD; DME2 hópur (DM auk CTE: 160 mg/kg líkamsþyngdar)auk 45 prósent HFD; og DME4 hópur (DM auk CTE: 320 mg/kg BW) auk 45 prósenta HFD. Rósiglítasón (RSG) vartekin sem jákvæða stjórnin. Þrír skammtar af CTE (80, 160 og 320 mg/kg) voru notaðir skv.tilmæli Taívan Food and Drug Administration (TFDA) heilsufæði virkamatsleiðbeiningar. Meðferð var gefin til loka tilraunarinnar. Allar tilraunarotturvar fórnað eftir 6 vikur. Blóðinu var safnað frá rottunum var skilið í skilvindu við 3000 rpm fyrir15 mín klukkan 4◦C. Yfirvatnið var skoðað með tilliti til eftirfarandi greiningar:Heildarglúkósa, þríglýseríð og kólesteról

Ákvörðun:

Glúkósaákvörðunin varframkvæmt með glúkósa ensímsettum. Síðan, 20µL af blóðvökvasýnum var bætt viðhvarfefni og haldið við 37◦C í 5 mín. Heildar þríglýseríð og heildarþéttni kólesteróls voruákvarðað með því að nota þríglýseríð og kólesteról ensímsett. Síðan, 10µL af blóðvökva vorubætt við hvarfefnin og tilraunin var gerð samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda.Gleypið var mælt við 510 nm.Heildarglúkósa/þríglýseríð/kólesteról í plasma (mg/dL)=(Asýnishorn− AAutt)/(Astaðall− AAutt) × 200. Sýnishorn: Frásog blóðsýna, AAutt: Gleypigildi setta án sýnis, staðall: Gleypigildi staðlaðs hvarfefnis, 200: staðlað hvarfefni í styrkleika á200 mg/dL.Mat á insúlíni, leptíni og hómóstatískum líkani – Insúlínþol (HOMA-IR) Ákvörðun:Insúlínmagnið var ákvarðað með insúlín ELISA settum. Hér, 25µL af blóðvökva var bætt viðhvarfefni og gleypni var mæld við 450 nm. Heildarmagn leptíns var ákvarðað með því að notaleptínensím ónæmismælingasett. Þá, 100µL af plasma var greint og gleypnivar mældur við 450 nm með ELISA lesanda. Öll tilraunin var gerð skvleiðbeiningum framleiðanda. HOMA-IR gildið var ákvarðað út frá homeostasis líkaninumatsjafna=Insúlínstyrkur fastandi í plasma (mU/mL)× fastandi glúkósa í plasmastyrkur (mmól/L)/22,5.Plasma Lipid Peroxidation: Hér var 0,5 ml af blóðvökva blandað saman við 1 ml af hvarfefni (15 prósent ,m/v tríklórediksýra í {{0}},25 N saltsýra (HCl) og 0,375 prósent ,w/v þíóbarbítúrsýra í0.25 N HCl) og sett í vatnsbað (Water Bath, BUCHI 461, Zürich, Sviss) við 100◦C fyrir15 mín. Eftir kælingu var 1 ml af n-bútanóli bætt við, hrist kröftuglega og skilið í skilvindu við 1500× g í 10 mín. Vökvanum var safnað saman og gleypni mæld við 532 nm [12]. Styrkur malondialdehýðs (MDA) (nM/mL)=[(sýnivið 532 nm− Atómt við 532 nm)/ (Staðallvið 532 nm− Atómt við 532 nm)] × 5. Ákvörðun á plasma testósteróni og gulbúshormóni (LH) gildum: TestósteróniðELISA sett var notað til að mæla magn testósteróns í blóðvökva. RIA Kit var notað tilákvarða LH styrkinn. Þá, 50µL af plasma var bætt við og útreikningarnir byggðirá styrk hormónsins LH-RP-3 (staðlað). Frekari skref voru framkvæmd skvað leiðbeiningum framleiðanda.Ákvörðun æxlisdrepsþáttar (TNF)- og Interleukin-6 (IL-6) Styrkur:Fanga mótefnið var þynnt 250 sinnum í húðunarjafna, bætt við 96-brunnsplötu (100µL/brunn),og haldið á 4◦C yfir nótt. Fljótandi vökvinn var sogaður og þveginn fimmtán sinnum með þvottibiðminni (1 sinni PBS, 0.05 prósent Tween 20). Eftir ræktun (1 klst) með 200µg af greiningarþynningarefni, frumurnar voruþvegið 5 sinnum með þvottabuffi og 100µL af TNF- staðallausn eða prófunarsýni vorubætt í hvern brunn og ræktað í 2 klst. Eftir þvott, 100µL af IL-6 greindum mótefnum var bætt viðog ræktað í 1 klst við stofuhita. Fljótandi vökvinn var sogaður og þveginn 5 sinnum. Þá,480 µL af ensíminu avidin-piparrótarperoxíðasa (HRP) var bætt við og ræktað í 30 mínútur í herbergihitastig. Yfirvatninu var sogað og þvegið fimm sinnum með þvottajafna. Þá, 100µL af hvarfefnislausn var bætt við og ræktað í 15 mínútur við stofuhita. Síðar, 50µL af stoppilausn (1M fosfórsýra) var bætt í hvern brunn og gleypni var mæld við 450 nm.Greining á færibreytum sæðis og eistnaSæðissýnissöfnun: Sæðissýnissöfnunin var framkvæmd samkvæmtaðferð sem áður var greint frá í [13]. Sæðinu var safnað úr flotinu og notað tilfrekari greiningu.Fjöldi sæðisfrumna, hreyfanleika sæðisfrumna og óeðlilegrar sæðisfruma: Fjöldi sæðisfrumna varreiknað út með því að nota blóðkornamæli og trypan bláa lausn. Þá, 100µL af sæðisvökva vorublandað með trypan bláu lausn og fjöldi sæðisfrumna, hreyfingar og óeðlilegra sæðisfrumna vorureiknað með blóðfrumnamæli og smásjá [14]. Nítróblátt Tetrazolium NBT minnkun og lípíðperoxun á sæði og eistum: Fituefniðperoxun og NBT minnkun voru greind samkvæmt sömu aðferð og plasmagreiningu.

Ákvörðun á Superoxe Dismutase (SOD) og Catalase virkni: Superoxide dismutase(SOD) virkni var greind með því að nota RANSEL settið. Hér, 0,05 ml af eistum einsleittvar bætt við 1,7 mL af hvarflausn (0.05 mM xantín, 0,025 mM 2-(4-joðfenýl)-{{0}}(4-nítrófenól)-5-fenýltetrasólíumklóríð (INT)). Eftir blöndun, 0,25 mL xanthine oxidase (80 U/L)var bætt við og látið hvarfast við stofuhita í 30 s við stofuhita. Frásogið varmæld við 505 nm. Próteinstyrkur einsleitar eistna var ákvarðaður afBio-Rad DC próteingreiningarsett og sértæk virkni þess (U/mg prótein) var reiknuð út. Katalasinn(CAT) virkni var ákvörðuð samkvæmt áður greindri aðferð [15]. H&E (Hematoxylin og Eosin) litunEistið var lagt í bleyti í 10 prósent af formalíni í 24 klst og geymt við 4◦C. Skerið vefina í sneiðarörstærð og fest við rennibrautina. Eftir festingu (95 prósent metanól auk 5 prósent ediksýra) voru glærurnarsökkt í hematoxýlín í 3 mínútur, þvegið með rennandi vatni í 5 mínútur og síðan lagt í bleyti með50 prósent, 70 prósent og 90 prósent áfengi í eina mínútu. Eftir það voru glærurnar litaðar með eósíni í 10 s ogbleyti í 100 prósent alkóhóli í eina mínútu þar til það dofnar. Að lokum var rennibrautin bleytt í xýleni í einnmínútu. Síðar var rennibrautin loftþurrkuð og innsigluð. Litaða túpan var sett í öfuga fasa-andstæðasmásjá (Inverted Phase Difference Microscope, Olympus CK-2, Tókýó, Japan) til að fylgjast meðformgerðinni.Greining á HypothalamusMúsin KISS1, G-prótein tengdur viðtakinn (GPR) 54, bæla frumuboða 3 (SOCS-3)og sirtuin 1(SIRT1)genaraðir voru auðkenndar frá NCBI (National Center for BiotechnologyInformation) genagagnagrunnur og tiltekinn grunnur var hannaður með því að nota Primer 5.0 PREMIER Biosoft,Palo Alto, CA, Bandaríkjunum.). Primerarnir sem notaðir voru í tilrauninni eru taldir upp í töflunni1.

Útdráttur ríbonucleic sýru (RNA) úr undirstúku. Útdráttur RNA úrundirstúka heilans var framkvæmd með því að nota RNeasy Lipid Tissue Mini Kit. Hið fengnumRNA voru magnmæld með öfugum umritun (RT) og pólýmerasa keðjuverkun(PCR). Hrós DNA sem fékkst úr RT greiningu var geymt kl−20 ◦C til notkunar síðar.Útdregið DNA var gert í pólýmerasa keðjuverkun (PCR) greiningu með því að nota Taq pólýmerasa.Síðan, 5~10µL af PCR afurðinni var tekinn og greindur með rafdrætti á 1,5 prósent agarkolloid. Myndin var tekin í UVP BioDoc-It myndgreiningarkerfi. Reverse-transscribed complementarydeoxyribonucleic acid (cDNA) var tekin og PCR var framkvæmd með IQ SYBR Green SupermixKit. Síðar var það greint með iQTM 5 Optical System Software. Prótein voru dregin út með því að nota apróteinútdráttarhvarfefni (T-PER). Síðan var 20 mg af eistum einsleitt bætt við 400µL af T-PER og skilvindu (High-Speed ​​Centrifuge, Hettich CR-12, Tuttlingen, Þýskalandi) við 4◦C (125,000× g) í 20 mín. Eftirfarandi aðferð var svipuð og "auðkenning og magngreininggreining á próteini“ in vitro greiningu.2.3. TölfræðigreiningTilraunaniðurstöðurnar voru gefnar upp sem meðaltal± staðalfrávik (meðal± SD) oggögn voru greind með Statistical Product & Service Solutions (SPSS) 11.0 hugbúnaði, IBM, Armonk,New York, NY, Bandaríkin. Munurinn á hópunum var greindur með einstefnugreiningu ádreifni (ANOVA). Margvíslegur samanburður á mismunandi hópum var greindur með Duncan prófi áverðmæti áp < 0.05="" as="" the="" signifificant="">

3. Úrslit

3.1. In Vitro greining

3.1.1. Samanburður á andoxunarvirkni ECH, CTE og RES

Langvarandi mikið oxunarálag og langvarandi bólga eru helstu orsakir sykursýkifylgikvillar [16]. CTE innihalda ýmis fenýletanóíð glýkósíð eins og echinacoside(ECH) og akteósíð, með möguleika á andoxunarvirkni [17]. DPPH róttæk hreinsunprófun var gerð til að meta andoxunarvirkni ECH. Trolox og resveratrol(3,5,4'-tríhýdroxýstilben, RES) voru tekin sem staðall og jákvæður samanburður í sömu röð. Eins og sýnt erá mynd1, ECH sýndi betri róttæka hreinsunarvirkni og virknin var umtalsvert meirien jákvæða viðmiðunina (RES).

3.1.2. Frumulífvænleiki ECH á LC-540 og TM3 Leydig frumumMTT próf var gerð til að meta lífvænleika frumna mismunandi styrks ECH.LC-540 Leydig frumur og TM3 Leydig frumur sýndu meira en 80 prósent af lífvænleika eftir að hafa verið meðhöndluð meðECH (Mynd2). Í samanburði við annan styrk, er 100-µM styrkur (þynningar upp á 100µM í 2 prósent FBS) af ECH sýndi betri frumulífvænleika í TM3 Leydig frumum. Niðurstaðan benti til þess aðAukinn styrkur ECH stuðlar ekki að neinum marktækum eiturverkunum á frumurnar.

3.1.3. Áhrif ECH á AGE-framkallaða súperoxíðframleiðslu með NBT prófun í LC-540 og TM3Leydig klefi

AGE veldur oxunarskemmdum í líkamanum vegna oxunar glúkósa og myndunar ásindurefna eins og O2-, hýdroxýlhópar og karbónýlhópar [18]. Eftir að hafa verið örvaður með50 µg/mL af AGE, LC-540 (mynd3a) og TM3 (mynd3b) frumur voru meðhöndlaðar með ECH og RES(5 µM og 10µM hvor). Niðurstöðurnar sýndu að framleiðsla á súperoxíðanjóni var aukiní samanburðarhópnum (örvuð AGE), en framleiðsla súperoxíðanjóns minnkaði eftirmeðferð með ECH og RES. Frá mynd3, það var skilið að ECH og RES lækka stigiðofuroxíðframleiðslu og vernda frumurnar gegn oxunarskemmdum. Ef um er að ræða LC-540 frumur,10 µM ECH sýndi næstum svipaða virkni og venjulega hópinn. Ofuroxíðframleiðslan í báðumfrumum minnkaði með aukningu á styrk bæði ECH og RES.3.1.4. Áhrif ECH á H2O2 Framleiðsla í AGE-örvuðum LC-540 Leydig frumumDCFH-DA prófun var framkvæmd til að greina tilvist oxandi tegunda. Eftir að hafa gengið inn ífrumurnar, FL flúrljómandi liturinn DCFH-DA er oxaður af innanfrumu H2O2 og myndar dichlorofluorescein(DCF). Eins og sýnt er á mynd4, var marktæk aukning á innanfrumu H2O2 framleiðsla íAGE-örvaður hópur (viðmiðunarhópur) en bætt við 10µM ECH og RES lækkuðu verulegahinn H2O2 framleiðslu í frumum. Stjórn 10µM ECH leiddi til aðeins um 47,1 prósent af H2O2 framleiðslu, umtalsvert minni en í samanburðarhópnum.

3.1.5. Áhrif ECH á RAGE og NF-κB-próteintjáning í AGE-örvuðum LC-540Leydig frumur

Western blot greining var gerð til að staðfesta tilvist RAGE í LC-540 Leydigfrumur. Áhrif ECH á RAGE (Mynd5a) og NF-κB (Mynd5b) prótein tjáningarstigí AGEs-örvuðum Leydig frumum voru sýndar á mynd5. Niðurstöðurnar sýndu að 50µg/mLstyrkur AGEs olli hærri RAGE og NF-κB tjáning í LC-540 Leydig frumum og10 µM styrkur ECH og RES hefur dregið verulega úr tjáningu RAGE og NF-κB. Tjáning NF-κB var marktækt lægra í RES og ECH en RAGE mótlyfjum. Svo, úrslitinstaðfesti að ECH minnkaði bólgustigið með því að minnka magn RAGE og NF-κB.

.1.6. Áhrif ECH á testósterónmyndunarferlið í AGE-örvuðum LC-540 Leydig frumum.

Ferlið við sæðismyndun og ófrjósemi karla fer eftir nærveru testósteróns.Eins og sýnt er á mynd6, tjáningar StAR (Mynd6a), CYP11A1 (Mynd6b), CYP17A1 (Mynd6c), og HSD17 3 (Mynd6d) prótein lækkuðu verulega í AGE-örvuðum LC-540 Leydigfrumur (viðmiðunarhópur). Tjáningin á StAR, CYP11A1, CYP17A1 og HSD17 3 prótein vorujókst verulega þegar RAGE mótlyfinu, RES og ECH var bætt við. Hið auknatjáning á StAR og CYP11A1 próteinum sást í bæði ECH- og RES-meðhöndluðum hópum.Tjáningarstig CYP17A1 var nánast svipað í RES og ECH hópum. Tjáningar áHSD17 3 prótein í ECH-meðhöndluðum Leydig frumum var mun hærra en í RES og RAGEfrumur meðhöndlaðar með mótlyfjum. Aukin tjáning á StAR, CYP11A1, CYP17A1 og HSD17 3 próteinbenti til eðlilegrar framleiðslu testósteróns.

5frumur/ml og meðferð með RES og ECH(10µM) var gefið í 24 klst. -aktín var tekið sem innra eftirlit. Venjulegur hópur (Nor)var meðhöndluð með miðli og viðmiðunarhópurinn (Con) var meðhöndlaður með AGE (50µg/ml).

Niðurstöðurvoru sýndar sem meðalmenn±SD (n = 3). Verulegur munur (p < 0.05)="" were="" represented="" by="" letters="">greind með margfeldisprófi Duncan.