HLUTI Ⅰ: Áhrif Cistanche Tubulosa útdráttar á æxlun karlkyns hjá streptósótósín-níkótínamíði völdum sykursýkisrottum

Tengiliður: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Netfang:audrey.hu@wecistanche.com

Zwe-Ling Kong® Athira Johnson® Fan-Chi Ko, Jia-Ling He og Shu-Chun Cheng

Ágrip:Sykursýki er langvarandi sjúkdómur sem einkennist af blóðsykrishækkun vegna minnkaðs magns insúlíns eða óhagkvæmni vefjarins til að nota það á áhrifaríkan hátt. Ófrjósemi er þekkt sem helsta afleiðing sykursýki og hefur áhrif á æxlunarfæri karla með því að valda skerðingu á sæðisfrumum og vanstarfsemi kynkirtla.Cistanche tubulosaer sníkjudýr planta sem hefur getu til að bæta minni, friðhelgi og kynlífsgetu, draga úr getuleysi og lágmarka hægðatregðu. Þessi rannsókn var lögð áhersla á rannsókn á bólgueyðandi og verndandi áhrifum echinacosides (ECH) íCistanche tubulosa þykkni(CTE) um æxlunarfæri karlkyns rotta með sykursýki. Andoxunarefni, bólgueyðandi og verndandi áhrif CTE voru metin með bæði in vitro og in vivo aðferðum. Niðurstöður in vitro sýna að ECH hindraði framleiðslu á hvarfefnum súrefnistegundum (ROS) og bætti StAR, CYP11A1, CYP17A1 og HSD17p3 prótein tjáningu. In vivo greiningin var framkvæmd með þremur skömmtum af echinacoside (ECH) (80, 160 og 320 mg/kg) í CTE. Alls var 0,571 mg/kg af rósíglítazóni (RSG) gefið sem jákvæður samanburður. Sykursýki var framkallað af streptósótósíni (STZ) (65 mg/kg) og nikótínamíði (230 mg/kg) ásamt fituríku fæði (45 prósent). In vivo rannsóknirnar staðfestu að ECH bætti blóðsykursgildi, insúlínviðnám, leptínviðnám og lípíðperoxun. Það getur endurheimt kisspeptin 1 (KiSS1), G prótein-tengdan viðtaka GPR 54, bæla cýtókínboða 3 (SOCS-3), og sirtuin 1 (SIRT1) boðbera ríbonucleic acid (mRNA) tjáningu í undirstúku og endurheimt kynlíf hormónastig. Þannig staðfesti þessi rannsókn andoxunarefni, bólgueyðandi og steramyndun áhrif CTE.

Leitarorð:sykursýki; ófrjósemi;Cistanche tubulosa þykkni (CTE); echinacoside (ECH); bólgueyðandi virkni; andoxunarvirkni; áhrif steramyndunar

Meðferð við sykursýki:Cistanche tubulosa þykkni(CTE)

1. Inngangur

Sykursýki (DM) er ástand þar sem glúkósagildi hækkar í blóði vegna óhagkvæmni brissins við að framleiða nóg insúlín eða vanhæfni líkamans til að nota það á áhrifaríkan hátt. Samkvæmt WHO fjölgaði sykursýki úr 108 milljónum árið 1980 í 422 milljónir árið 2014 [1]. Það eru fjórir meginflokkar: forsykursýki (stig fyrir sykursýki), tegund 1 (þar sem brisið nær ekki að framleiða insúlín), tegund 2 (líkaminn notar ekki insúlín) og meðgöngusykursýki (sem kemur fram á meðgöngu). Oxunarálag á sér stað vegna ójafnvægis á milli framleiðslu hvarfgjarnra súrefnistegunda (ROS) og andoxunarefna [2] sem að lokum leiðir til sykursýkisástandsins. Fylgikvillar sykursýki eru meðal annars nýrnabilun, taugaskemmdir, blinda, heilablóðfall, hjartaáfall, fósturdauði og ófrjósemi. [1]. Rannsóknir sýna að sæðiskjarnar, deoxýríbónkjarnasýra (DNA) og hvatberar voru verulega skemmdir hjá karlkyns sykursýkissjúklingum [3]. Oxunarálag við flutning á sæði mun breyta ferli karlkyns æxlunarkerfisins [4,5].

Ferlið við sæðismyndun er stjórnað af undirstúku-heiladingul-kynkirtla (HPG) ás. Gónadótrópín-losandi hormónið (GnRH) framleitt af undirstúku örvar framleiðslu gulbúsörvandi hormóns (LH) og eggbúsörvandi hormóns (FSH). Leydig frumur finnast við hlið sáðpíplanna og framleiða testósterón undir stjórn LH. FSH kveikir á framleiðslu á mótefnavakabindandi próteini (ABP) sem hjálpar til við að flytja karlhormónið. Þannig skapast ófrjósemi og önnur vandamál aðallega vegna truflana sem verða á HPG ásnum. Gjöf samsetningar streptósótósíns-níkótínamíðs veldur sykursýki hjá tilraunarottum. Streptósótósín er efnasamband sem er eitrað fyrir insúlínframleiðandi p frumur í brisi og nikótínamíð er vatnsleysanlegt vítamín sem verndar p frumurnar gegn algjörum skemmdum [6].

Cistanche tubulosa er eyðimerkurplöntutegund einnig þekkt sem „Rou Cong-Rong“ [7]. Það er sníkjudýra planta sem ekki er klórófyll og vex aðallega á rót Calotropis Procera trésins og dreifist víða í þurru landi Gansu, Qinghai, Xinjiang, Mongólíu, Íran og Indlandi. Algengt nafn Cistanche tubulosa er "Desert Hyacinth". Það er almennt viðurkennt í kínverskri hefðbundinni læknisfræði og hefur fengið nafnið "Ginseng of the Desert". Það er mikið notað á lækningasviði til að meðhöndla sjúklega hvítblæði, mikla lungnabólgu, langvinna nýrnasjúkdóma, hægðatregðu, getuleysi og ófrjósemi. Efnafræðilegir þættir íCistanche tubulosasamanstanda af órokgjarnum fenýletanóíð glýkósíðum (PHG), iridoids, lignönum, rokgjörnum olíum, alditólum, fásykrum og fjölsykrum [8]. Rannsóknir sýna að echinacoside frá þessari jurt verndar skemmda vefjafrumu með því að stjórna ROS-gildum [9]. Þetta efnasamband framleiðir andoxunarefni, æðaslökun og bólgueyðandi virkni ásamt taugavörn og forvarnir gegn beinþynningu [10,11].

Þessari rannsókn var ætlað að kannaáhrif Cistanche tubulosa þykknisem inniheldur ECH á æxlunartruflunum á streptósótósín-níkótínamíð-völdum sykursýkisrottum.

Cistanche tubulosa

2. Efni og aðferðir

2.1.Efni

ECH og CTE voru keypt frá Sinopharm Pharmaceutical Co., Ltd (Yilan, Taívan). Advanced glycation endproducts (AGEs) voru keyptar frá Biovision (San Francisco, CA, Bandaríkjunum). LC-540 og TM3 frumulínur voru keyptar frá Food Industry Research and Development Institute (Hsinchu, Taívan). Fimm vikna gamlar Sprague-Dawley (SD) karlkyns rottur voru keyptar frá National Laboratory Animal Center (Taipei, Taívan). Feed Lab Diet® var keypt frá PMI Nutrition International, Inc. (Taipei, Taívan). 2,2-dífenýl-1-píkrýlhýdrasýl (DPPH) var fengið frá Sigma (St. Louis, MO, Bandaríkjunum). Metanól og 4-(2-hýdroxýetýl)-1-píperasínetansúlfónsýra (HEPES) voru einnig keypt frá Sigma. Dulbecco's modified Eagle medium/F12 og trypsin-EDTA voru fengin frá GIBCO (New York, NY, Bandaríkjunum). 3-(4, 5-dímetýlþíasól-2-ýl)-2, 5-dífenýltetrasólíumbrómíð (MTT), díklóró-díhýdró-flúoresceín díasetat (DCFH-DA), dímetýlsúlfoxíð (DMSO) og nítróblátt tetrasólíum (NBT) voru keypt frá Sigma. Glúkósa ensímsett voru fengin frá Kyokutoseiyaku, Tókýó, Japan. Insúlín ELISA sett voru keypt frá Mercodia AB Inc., Sylveniusgatan 8A (Uppsala, Svíþjóð). T-PER vefjapróteinútdráttarhvarfefni var keypt frá Thermo Scientific (Chicago, IL, Bandaríkjunum). And-mann/mús/rotta kjarnaþáttur-kappa B NF-kB fjölstofna mótefni voru keypt frá Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, Bandaríkjunum. And-mús/rotta viðtakar fyrir háþróaða glycation endproducts (RAGE) fjölstofna mótefni, and-manna/mús/rottu StAR fjölstofna mótefni og and-manna/mús/rottu Cytochrome P450 17A1 einstofna mótefni voru keypt frá Gene Tex (Irvine, CA, Bandaríkjunum). CYP11A1 fjölstofna mótefni gegn mönnum/mús/rottum voru fengin frá Cell Signaling Technology (Beverly, PA, Bandaríkjunum). Easy-Blue hvarfefnið var keypt frá Invitrogen, Thermo Fisher Scientific (Carlsbad, CA, Bandaríkjunum). Agarósa og DNA merki 100 bp voru fengin frá Promega, Corporation (Madison, WI, Bandaríkjunum). RNeasy Lipid Tissue Mini Kit var keypt frá QIAGEN, Hilden, Þýskalandi.

2.2.Aðferðir

2.2.1. In Vitro greining

LC{0}} og TM3 frumurækt: LC-540 frumulínurnar voru ræktaðar við 37 OC í Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) miðli ásamt natríumbíkarbónati (1,5 g/L), L -glútamín (2 mM), ónauðsynlegar amínósýrur (0,1 mM), natríumpýrúvat (1.0 mM) og nautgripasermi (FBS) (10 prósent) í 5 prósent CO2 útungunarvél (CO2 útungunarvél, Napco 5410, Taívan). TM3 frumulínan var ræktuð í Dulbecco/s modified Eagle medium (DMEM) ásamt glúkósa (4,5 g/L), natríumpýruvati (0,5 mM), L-glútamíni (2,5 mM), natríumbíkarbónati (1,2 g/L), 4-(2-hýdroxýetýl)-1-píperasínetansúlfónsýra (HEPES, 15 mM), og kálfsfóstursermi (FCS, 10 prósent) eða hrossasermi (5 prósent) við 37 OC í 5 prósent CO2 útungunarvél.

Ákvörðun frumulífvænleika Echinacoside (ECH): 3-(4, 5-dímetýlþíasól-2-ýl)-2,5- dífenýltetrasólíumbrómíð (MTT) hvarfefni var notað fyrir frumulífvænleikapróf. Frumustyrkurinn var stilltur á 2 x 105 frumur/ml í 96-brunnsplötu. Síðan var 20 卩L af ECH (þynnt í 2 prósent af miðli) bætt við og ræktað í 24 klst við 37 OC í 5 prósent CO2 útungunarvél. Síðar var 100 卩L af MTT hvarfefni bætt við og ræktað í 4hat37 OC við dimmar aðstæður. Gleypið var mælt við 570 nm (ELISA lesandi, Dynatech MR5000, Kloten, Sviss).

Restive CeH viabiHiy ( prósent )=[(Asýni við 570 nm — Ablank við 570 nm)]/[(Acontrol við 570 — Ablank við 570)] x 100.

Nitroblue Tetrazolium (NBT) minnkunarpróf og 2,2-dífenýl-1-píkrýlhýdrasýl (DPPH) próf: Fjöldi frumna var stilltur í 1x 1{{10}}6 frumur/ml . Síðan var 50 mg/ml af ECH, resveratrol (RES) og háþróuðum glýkingarendaafurðum (AGEs) (viðmiðun) bætt við og ræktað saman í 18 klst við 37OC. Síðan var 0,3 ml af NBT lausn (0,1 mg/ml NBT, 5 prósent FBS og 3 prósent dímetýlsúlfoxíð (DMSO) uppleyst í 10 ml DMEM) bætt við og ræktuð við 37 °C í 5 prósent CO2 í 1 klst. Eftir skilvindu (við 800 xg í 3 mínútur) var flotið fjarlægt og 200 µL DMSO var bætt við og hrist í 5 mínútur í úthljóðssveiflu (Delta Ultrasonic Cleaner D 200, Keelung, Taívan). Gleypið var mælt við 630 nm. Fyrir DPPH róttæka prófun var Trolox (í 95 prósent alkóhóli) tekin sem staðall. Síðan var 75 µL af 0,5 mM DPPH lausn blandað saman við 25 µL af sýnum og leyft að hvarfast við stofuhita á dimmum stað í 30 mínútur. Blandan var hrist og gleypni var mæld við 517 nm.

Greining á innihaldi hvarfefna súrefnistegunda (ROS): Frumufjöldi var stilltur í 2 x 105 frumur/ml í 12-brunnsplötu sem innihélt 2 prósent FBS. Síðan var 50 卩L/ml af ECH, RES og AGEs bætt við plötuna og ræktað við 37 OC í 24 klst. Eftir 24 klst. var 2Z,7Z-díklórflúorescein-díasetati (DCFH-DA) bætt við og ræktað við 37°C í 30 mín. Eftir skilvindu (400x g, 5 mín) var flotið fjarlægt og frumurnar þvegnar tvisvar með fosfat-bufferðri saltlausn (PBS). Eftir að frumur voru stöðvaðar í 1 ml af PBS og magn ROS var ákvarðað með því að nota frumuflæðismæli (Flæðisfrumumælir, Becton Dickinson, CA, Bandaríkjunum).

Auðkenning og magngreining á próteini: Prótein voru dregin út með því að nota próteinútdráttarhvarfefni (T-PER). Frumuþéttleiki var stilltur á 2 x 105 frumur/ml í 12-brunnsplötu og 50 µL/mL af ECH, RES og viðtaka fyrir háþróaða glýkunarendaafurð (RAGE) mótlyf og AGE var bætt við og ræktað við 37 OC í 5 prósent CO2 útungunarvél í 24 klst. Eftir það var 400 卩L af T-PER bætt við, skafið af frumunum og skilið í skilvindu við 125,000xg í 20 mínútur (4 OC). Vökvanum var safnað saman og geymt við -80 OC (-80 OC frystir, Nuaire, Plymouth, MN, Bandaríkjunum) til frekari greiningar. Bicinchoninic acid (BCA) setti var notað til að mæla magn próteina. Síðan var 10 卩L af staðlaðri frumulausn og 200 RL af BCA hvarfefni bætt við 8-brunnsplötur og ræktað við 37°C í 5% CO2 útungunarvél í 30 mínútur. Gleypið var mælt við 562 nm. Próteinauðkenningargreining var framkvæmd með natríumdódecýlsúlfat (SDS)-pólýakrýlamíð hlaupi (SDS-PAGE) rafdrætti. Sýni voru útbúin með því að bæta próteinlýsati við próteinhleðslubuff og Western blot greining var gerð til að greina sérstök prótein.

2.2.2.In Vivo greining

Hönnun dýralíkana: Sextíu {{0}} vikna gamlar Sprague-Dawley (SD) karlkyns rottur voru keyptar frá National Laboratory Animal Center (Taipei, Taívan). Hver rotta var hýst fyrir sig í sótthreinsandi búrum úr ryðfríu stáli undir stýrðu hitastigi (23 土 1 gráðu) og rakastigi (40-60 prósent) með 12 klst ljós/12 klst myrkri hringrás. Matur og vatn var útvegað að vild. Hver rotta var tæmd fyrstu vikuna og fékk nagdýrafæði 5001 á rannsóknarstofu sem aðalfæði. Allar aðferðir fylgdu stöðlum dýraverndar- og notkunarnefndar stofnana (IACUC samþykki nr. 101026) frá National Taiwan Ocean University, Taiwan. Eftir tamningu var rottum skipt í tvo hópa: samanburðarhópinn (Con) sem var fóðraður með rannsóknarmataræði 5001 og sykursjúkahópinn sem var fóðraður með fituríku fæði (HFD, 40 prósent) fyrir alla tilraunina. Eftir að hafa verið fóðruð með HFD í 4 vikur var rottunum í sykursýkishópnum sprautað með streptósótósíni (65 mg/kg) (STZ) til að framkalla sykursýki (DM). Innan 15 mínútna frá inndælingu STZ var nikótínamíði (230 mg/kg líkamsþyngdar) sprautað. Viku eftir inndælingu var framkvæmt glúkósaþolpróf til inntöku (OGTT) til að ákvarða árangursríka örvun sykursýkis mellitus (DM). Eftir það var dýrunum skipt í sex hópa: viðmiðið (fóðrað með rannsóknarfæði 5001); DM hópur (DM plús 45 prósent HFD); DMR hópur (DM auk rósíglítazóns: 0,571 mg/kg líkamsþyngdar) auk 45 prósenta HFD; DME1 hópur (DM auk CTE: 80 mg/kg BW) auk 45 prósent HFD; DME2 hópur (DM auk CTE: 160 mg/kg BW) auk 45 prósent HFD; og DME4 hópur (DM auk CTE: 320 mg/kg BW) auk 45 prósenta HFD. Rósíglítazón (RSG) var tekið sem jákvæður samanburður. Þrír skammtar af CTE (80, 160 og 320 mg/kg) voru notaðir í samræmi við ráðleggingar matvæla- og lyfjaeftirlits Taívan (TFDA) um mat á heilsufæði. Meðferð var gefin til loka tilraunarinnar. Öllum tilraunarottum var fórnað eftir 6 vikur. Blóðinu var safnað úr rottunum var skilið í skilvindu við 3000 rpm í 15 mínútur við 4 gráður.

Mian áhrifarík innihaldsefni cistanche tubulosa

Yfirvatnið var skoðað fyrir eftirfarandi greiningu

Heildarglúkósa-, þríglýseríð- og kólesterólákvörðun: Glúkósaákvörðunin var framkvæmd með glúkósaensímsettum. Síðan var 20 af blóðvökvasýnum bætt við hvarfefnin og haldið við 37 gráður í 5 mínútur. Heildar þríglýseríð og heildarþéttni kólesteróls voru ákvörðuð með því að nota þríglýseríð og kólesteról ensímsett. Síðan var 10 ^L af blóðvökva bætt við hvarfefnin og tilraunin var framkvæmd samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. Gleypið var mælt við 510 nm.

Heildarglúkósa/þríglýseríð/kólesteról í plasma (mg/dL)=(-ABlank)/(Astandard - ABlank) x 200.

Sýni: Frásog blóðsýna, ABlank: Frásogsgildi setta án sýnis, A staðall: Frásogsgildi staðlaðs hvarfefnis, 200: staðlaðra hvarfefna í styrkleika 200 mg/dL.

Ákvörðun insúlín-, leptíns og hómóstatískra líkana - Insúlínþol (HOMA-IR) Ákvörðun: Insúlínmagn var ákvarðað með insúlín ELISA settum. Hér var 25 af blóðvökva bætt við hvarfefnin og gleypni mæld við 450 nm. Heildarmagn leptíns var ákvarðað með því að nota leptínensím ónæmismælingarsett. Síðan voru 100 plasma greind og gleypni mæld við 450 nm með því að nota ELISA lesara. Öll tilraunin var gerð samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. HOMA-IR gildið var ákvarðað út frá jöfnunni fyrir mat á jafnvægislíkaninu=Insúlínstyrkur fastandi í plasma (mU/mL) x fastandi styrkur glúkósa í plasma (mmól/L)/22,5.

Plasma Lipid Peroxidation: Hér var {{0}},5 ml af blóðvökva blandað saman við 1 ml af hvarfefni (15 prósent, w/v tríklórediksýra í 0,25 N saltsýrum (HCl) ) og 0,375 prósent , w/v þíóbarbítúrsýru í 0,25 N HCl) og sett í vatnsbað (Water Bath, BUCHI461, Zurich, Sviss) við 100 gráður C í 15 mín. Eftir kælingu var 1 ml af n-bútanóli bætt við, hrist kröftuglega og skilið í skilvindu við 1500 xg í 10 mín. Vökvanum var safnað saman og gleypni var mæld við 532 nm [12].

Malondialdehýð (MDA) styrkur (nM/mL)=[(Asýni við 532 nm - Ablank við 532 nm)/ (Astandard við 532 nm - Ablank við 532 nm)] x 5.

Ákvörðun á magni testósteróns og gulbúshormóns (LH) í plasma: Testósterón ELISA settið var notað til að mæla magn testósteróns í blóðvökva. RIA setti var notað til að ákvarða LH styrkinn. Síðan var 50 卩L af plasma bætt við og útreikningarnir byggðir á styrk hormónsins LH-RP-3 (staðlað). Frekari skref voru framkvæmd samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda.

Ákvörðun æxlisdrepsþáttar (TNF)-a og interleukin-6 (IL-6) styrkur: Mótefnið sem fanga var þynnt 250 sinnum í húðunarjafna, bætt við {{4} }brunnsplötu (100 卩L/brunn) og haldið við 4 gráður C yfir nótt. Flotið var sogað og þvegið fimm sinnum með þvottajafna (1 sinni PBS, 0,05 prósent Tween 20). Eftir ræktun (1 klst) með 200 ^g af greiningarþynningarefni voru frumurnar þvegnar 5 sinnum með þvottajafna og 100 ^L af TNF-a staðallausn eða prófunarsýnum var bætt í hvern brunn og ræktaðar í 2 klst. Eftir þvott var 100 RL af IL-6 greindum mótefnum bætt við og ræktað í 1 hatt stofuhita. Fljótandi vökvinn var sogaður og þveginn 5 sinnum. Síðan var 480 RL af ensíminu avidin-piparrótarperoxídasa (HRP) bætt við og ræktað í 30 mínútur við stofuhita. Fljótandi vökvinn var sogaður og þveginn fimm sinnum með þvottajafna. Síðan var 100 RL af hvarfefnislausn bætt við og ræktað í 15 mínútur við stofuhita. Síðar var 50 RL af stöðvunarlausn (1M fosfórsýra) bætt í hvern brunn og gleypni mæld við 450 nm.

Ávinningurinn af Cistanche Echinacoside: Andoxun

Greining á færibreytum sæðis og eistna

Sæðissýnasöfnun: Sæðissýnissöfnunin var framkvæmd samkvæmt aðferðinni sem áður var greint frá í [13]. Sæðinu var safnað úr flotinu og notað til frekari greiningar.

Fjöldi sæðisfrumna, hreyfanleika sæðisfrumna og óeðlilegrar sæðisfruma: Fjöldi sæðisfrumna var reiknaður út með því að nota blóðfrumnamæli og trypan bláa lausn. Síðan var 100 RL af sæðisvökva blandað saman við trypan bláa lausn og fjöldi sæðisfrumna, hreyfigetu og óeðlilegra sæðisfrumna reiknaður út með blóðfrumnamæli og smásjá [14].

Nítróblátt tetrasólíum NBT lækkun og lípíðperoxun sæðis og eistna: Fituperoxun og NBT lækkun voru greind samkvæmt sömu aðferð við plasmagreiningu.

Ákvörðun á Superoxide Dismutase (SOD) og Catalase virkni: Superoxide dismutase (SOD) virkni var greind með því að nota RANSEL settið. Hér, {{0}}.05 mL af einsleitum eistum var bætt við 1,7 mL af hvarflausn (0.05 mM xantín, 0.025 mM 2-({ {9}}joðfenýl)- 3-(4-nítrófenól)-5-fenýltetrasólíumklóríð (INT)). Eftir blöndun var 0,25 ml af xantínoxíðasa (80 U/L) bætt við og hvarf við stofuhita í 30 sekúndur við stofuhita. Gleypið var mælt við 505 nm. Próteinstyrkur einsleitar eistna var ákvarðaður með Bio-Rad DC próteinprófunarbúnaði og sértæk virkni þess (U/mg prótein) var reiknuð út. Katalasa (CAT) virknin var ákvörðuð samkvæmt áður greindri aðferð [15].

H&E (Hematoxylin og Eosin) litun

Eistið var lagt í bleyti í 10 prósent af formalíni í 24 klst og geymt við 4 gráður C. Skerið vefina í örstærð og fest við glæruna. Eftir festingu (95 prósent metanól auk 5 prósent ediksýra) voru skyggnurnar sökktar í hematoxýlín í 3 mínútur, þvegnar með rennandi vatni í 5 mínútur og síðan bleyttar með 50 prósent, 70 prósent og 90 prósent alkóhóli í eina mínútu. Eftir það voru skyggnurnar litaðar með eósíni í 10 s og liggja í bleyti í 100 prósent alkóhóli í eina mínútu þar til þær dofna. Að lokum var glæran lögð í bleyti í xýleni í eina mínútu. Síðar var rennibrautin loftþurrkuð og innsigluð. Litaða túpan var sett í öfug fasa-andstæða smásjá (Inverted Phase Difference Microscope, Olympus CK-2, Tókýó, Japan) til að fylgjast með formgerðinni.

Greining á Hypothalamus

Músin KISS1, G-prótein tengdur viðtakinn (GPR) 54, bæla cýtókínboða 3 (SOCS-3), og sirtuin 1(SIRT1) genaröðin voru auðkennd úr genagagnagrunni NCBI (National Center for Biotechnology Information) og sérstakur grunnur var hannaður með því að nota Primer 5.0 PREMIER Biosoft, Palo Alto, CA, Bandaríkjunum.). Primerarnir sem notaðir voru í tilrauninni eru taldir upp í töflu 1.

Útdráttur ríbonucleic sýru (RNA) úr undirstúku. Útdráttur RNA úr undirstúku heilans var framkvæmd með því að nota RNeasy Lipid Tissue Mini Kit. MRNA sem fengust voru magnmæld með öfugum umritun (RT) og pólýmerasa keðjuverkun (PCR). Hrós DNA sem fékkst úr RT greiningu var geymt við -20 gráðu til notkunar síðar. Útdregið DNA var gert í pólýmerasa keðjuverkun (PCR) greiningu með því að nota Taq pólýmerasa. Síðan voru 5~10 ^L af PCR afurðinni teknir og greindir með rafdrætti á 1,5% agarkolloid. Myndin var tekin í UVP BioDoc-It myndgreiningarkerfi. Reverse-transscribed complementary deoxyribonucleic acid (cDNA) var tekin og PCR var framkvæmd með IQ SYBR Green Supermix Kit. Síðar var það greint með iQTM 5 Optical System Software. Prótein voru dregin út með því að nota próteinútdráttarhvarfefni (T-PER). Síðan var 20 mg af einsleitu eistum bætt við 400 ^L af T-PER og skilið í skilvindu (High Speed ​​Centrifuge, Hettich CR-12, Tuttlingen, Þýskalandi) við 4 gráður (125,000 xg) í 20 mín. Eftirfarandi aðferð var svipuð "greiningu og magngreiningu á próteini" in vitro greiningu.

2.3.Tölfræðigreining

Tilraunaniðurstöðurnar voru gefnar upp sem meðaltal 土 staðalfrávik (Mean 土 SD) og gögnin voru greind með Statistical Product & Service Solutions (SPSS) 11.0 hugbúnaði, IBM, Armonk, New York, NY, Bandaríkjunum. Munurinn á hópunum var greindur með einhliða dreifigreiningu (ANOVA). Margfaldur samanburður á mismunandi hópum var greindur með Duncan prófi á gildinu p < 0.05="" sem="" marktækt="">

NÆSTI HLUTI Ⅱ ÁFRAM