Echinacoside framkallar apoptótísk krabbameinsfrumudauða með því að hamla núkleótíðlauginni hreinsandi ensím MTH1

Fyrsti hluti Hvernig hamlar echinacoside frumudapósu og bætir minni

Fyrir frekari upplýsingar vinsamlega hafðu samband við: Ali.ma@wecistanche.com

Ágrip:Hömlun á sótthreinsandi ensíminu MTH1 veldur víðtækum oxandi DNA skemmdum og frumudauða í krabbameinsfrumum og er því hægt að nota sem krabbameinslyf. Þar sem náttúruvörur hafa verið rík uppspretta lyfjaefna, notuðum við í þessari rannsókn MTH1-hvatað ensímhvarf sem mikil afköst í vitro skimunarprófi til að leita að náttúrulegum efnasamböndum sem geta hamlað MTH1.Echinacoside, efnasamband sem er unnið úr lyfjaplöntunum Cistanche og Echinacea, hamlaði á áhrifaríkan hátt hvatavirkni MTH1 í in vitro prófun. Meðferð á ýmsum krabbameinsfrumulínum manna meðEchinacosideleiddi til marktækrar aukningar á frumustigi oxaðs gúaníns (8-oxogúaníns), á meðan magn hvarfgjarns súrefnistegunda í frumum hélst óbreytt, sem gefur til kynna aðEchinacosidehindraði einnig virkni frumu MTH1. Þar af leiðandi,EchinacosideMeðferðin olli tafarlausri og stórkostlegri aukningu á DNA-skemmdamerkjum og uppstjórnun á G1/S-CDK hemlinum p21, sem fylgt var eftir með áberandi apoptótískum frumudauða og frumuhringsstopp í krabbameini en ekki í ókrabbameinsfrumum. Samanlagt bentu þessar rannsóknir á náttúrulegt efnasamband sem MTH1 hemil og benda til þess að náttúrulegar vörur geti verið mikilvæg uppspretta krabbameinslyfja.

Leitarorð:Echinacoside, MTH1, 8-oxoG, DNA skemmdir,apoptosis, frumuhringstopp.

Smelltu til að Cistanche notar fyrir minni

Kynning

Frum- og hvatbera núkleósíð þrífosfat (NTP) og deoxýnukleósíð þrífosfat (dNTP) er marktækt skotmark ýmissa hvarfgjarnra súrefnistegunda (ROS).1–3 Vegna þess að sérhæfni DNA pólýmerasa er minna en fullkomin er hægt að 4,5 oxað dNTP. felld inn í nýmyndað DNA til að valda erfðafrávikum ef ekki er lagað.6 Til dæmis getur aðal oxaði basinn í núkleótíðsafninu, 8-oxogúanín (8-oxoG), basapörað við cýtósín og adenín. Þegar það er sett í gagnstæða adenín meðan á DNA eftirmyndun stendur, getur það hugsanlega valdið T: A=G: C transversion,7 sem er ein algengasta stökkbreytingin sem finnast í krabbameinum í mönnum.8,9 Þó að flestir oxuðu frjálsu dNTPs eru fjarlægðar með sótthreinsandi ensímum núkleótíðasafns, rannsóknir í fortíðinni hafa leitt í ljós að núkleótíðsafnið er enn mikilvæg uppspretta oxaðra basa í DNA sameindum og verulegur þáttur í oxandi DNA skaða.3,10 Spendýrafrumur eru vopnaðar háþróuðum varnaraðferðum til að lágmarka erfðafræðilegar skemmdir af völdum ROS. Nucleotide pool sótthreinsandi ensím vatnsrjúfa oxað dNTP og NTP og koma þannig í veg fyrir innlimun þeirra í DNA og RNA sameindir.11,12 MTH1, meðlimur Nudix hýdrólasa yfirfjölskyldunnar (þess vegna einnig kallaður NUDT1),13 er þrífosfatasi sem ber ábyrgð á að fjarlægja oxað púrín NTP og dNTP (8-oxodGTP, 2-OH-dATP, 8-OH-GTP og 2-OH-ATP) úr núkleótíðsöfnunum.14 Þar sem 8-oxogúanín (8-oxoG) er helsti oxaði basinn inni í frumum, MTH1 er mikilvægasta ensímið fyrir hreinsun kirnissafna.15 Engu að síður, jafnvel undir eftirliti kirnishreinsandi ensíma, er umtalsverður hluti oxaðra dNTP-efna. felld inn í DNA, og einnig er hægt að oxa basa í DNA sameindum beint af ROS.6 Frumur treysta síðan á útfærðari aðferðir sem fela í sér ýmsa DNA glýkósýlasa, svo sem OGG1 og MUTYH, og DNA viðgerðarferli, þar með talið basaútdráttarviðgerðir (BER) og mismatch. viðgerð (MMR), til að laga erfiða basa í DNA sameindum.10, 16,17 BER og MMR gera venjulega við marga oxaða basa í DNA á dag og gegna því mikilvægu hlutverki við að vernda heilleika og stöðugleika erfðamengsins.

Í frumum sem eru undir auknu oxunarálagi getur aukin innlimun oxaðra núkleótíða í DNA yfirbugað viðgerðargetu frumunnar og kallað fram DNA skaðasvörun (DDR).18 Viðvarandi DDR boð mun leiða til frumuhringsstopps, ótímabærrar frumuöldrunar eða frumudauða, þ.e. setur hindrun fyrir æxlismyndun.19 Samt, þó að krabbameinsfrumur sýni mjög aukna oxunarspennu og myndu hugsanlega banvæna byrði af oxuðum kirnum,20 geta þær lifað af DDR-tengda öldrun eða frumudauða.21 Mikill fjöldi rannsókna hefur sýnt að MTH1, með því að fjarlægja hættulega mikið af 8-oxodGTP og 2-OH-dATP í æxlisfrumum, gegnir það lykilhlutverki í þróun krabbameins.22 MTH1 reyndist oftjáð í mismunandi tegundum krabbameins,23– 25 og 8-oxoG gildi, og umfang oxandi DNA skemmda var minna í æxlum en í eðlilegum vefjum í kring.26–28 Í virkni minnkaði oftjáning MTH1 marktækt dofinn er af DNA stökkbreytingum sem sjást í MMR-skorti músafósturblóðþráðum10 og gerði frumum kleift að sigrast á krabbameinsvaldandi Ras-völdum ótímabæra frumuöldrun og frumudauða;29 en bæling MTH1 kom í veg fyrir þróun krabbameins í OGG1-skortum músum30 og stuðlaði að ROS30 -framkallað DDR og frumuöldrun í Ras-umbreyttum frumum.3,29,31 Þannig að þótt MTH1 gegni verndandi hlutverki með því að koma í veg fyrir ROS-framkallaðar stökkbreytingar í heilbrigðum frumum, komu þessar rannsóknir í ljós að MTH1 er sérstaklega nauðsynlegt fyrir tilkomu og lifun krabbameins frumur. Nýlegar rannsóknir hafa gefið fleiri vísbendingar til að styðja hlutverk MTH1 í krabbameinsþróun.31–34 Bæling á MTH1 með RNAi eða litlum sameindahemlum í ýmsum krabbameinsfrumulínum leiddi til verulega aukins innlimunar 8-oxodG í erfðafræðilegt DNA, sem leiddi til víðtækra DNA-skemmda, frumudauða vegna frumudauða og minnkaðrar lifun krabbameinsfrumna. 32,33 Í rannsóknum á xenograft músum bældi hömlun á MTH1 á skilvirkan hátt vöxt krabbameinsútgræðslu. Mikilvægt er að bæla MTH1 hafði ekki áhrif á vöxt og lifun eðlilegra frumna, líklega vegna þess að eðlilegar frumur hafa lægra ROS og eru þar af leiðandi minna háðar MTH1 til að lifa af.32,33 Þessar niðurstöður benda til þess að hömlun á MTH1 sé vænleg ný aðferð til að berjast gegn krabbameini. .

Náttúruafurðir hafa verið rík uppspretta lyfjaefnasambanda.35 Mörg nútíma lækningalyf, þar á meðal krabbameinslyf, hafa verið unnin úr jurta- eða grasalyfjum.36–39 Samt sem áður var mikill fjöldi hefðbundinna jurta lagt til að búa yfir ýmsum lækningaeiginleikum til að vera áfram. að einkennast, aðallega vegna erfiðleika við að stjórna samsetningu þeirra til að skilgreina ótvírætt virkni þeirra og verkunarmáta.40 Það er þörf á nýjum aðferðum sem gera kleift að greina virka efnasambönd og greina sameindakerfi. Í þessu tilliti getur markstýrð in vitro skimun með mikilli afköst verið mikilvægur í að finna vélrænt skilgreind lyfjasambönd úr náttúruauðlindum. Í þessari rannsókn notuðum við MTH1-hvatað ensímhvarf sem in vitro prófun með miklum afköstum til að leita að náttúrulegum efnasamböndum sem geta hamlað MTH1. Það kom á óvart að skimunin leiddi það í ljósEchinacoside, náttúruleg vara sem er best þekkt fyrir öfluga andoxunarvirkni, er fær um að hamla MTH1.

efni og aðferðir

Efni

Náttúruleg jurtasambönd voru keypt frá Yuanye Biological Technology Co., Shanghai, Alþýðulýðveldinu Kína. Heiti, vörulistanúmer, Chemical Abstracts Service (CAS) skráningarnúmer og hreinleiki hvers efnasambands eru skráð í töflu S1. Stofnlausnir efnasambandanna voru útbúnar í 100 prósent dímetýlsúlfoxíði (DMSO) (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, Bandaríkjunum), og vinnulausnir voru útbúnar í prófunarjafna eða fullkomnum frumuræktunarmiðli. Sama lausnin án prófunarefnasambandsins en sem innihélt sama magn af DMSO var notuð sem burðarefnisstýring. (S)-crizotinib var keypt frá Selleck Chemicals, Houston, TX, Bandaríkjunum.

In vitro skimun

In vitro ensímgreiningin sem notuð var til að skima náttúruleg jurtasambönd fylgdi aðferðum sem Gad o.fl. lýsti. asetat (pH 8.0), 40 mM NaCl, 10 mM Mg asetat, 0,005 prósent Tween 20 og 1 mM DTT. Næst var 0,5 nM raðbrigða MTH1 úr mönnum (Abcam, Cambridge, Bretlandi), 100 μM dGTP (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Bandaríkjunum) og 0,2 U/mL ólífrænum pýrófosfatasa (Thermo Fisher Scientific) bætt við og plöturnar ræktaðar á plötuhristara í 1 klukkustund við stofuhita. Endanlegt hvarfmagn var 100 μL á 96-brunnsplötu. Í lok hvarfsins var malakítgrænu (J&K Scientific, Peking, Alþýðulýðveldið Kína) bætt við,41, og plöturnar ræktaðar við stofuhita í 15 mínútur í viðbót. Frásog við 630 nm var mæld með BioRad 680 örplötulesara (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, Bandaríkjunum). Gildi hamlandi styrks (IC50) voru ákvörðuð með ólínulegri aðhvarfsgreiningu með því að nota GraphPad Prism hugbúnaðinn.

Frumuræktun

MG-63 beinsarkmein í mönnum, SK-HEP-1 lifrarkrabbamein, MCF7 brjóstakrabbamein, SW480 ristilkrabbamein, HEK293 fósturnýra og NIH/3T3 trefjafrumufrumulínur úr músum voru úr American Type Culture Collection og eðlilegt fólk lifrarfrumulína L-O2 var keypt frá KenGen Biotech, Nanjing, Alþýðulýðveldinu Kína. Þessum frumum var haldið við 37 gráður í rakaðri andrúmslofti með 5 prósent CO2, eftir leiðbeiningum frá veitendum. Ekki var krafist siðferðisyfirlýsingar frá endurskoðunarnefnd stofnana fyrir notkun þessara frumulína.

Mæling á innanfrumu 8-oxoG

Innanfrumuþéttni {{0}}oxoG var mæld með litun með Cy3-conjugered avidin.42 Alls var 1×104 frumum sáð á kringlóttan hylki í 12-brunnsplötum. Daginn eftir voru frumurnar meðhöndlaðar með 0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM eða 80 μMEchinacosideí 5 klukkustundir, 12 klukkustundir eða 24 klukkustundir og voru síðan festar með ísköldu metanóli í 20 mínútur, fylgt eftir með ræktun í Tris-bufferuðu saltvatni (TBS) með 0,1 prósent Triton X -100 (Sigma-Aldrich) í 15 mínútur. Sýnin voru stífluð í TBS með 0.1 prósent Triton X-100 og 15 prósent fóstursermi úr nautgripum í 1 klukkustund við stofuhita og síðan lituð með Cy3- samtengdu avidini (0,5 ug/ mL) (Rockland Immunochemicals, Limerick, PA, Bandaríkjunum) í blokkunarlausn í 1 klukkustund við 37 gráður. Eftir þvott í fosfat-bufferuðu saltvatni (PBS) þrisvar sinnum í 5 mínútur voru hyljarnar lokaðar á glerskyggnur í VECTASHIELD Mounting Medium með 4′,6-diamidino-2-fenýlindóli (Vector Laboratories, Burlingame, CA , BANDARÍKIN). Myndir voru teknar og greindar með Zeiss LCM 510 confocal smásjá.

Mæling á innanfrumu ROS

Innanfrumuþéttni ROS var mæld með frumuflæðismælingu með því að nota frumubundið ROS prófunarsett (Beyotime Biotechnology, Haimen, Alþýðulýðveldið Kína). Frumur sem ræktaðar voru á plötum með sex brunna voru meðhöndlaðar með 0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM eða 80 μMEchinacosideí 5 klukkustundir, 12 klukkustundir eða 24 klukkustundir, þvegið tvisvar með PBS og ræktað með 10 μM díklórfluorescein díasetati í 30 mínútur við 37 gráður. Frumurnar voru síðan trypsíngerðar og greindar með FACSCaliber flæðifrumumælinum (BD Biosciences, San Jose, CA, Bandaríkjunum). Innanfrumu ROS gildi voru gefin upp sem meðaltal díklóródí-hýdró flúrljómunarstyrks frumna. Tölurnar sem sýndar voru voru meðaltöl þriggja sjálfstæðra tilrauna.

Ónæmisflúrljómandi litun

Frumur sem ræktaðar voru á hyljara voru meðhöndlaðar með 0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM eða 80 μMEchinacosideí 5 klukkustundir, 12 klukkustundir eða 24 klukkustundir og síðan þveginn einu sinni með PBS, festur með 4 prósent paraformaldehýði í PBS í 20 mínútur og lokað í TBS með 0,1 prósent Triton X-100 og 15 prósent nautgripasermi í 1 klukkustund við stofuhita. Fastar frumur voru litaðar í 2 klukkustundir við stofuhita með aðal mótefni gegn 8-oxoG (mús einstofna and-8-oxoG, Abcam), 53BP1 (kanínu mótefni-53BP1; Bethyl Laboratories, Montgomery , TX, USA), eða virkur kaspasi-3 (kanína-anti-kaspasi-3, Bioss, Peking, Alþýðulýðveldið Kína), fylgt eftir með litun með Alexa 488-tengdri asna-antmús ( Abcam) eða Cy3-conjugated geit and-kanínu (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, USA) aukamótefni í 1 klukkustund við stofuhita. Eftir þvott í PBS 3 sinnum í 5 mínútur voru hyljarnar lokaðar á glerskyggnur í VECTASHIELD Mounting Medium með DAPI (Vector Laboratories). Myndir voru teknar með Zeiss LCM 510 confocal smásjá.

Nýlendumyndunarprófun

Daginn fyrir meðferð var frumum sáð í sex brunna plötu í styrkleikanum 1×104 frumur í hverri brunn. Þeir voru síðan meðhöndlaðir með 0 μM, 60 μM eða 80 μM Echinacoside í 7 daga. Eftir þvott með PBS voru frumur festar með ísköldu metanóli og litaðar með kristalfjólublári lausn (Sigma Aldrich) (0,5 prósent í 25 prósent metanóli). Myndir voru teknar eftir þurrkun á plötum yfir nótt. Kristallfjólubláu kristallarnir voru leystir upp með því að bæta við 70 prósent etanóli og gleypni við 595 nm var mæld með BioRad 680 örplötulesara. Gögnin voru greind með GraphPad Prism hugbúnaðinum.

MTT próf

Einum degi fyrir meðferð var frumum sáð í 96-brunnsplötur í styrknum 1×104 frumur í hverri brunn, fylgt eftir með meðferð með raðþynningum af Echinacoside í 24 klukkustundir eða 48 klukkustundir, eða með 60 μM Echinacoside í 5 klukkustundir , 12 klukkustundir eða 24 klukkustundir. Miðillinn var fjarlægður og frumurnar þvegnar með PBS og síðan, 20 μL af 3-(4,5-dímetýlþíasól-2-ýl)-2,

5-dífenýltetrasólíumbrómíð (MTT) lausn (5 mg/ml í PBS, pH 7,2) (Thermo Fisher Scientific) var bætt í hverja brunn. Plöturnar voru ræktaðar við 37 gráður í aðrar 4 klukkustundir. Að lokum var MTT lausnin fjarlægð og 150 μL af DMSO bætt í hverja brunn. Plöturnar voru ræktaðar á plötuhristara í 10 mínútur og gleypni við 570 nm var mæld með BioRad 680 örplötulesara. Hver tilraun var gerð tvisvar í þrígang. Gögnin voru greind með GraphPad Prism hugbúnaðinum. IC50 gildi voru ákvörðuð með ólínulegri aðhvarfsgreiningu.

Frumuhringsgreining

Frumur á plötum með sex brunna voru meðhöndlaðar með 0 μM, 6{{10}} μM, eða 80 μM Echinacoside í 24 klukkustundir, safnað með trypsíni (Life Technologies, Carlsbad, CA, Bandaríkjunum) , þvegið tvisvar með PBS, og síðan fest með ísköldu etanóli (70 prósent) í 2 klukkustundir við -20 gráður. Fastar frumur voru þvegnar tvisvar í köldu PBS og endursviflausnar í 300 μL af nýútbúnu PBS með 0,1 prósent Triton X-100, 0,2 mg/ml DNase-frítt RNase A (Sigma Aldrich), 10 ug/mL própídíumjoðíði (PI) ) (Hoffman-La Roche Ltd., Basel, Sviss). Eftir ræktun við 37 gráður í myrkri í 20 mínútur voru frumurnar síaðar í gegnum Falcon nylon möskva (BD Biosciences), settar á FAC-Calibur flæðifrumumælirinn og greindar með ModFit hugbúnaðinum (BD Biosciences).

DNA sundrunargreining

Frumur sem ræktaðar voru á plötum með sex brunna voru meðhöndlaðar með 0 μM, 60 μM eða 80 μM Echinacoside í 24 klukkustundir og festar í ísköldu 4 prósent paraformaldehýði (Sigma-Aldrich) í 20 mínútur. Eftir þvott með PBS voru frumur innsiglaðar í VECTASHIELD Mounting Medium með DAPI (Vector Laboratories). Kjarnaformgerð var ljósmynduð með Olympus flúrsmásjá. Til að greina DNA sundrungu á agarósagelum var DNA dregið út með því að nota QIAamp DNA örsettið (Qiagen NV, Venlo, Hollandi) og rafskaut var framkvæmd á 2 prósent agarósagelum sem innihéldu 0,1 ug/mL etídíumbrómíð.

Greining á apoptosis með frumuflæðismælingu

Apoptotic frumur voru skoðaðar með því að nota Annexin V-FITC Apoptosis greiningarsett (Best, Shanghai, Alþýðulýðveldið Kína), eftir leiðbeiningum framleiðanda. Frumur ræktaðar í 96-brunnsplötum voru meðhöndlaðar með 0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM, 80 μM eða 160 μM Echinacoside í 2 klukkustundir, 5 klukkustundir, 12 klukkustundir eða 24 klukkustundir, þvegið tvisvar með PBS, og síðan endurblandað í bindijafna. Næst var 5 μL af Annexin V-FITC og 5 μL af PI (Roche) bætt við í röð og frumurnar ræktaðar í 15 mínútur í myrkri við stofuhita. Frumunum var hlaðið inn á FACSCalibur flæðifrumumæli (BD Biosciences) og gögn voru greind með Cell Quest hugbúnaðinum (BD Biosciences).

Western blot greining

Frumur sem ræktaðar voru á plötum með sex brunna voru meðhöndlaðar með 0 μM, 6{{10}} μM, eða 80 μM Echinacoside í 5 klukkustundir, 12 klukkustundir eða 24 klukkustundir, þvegið tvisvar með PBS og skafið af plötunni með því að nota 100 μL af geislaónæmisútfellingarbuffi (150 mM NaCl, 1,0 prósent IGEPAL CA-630, 0,5 prósent natríumdeoxýkólat, 0,1 prósent natríumdódecýlsúlfat og 50 mM Tris, pH 8,0) (Sigma-Aldrich) sem inniheldur 1 mM fenýlmetansúlfónýlflúoríð. Sýnin voru skilin í skilvindu við 12,000× g í 20 mínútur við 4 gráður. Próteinstyrkur í flotinu var ákvarðaður með Bradford hvarfefninu (Dingguo, Changchun, Alþýðulýðveldið Kína). Sýni voru eðlislöguð við 95 gráður í 10 mínútur og aðskilin á 12 prósent natríumdódecýlsúlfat-pólýakrýlamíð hlaup rafdrættishlaup. Eftir rafdrætti voru prótein flutt yfir í pólývínýlídenflúoríðhimnur (Millipore), fylgt eftir með lokun í Tris-bufferuðu saltvatni með Tween 20 (10 mM Tris, pH 7,5; 100 mM NaCl; 0,1 prósent Tween 20) sem inniheldur 5 prósent (w/v) fitulaus mjólk í 1 klukkustund við stofuhita. Blettir voru rannsakaðir með frummótefnum gegn p21 (Abcam), pólý (ADP-ríbósa) pólýmerasa (Bioss) eða virkjaðri kaspasa -3 (Bioss), fylgt eftir með piparrótarperoxidasa-tengdum aukamótefnum (Jackson ImmunoResearch Laboratories). Merki voru þróuð með því að nota aukna efnaljómun Western blotting uppgötvunarbúnaðinn (Trans gen Biotech, Changchun, Alþýðulýðveldið Kína). Tilraunirnar voru endurteknar þrisvar sinnum.

Mæling á hvatberum

himnugetu

Hvatberahimnugeta var mæld með JC{{0}} litarefni (líftækni), eftir leiðbeiningum framleiðanda. Frumur ræktaðar á plötum með sex brunna voru meðhöndlaðar með 0 μM, 60 μM eða 80 μM Echinacoside í 5 klukkustundir, 12 klukkustundir eða 24 klukkustundir, þvegnar tvisvar í PBS og síðan ræktaðar með JC -1 í 20 mínútur. Myndir voru teknar með Olympus flúrsmásjá.

tölfræðigreining

Tölfræðileg greining var gerð með GraphPad Prism hugbúnaði. Marktekt var reiknuð út með einhliða dreifigreiningu og P0.05 var talið tölfræðilega marktækt. Niðurstöður voru gefnar upp sem meðaltal ± staðalfrávik.

Niðurstöður

Auðkenning á Echinacoside sem MTH1 hemli

Til að leita að náttúrulegum efnasamböndum sem geta hindrað MTH1, notuðum við MTH1-hvatað ensímhvarf sem mikil afköst í Vitro skimunarprófinu. Fyrir utan oxuð púrín núkleótíð getur MTH1 einnig vatnsrofið venjulegt deoxýgúanósín þrífosfat til að mynda deoxýgúanósín mónófosfat og pýrófosfat. Í nærveru umfram ólífræns pýrófosfatasa er öllum pýrófosfötum breytt í ólífræn fosföt, sem hægt er að mæla með því að nota malakítgrænt byggt gleypnipróf,41 sem gerir þannig kleift að mæla óbeina MTH1 virkni.32 ​​Til að prófa prófunarkerfið mældum við fyrst áhrif (S)-crizotinib, efnasambands með sannað virkni sem MTH1 hemill.33 Niðurstaðan sýndi að (S)-crizotinib hamlaði örugglega MTH1 kröftuglega (Mynd 1A) með IC50 500 nM, sem var sjöfalt hærra en greint var frá. eftir Huber o.fl. (72 nM).33 Þetta var líklega vegna mismunar á uppgötvunaraðferðum eða upptökum efna og ensíma. Við tókum upp minna næma litningafræðilega nálgun, en Huber o.fl. notuðu mjög næma líflýsandi aðferð.33 Með þetta í huga skimuðum við 12 náttúruleg efnasambönd sem eru fáanleg í verslun (tafla S1), sem hvert um sig er aðal innihaldsefni hefðbundinna jurta með hugsanlega æxlishemjandi efni. starfsemi. Echinacoside, efnasamband hreinsað úr sníkjulyfjaplöntunni Cistanche salsa (Mynd 1C), hamlaði efnahvarfið verulega (Mynd 1B), með IC50 7,01±2,13 μM (Mynd 1D). Að bæta við 50 sinnum meira pýrófosfatasa hafði engin áhrif á niðurstöðuna á meðan fimmfalt meira MTH1 prótein bætti við minnkaði marktækt hömlunarstigið, sem bendir til þess að Echinacoside hafi sérstaklega hamlað virkni MTH1 í in vitro ensímprófinu.

Echinacoside hamlaði frumu MTH1 til að auka innanfrumu 8-oxoG

Næst spurðum við hvort Echinacoside geti hamlað innanfrumu MTH1 virkni. Hömlun á frumu MTH1 mun auka innanfrumu 8-oxoG. Sýnt hefur verið fram á að avidin bindist 8-oxoG með mikilli sérhæfni;42 því notuðum við ónæmisflúrljómandi litun með Cy3-conjugered avidin til að bera saman innanfrumu 8-oxoG gildi í ýmsum krabbameinsfrumulínum áður og eftir Echinacoside meðferð. MG-63 beinsarkmein úr mönnum, SK-HEP-1 lifrarkrabbamein, MCF{{10}} brjóstakrabbamein og SW480 ristilkrabbameinsfrumur voru meðhöndluð með 0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM, eða 80 μM Echinacoside í 5 klukkustundir, 12 klukkustundir eða 24 klukkustundir. Litun með Cy3-conjugered avidin leiddi í ljós að meðferð með 60 μM Echinacoside í 24 klukkustundir jók greinilega og marktækt magn frumu 8-oxoG (Cy3-avidin hvarfefnis) í þessum krabbameinsfrumum ( mynd 2A og B). Hærri styrkur (80 μM) af Echinacoside leiddi til sterkari frumu 8-oxoG litunar (Mynd 2B), sem bendir til skammta-svörunarsambands. Svipaðar niðurstöður fengust með ónæmisflúrljómandi litun með mús einstofna mótefni -8-oxoG mótefnis (Mynd S1A).43 Styrkur Echinacoside (60 μM) sem þarf til marktækrar aukningar á frumu 8-oxoG var mun hærri en IC50 (7,01 μM) úr in vitro prófinu. Þetta var líklega vegna mismunar á næmi greininganna tveggja. Ónæmisflúrljómandi litun er mun minna næm en in vitro ensímgreiningin; ennfremur er fjöldi hemla sameinda sem geta náð og haft samskipti við frumu MTH1 undir áhrifum af flóknum líffræðilegum ferlum; að auki, í in vitro prófinu, er minna uppáhalds dGTP notað sem hvarfefni, og þess vegna getur verið auðveldara (taka færri hemla) að hamla MTH1, sem leiðir til lægra IC50 í in vitro prófinu.

Cellular {{0}}oxoG er myndað af ROS, sem er andoxunarefni. Þannig myndi aukning á frumu ROS eða bæling á virkni andoxunarefna einnig leiða til hækkunar á frumu 8-oxoG stigi. Echinacoside sjálft er öflugt andoxunarefni44,45 og ætti því að auka frekar en bæla virkni andoxunarefna. Til að kanna hvort frumustig ROS hafi breyst með Echinacoside meðferð voru sömu krabbameinsfrumurnar meðhöndlaðar með 0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM eða 80 μM Echinacoside í 5 klukkustundir, 12 klukkustundir eða 24 klukkustundir og síðan greindar með flæði frumugreining eftir litun með flúrljómandi rannsakanda 2',7'-díklórflúorescein díasetati. Niðurstöðurnar sýndu að engin þessara meðferða breytti frumu ROS stigi (Mynd 2C og D). Þannig hefur aukið 8-oxoG gildi frumu líklega stafað af hömlun Echinacoside á MTH1.

Echinacoside olli víðtækum DNA-skemmdum sérstaklega í krabbameinsfrumum. Innlimun {{0}}oxoG í DNA mun örva BER og MMR, sem mynda einstrengja DNA-brot (SSB) og bil.16,17 Venjulega eru þessi brot, og eyður eru innsiglaðar með viðgerðaraðferðum sem fela í sér fyllingu bils og bindingu með DNA pólýmerasum og ligasa.46,47 Hins vegar getur hröð aukning á frumu SSB mettað viðgerðargetu frumunnar, sem leiðir til myndunar fjölmargra tvístrengja DNA brota (DSB)18 og DDR merki. Til að kanna hvort Echinacoside-framkölluð aukning á frumu 8-oxoG valdi DNA skemmdum, skoðuðum við einn af fyrstu merkjum DNA skemmda, 53BP1, sem binst stöðum á DSB sem elstu frumuviðbrögð við DSB.48 The MG -63, SK-HEP-1, MCF-7 og SW480 krabbameinsfrumulínur og krabbameinsfrumulínurnar í eðlilegri lifur L-O2,49 mannafósturnýra HEK 293 og mústrefjafrumuefni NIH /3T3 voru meðhöndluð með 0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM eða 80 μM Echinacoside í 5 klukkustundir, 12 klukkustundir eða 24 klukkustundir. Flúrljómandi ónæmislitun sýndi að meðferð með 60 μM Echinacoside í 24 klukkustundir jók sérstaklega fjölda frumna með fimm eða fleiri sterklitaða kjarna 53BP1 brennipunkta í öllu krabbameini en ekki í neinum frumulínum sem ekki eru krabbamein (mynd 2E og F). Marktæk aukning á fjölda 53BP1 plús frumna sást strax 5 klukkustundum eftir að meðferð með Echinacoside hófst (Mynd 2F). Hærri styrkur (80 μM) af Echinacoside eða lengri meðferðartími (12 klst. og 24 klst.) leiddi til meiri aukningar á bæði fjölda 53BP1 plús frumna (Mynd 2F) og fjölda frumu 53BP1 brennipunkta. Saman benda þessar niðurstöður til þess að hömlun Echinacoside á MTH1 valdi 8-oxósöfnun og víðtækum DNA-skemmdum í krabbameini en ekki í frumum sem ekki eru krabbamein.

Echinacoside bælir fjölgun krabbameinsfrumna

Í hjólreiðum frumum munu óviðgerðir DNA strengarbrot valda hruni á DNA afritunargafflum, sem mun síðan leiða til stíflu á frumufjölgun með því að framkalla frumuhringsstopp og frumudauða.50 Til að athuga áhrif Echinacoside á frumuvöxt og frumufjölgun, höfum við fyrst greindi vöxt Echinacoside-meðhöndlaðra MG-63, SK-HEP-1, MCF-7 og SW480 krabbameinsfrumna með nýlendumyndunarprófi. Niðurstöðurnar sýndu að krabbameinsfrumurnar sem voru meðhöndlaðar með 60 μM eða 80 μM Echinacoside mynduðu mun færri þyrpingar og þyrpingarnar sem mynduðust voru mun minni (Mynd 3A og B), sem gefur til kynna mjög bældan vaxtarmöguleika. Næst greindum við útbreiðslu þessara krabbameinsfrumna ásamt L-O2, HEK 293 og NIH/3T3 ókrabbameinsfrumum með MTT prófi. Niðurstöðurnar sýndu að Echinacoside hamlaði skammtaháð útbreiðslu krabbameins en ekki krabbameinsfrumum (Mynd 3C). Tímaferlisrannsókn á krabbameinsfrumum sem voru meðhöndluð með 60 μM Echinacoside sýndi að eftir 5 klst. var enginn marktækur munur á hópum sem ekki voru meðhöndlaðir og meðferðarhópar, en eftir 12 klst var útbreiðslu krabbameinsfrumna marktækt hamlað með 60 μM Echinacoside (Mynd 3D).

Echinacoside framkallaði frumuhringsstopp

Í samræmi við athuganir á frumuvexti og frumufjölgun sýndi Western blot greining að 24 klst. meðferð með 60 μM og 80 μM Echinacoside jók verulega próteinmagn G1 /S-CDK blokkarans og DNA nýmyndunarhemils p21Cip/ WAF1 í MG-63, SK-HEP-1, MCF-7 og SW480 krabbameinsfrumum (Mynd 4A og B). Þar að auki, svipað og 53BP1, sást marktæk aukning á p21 próteinimagni strax 5 klukkustundum eftir að Echinacoside meðferð hófst (Mynd 4B). Greining á fjölda frumna á mismunandi stigum frumuhringsins með frumuflæðismælingu leiddi í ljós að Echinacoside meðferð skammtaháð minnkaði hlutfall frumna í bæði S og G2 /M fasa, en hlutfall frumna í G1 fasa jókst (Mynd 4C og D). Eftir 80 μM Echinacoside meðferð á MG-63 frumum í 24 klukkustundir fækkaði frumum í G2/M fasa úr 15 prósentum í næstum núll og frumum í S fasa fækkaði úr 37 prósentum í 17 prósent, en frumum í G0/ 1 áfangi jókst úr 43 prósentum í 80 prósent (Mynd 4E). Þessar niðurstöður benda til þess að meðferð með Echinacoside hafi valdið stöðvun frumuhrings og hindrað krabbameinsfrumurnar í G1 fasanum.

Echinacoside framkallaði apoptosis í krabbameinsfrumum

Í samræmi við athuganir á frumufjölgun sýndi Western blot greining að meðferð með 60 μM og 80 μM Echinacoside í 24 klukkustundir jók gildi virks kaspasa-3 og klofins pólý (ADP-ríbósa) pólýmerasapróteina í krabbameinsfrumurnar (Mynd 5A og B), sem bendir til örvunar á kaspasaháðri frumudauða. Við skoðuðum síðan nokkur frumumerki fyrir frumudauða. Í fyrsta lagi kom í ljós kjarnaformgerð Echinacoside-meðhöndlaðra krabbameinsfrumna með litun með DNA litarefninu DAPI, sem sýndi að 24 klst. meðferð með 60 μM og 80 μM Echinacoside jók fjölda einkenna apoptosis, þ. ) (Mynd 5C). Í öðru lagi var DNA sem var dregið úr krabbameinsfrumum sem fengu svipaða meðferð greint með rafdrætti á agarósageli, sem leiddi í ljós dæmigert apoptósísk stigamynstur (Mynd S1B). Að lokum greindist frumuvirkur kaspasi-3 með ónæmisflúrljómandi litun, sem sýndi sterk virkjað kaspasa-3 merki í Echinacoside-meðhöndluðum krabbameinsfrumum (Mynd S1C). Næst var hlutfall apoptotic frumna mælt með Annexin V-FITC og PI tvöföldu litun og frumuflæðismælingu. Greining á frumum sem voru meðhöndlaðar með 0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM, 80 μM eða 160 μM Echinacoside í 2 klst., 5 klst., 12 klst. eða 24 klst sýndi að 60 μM eða hærri þéttni af völdum Echinacoapsíða MG-63, SK-HEP-1, MCF-7 og SW480 krabbameinsfrumurnar (Mynd 6A), en ekki í krabbameinsfrumunum L-O2, HEK 293 og NIH/3T3. (Mynd S2). Eftir meðferð á MG-63 frumum með 60 μM, 80 μM eða 160 μM Echinacoside í 24 klukkustundir jókst hlutfall apoptotic frumna úr 8,89 prósentum í 33,72 prósent, 39,01 prósent og 48,12 prósent (Agur) í sömu röð. . Tímaferlisrannsóknin sýndi að eftir 5 klukkustundir var enginn marktækur munur á hópum sem ekki voru meðhöndlaðir og meðferðarhópar, en marktæk frumuddrun sást eftir meðferð með 60 μM eða hærri styrk Echinacoside í 12 klukkustundir (myndir 6B og S3).

Að lokum sýndi mæling á hvatberahimnugetu með JC-1 flúrljómandi litarefni greinilega áberandi tap á hvatberahimnugetu eftir meðferð með 60 μM Echinacoside í 12 klukkustundir (Mynd 6C), en ekki eftir 5 klukkustundir, sem gefur til kynna virkjun á innri frumufrumuleiðin í kjölfar DNA-skemmda af völdum hækkaðs 8-oxodG.