Útsetning dísilútblásturs breytir tjáningu neta sem tengjast taugahrörnun í heila sebrafiska Part 2

Undirbúningur próteinssýnis

Til að undirbúa próteinsýni voru hausarnir frá 80 til 100 svæfðum lirfum (5 pdf) vandlega einangraðir og skolaðir með PBS áður en þeir voru fluttir yfir í leysistuðpúða sem samanstóð af 15% forkældu TCA/asetoni sem innihélt 0,07% beta-merkaptóetanól (ME) )og próteasahemla kokteil (þarfaframleiðandi) í heildarrúmmáli 500 ul.

Á undanförnum árum hefur verið töluverður áhugi á áhrifum próteinsýna á minni. Sífellt fleiri eru farnir að átta sig á mikilvægi mataræðis fyrir heilsuna, sérstaklega mikilvægu hlutverki próteina í mannslíkamanum.

Prótein eru grunnbyggingarefni mannslíkamans og þau gegna mikilvægu hlutverki í mannslíkamanum. Vegna þessa hafa próteinsýni orðið mikilvægur farvegur fyrir marga í leit sinni að heilsu og fegurð. Auk þess að byggja upp vöðva og móta líkamann geta próteinsýni einnig bætt minni einstaklingsins.

Sumir vísindamenn hafa rannsakað samband próteina og minnis. Þeir komust að því að langtíma neysla á nægilegu próteini er gagnleg fyrir alla þætti líkamlegrar heilsu, sérstaklega minni. Það eru vaxandi vísbendingar um að próteinneysla í fæðu hafi mikilvæg áhrif á heilastarfsemi og minni.

Prótein er mikilvægur þáttur í taugafrumum í heila mannsins og því hefur dagleg próteinneysla mikilvæg áhrif á minni og hugsunargetu fólks. Langtíma próteinneysla uppfyllir ekki aðeins próteinþörf líkamans heldur hjálpar heilanum einnig að vera virkur og heilbrigður.

Að auki getur prótein einnig hjálpað líkamanum að viðhalda jafnvægi blóðsykurs og viðhalda stöðugu skapi. Þetta er mjög mikilvægt til að viðhalda minni og hugsunarfærni. Þess vegna getur hófleg inntaka próteina hjálpað til við að bæta ýmsa vitræna starfsemi og tilfinningalegt ástand mannslíkamans.

Á heildina litið er sterkt samband á milli próteinsýna og minnis. Að auka próteinneyslu þína hjálpar til við að halda heila þínum og líkama heilbrigðum, bæta hugsunarhæfileika og minni. Fyrir fólk sem þarf að bæta minnið er mjög nauðsynlegt að neyta viðeigandi magns af próteini. Við ættum að borða próteinfæði á viðeigandi hátt og huga að sanngjörnum máltíðum til að viðhalda heilbrigðum líkama og skörpum huga. Það má sjá að við þurfum að bæta minni og Cistanche deserticola getur bætt minnið verulega, því Cistanche deserticola hefur andoxunar-, bólgueyðandi og öldrunaráhrif, sem geta hjálpað til við að draga úr oxun og bólguviðbrögðum í heilanum og vernda þar með heilsu taugakerfisins. Að auki getur Cistanche deserticola einnig stuðlað að vexti og viðgerð taugafrumna og þannig aukið tengsl og virkni tauganeta. Þessi áhrif geta hjálpað til við að bæta minni, nám og hugsunarhraða og geta einnig komið í veg fyrir þróun vitsmunalegrar truflunar og taugahrörnunarsjúkdóma.

Smelltu á vita bætiefni til að auka minni

Eftir stutta einsleitun voru prótein felld út í 12 klst við 20 gráður, fylgt eftir með skilvindu við 12,000 snúninga á mínútu í 5 mínútur við 4 gráður. Yfirvatnið var fjarlægt og próteinkúllan var þvegin tvisvar með köldu asetoni (innihélt 0.07% ME og próteasahemla kokteila). Loka próteinkúllan var leyst upp í lýsisbuffi sem innihélt 7,0 M þvagefni, og 2,0 M thiourea með hljóðjónun á ís.

Uppleystu próteinsýnin voru skilin í skilvindu við 15,000 snúninga á mínútu í 10 mínútur við 4 gráður til að fella út óleysanlegar agnir og styrkur lokapróteinsýnanna var mældur með Bradford-aðferðinni.

TMT-undirstaða próteómfræðigreiningar með miklum afköstum

Sýni voru minnkað, alkýleruð og melt með því að bæta við trypsíni og lys-C próteasa í röð. Peptíð voru síðan merkt með 10-plexTMT ísóbarískum merkjum samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. Merktum sýnum var blandað saman og síðan sundrað fínt með öfugum fasagreiningu með háu pH.

Einstök brot voru síðan greind með LC–MS/MS með því að nota öfuga fasagreiningu á netinu og tandem massagreiningu á Thermofsher Fusion Lumos massagreiningarmæli. Gögn voru aflað með MS3 aðferðinni sem byggir á samstilltu forveravali, eins og áður hefur verið lýst (McAlister o.fl. 2014). Gagnagrunnsleit og útdráttur upplýsinga um TMT fréttaritara var framkvæmd með því að nota MaxQuant hugbúnaðarvettvang (Cox og Mann 2008).

Samanburður á TMT gögnum yfir sýni var gerður með því að nota MSStats (Choiet al. 2014). Umritunargreining Um það bil 80–100 höfuð voru einangruð úr svæfðum fósturvísum (120 klst.), þvegin með PBS og látin fara í heildar RNA útdrátt með Trizol (Sigma Aldrich, Saint Louis , USA) hvarfefni samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda.

Gæði og magn RNA voru metin með NanoDrop2000 litrófsmæli (Thermo Scientific, MA) og ennfremur með Agilent 2100 Bioanalyzer til að tryggja lágmarksstyrk 50 ng/ul og RNAheilleikatölu (RIN) 8. Bókasafnsundirbúningur var síðan framkvæmdur með Illumina HiSeq4 til000according4 siðareglur: „TruSeqStranded Total RNA Library Prep workflow withRibo-Zero Gold,“ og sýnin voru raðaðir við eftirfarandi skilyrði: „Pared End run,R1=75 cycles (antisense strand), Index=8 cycles, R2=75 hringir (skynja streng)."

Gagnagreining

Bæði gagnasöfn fyrir prótein- og umritarannsóknir voru samtímis hlaðið upp og greind með því að nota nettólið Metascape, sem gerir ráð fyrir genaskýringum fyrir ýmsar tegundir, þar á meðal Danio rerio (Zhou o.fl. 2019). greind með notkun hugvitsbrautagreiningar (IPA) hugbúnaðar (Krämer o.fl. 2014).

Gagnasett sem innihalda gena- eða próteinauðkenni og samsvarandi tjáningargildi var hlaðið inn í forritið. Hvert auðkenni var kortlagt á samsvarandi hlut sinn í þekkingargrunni Ingenuity.

Tjáningarbreytingarmörk upp á 1.3-falt var stillt til að bera kennsl á sameindir þar sem tjáningu var stýrt með mismunandi hætti. Virk greining benti á líffræðilegar aðgerðir og/eða sjúkdóma sem voru mikilvægastir fyrir gagnasafnið. Sameindir úr gagnasafninu sem stóðust viðmiðunarmörkin og tengdust líffræðilegum virkni voru tekin til greina við greiningu. Nákvæmt próf Right-tailedFisher var notað til að reikna út p-gildi sem ákvarðar líkurnar á því að hver líffræðileg virkni og/eða sjúkdómur sem er úthlutað til þess gagnasetts sé vegna tilviljunar eingöngu.

Ferðagreining

Til að meta framlag breytinga á sniði hvors próteómsins umbrots í sérstökum ferlum var báðum gagnasöfnunum hlaðið upp í IPA hugbúnaðinn (Krämer o.fl. 2014). Helstu marktæku breyttu kanónísku leiðirnar voru síðan metnar frekar og túlkaðar með PCR og western blotting eins og lýst er hér að neðan.

Vestur þrykk

Alls 25 µg af próteinum var hlaðið á 12%NuPAGE (Novex, CA) og flutt á PVDFmembranes (Novex, CA) eins og lýst er (MahmoudianSani o.fl. 2017; Rafee o.fl. 2019). Himnur voru stíflaðar með 5% undanrennu í Tris-bufferedsaline og 0,01% tween 20 (TBST buffer) í 30 mín við stofuhita og síðan ræktaðar yfir nótt við 4 gráður með annað hvort kanínu fjölstofna and-Cyp1A1 (Abcam, CA) eða músa einstofna and-GAPDH( Abcam, CA), þynnt í TBST jafnalausn sem inniheldur 1% undanrennu.

Eftir þvott í TBST voru blettirnir ræktaðir með efri asna-anti-kanínu-HRP (Abcam, CA) eða geita-anti-mús-HRP (Santa Cruz, CA) mótefnum í 2 klst., fylgt eftir með þróun með Pierce™ ECL Plus vestrænu blotting hvarfefni ( Thermo Fisher Scientific, Bandaríkjunum). Hljómsveitirnar voru sýndar með myndgreiningu með LI-COR skanni og greindar með þéttleikamælingu (LI_COR Biosciences, NE).

Rauntíma PCR

Heildar-RNA var einangrað úr hausunum með því að nota TRIzol hvarfefni (Sigma Aldrich, Saint Louis, Bandaríkjunum) eftir leiðbeiningum framleiðanda og síðan mæld með NanoDrop 2000 litrófsmæli (Thermo Scientific, MA). Magn upp á 1 ug af hverju RNA sýni var öfugt umritað með iScript™ öfugumritunar ofurblöndu (Bio-Rad, CA), önnur rauntíma PCR var framkvæmd með því að nota SsoAdvancedUniversal SYBR Green ofurblöndu (Bio-Rad, CA), og grunnarnir eru skráðir í viðbótartöflu 1. Hlutfallslegt tjáningarstig var reiknað með 2−ΔΔCT aðferðinni og tölfræðilega T-prófið var notað til að meta marktækan mun.

Niðurstöður og umræður

Próteomic og transcriptomic greiningar eru tvö helstu verkfæri til að skilja sameindakerfin sem liggja að baki sjúkdómsferlum og svörun við umhverfisáreitum (Duan o.fl. 2017; García-Estrada o.fl.2013; Jami o.fl. 2014a, b, 2015; Kosalková o.fl.2012) . Hér gerðum við djúpa tjáningargreiningu bæði á umritunar- og próteómískum stigum í höfði sebrafiskafósturvísa sem verða fyrir DEPe.

Höfuð, sem eru aðallega samsett úr heilavef, voru einangruð til að útrýma tjáningarsniði annarra vefja vegna þess að við höfum áhuga á að ákvarða innri sjúklega feril miðtaugakerfisins.

Tjáningarsnið hausa sebrafiskahembryos

Prófílgreining leiddi til 11.172 greindra próteina og 14.748 mRNA-markmiða af meira en 26,000 kóðagenum (Howe o.fl. 2013). Meðal 11.172 próteina sem auðkennd voru úr TMT-merktu sýnunum (viðbótartafla 2), var 141 prótein marktækt uppstýrt og 607 lækkað (viðbótartafla 3 og mynd 1a). Að sama skapi var 367 umritum stýrt upp og 149 voru lækkuð meðal 14.748 afrita (viðbótartafla 4) sem greindust í RNA-seq greiningu (mynd 1b og viðbótartafla 5).
Í flestum tilfellum voru niðurstöður úr uppstýrðu próteóma- og umritunargreiningum í samræmi. Til dæmis eru efst mjög uppstýrðu próteinin meðal annars cýtókróm P450 Cyp1a, Cyp1c1, Guaninenucleotide-bindandi prótein undireiningu gamma, Annexin, Plexin B2b stutt ísóform, dehýdrógenasa/redúktasa (SDR fjölskyldu) meðlimur 13-eins og 1, S-mótefnavaka sjónhimnu/heilakirtils (arrestin) b, og Sulfotransferase6B1.

Sömuleiðis innihalda gen með hæstu umritunarstjórnunina cýtókróm P450 (Cyp1a), chemokine (C–C mótíf) bindill 27a, arýl-vetniskolefnisviðtakabæli A, cýtókróm P450 (Cyp1b), og Rh fjölskyldu C glýkóprótein. voru ekki alltaf í mikilli fylgni.

Til dæmis eru Complexin 2, Spectrin alpha, Cardiac myosin light chain-1, SEC23 víxlverkandi prótein, ATPsynthase himnuundireining EA, Cytókróm b og NAD-háður prótein deacetylasi meðal efstu mjög niðurstýrðu próteina, en ytri hluta himnuprótíns 1a , uppleyst burðarefnisfjölskylda 5 (joðíðflutningsefni), FBJ murine osteosarcoma veiru krabbameinsgena homolog B, complexin 4c, FOSlike mótefnavaka 1a, opsín 1 og v-fos sýna hæstu niðurstýringu umritunar (Tafla 1 og 2).

Mótefni sem þekkja sebrafiskprótein eru takmörkuð, en við staðfestum sýnishorn af þessum breytingum með Western blot-greiningu. Uppstjórnun Cyp1A próteins og niðurstýring Complexin 2 (CPLX2) voru staðfest með því að nota GAPDH sem hleðslustjórnun (mynd 2a). Hærra magn af TAT og UGT1B1 umritun og lægra magn af CHNRB og TH2 var einnig staðfest með qPCR með því að nota Elf-alfa sem innri stjórn (mynd 2b).

Genaskýring

Það eru til nokkur lífupplýsingatól á netinu og hugbúnaður sem getur veitt gagnlegar upplýsingar án athugasemda. Meðal þeirra var Metascape, með möguleikanum á genaskýringum fyrir Danio rerio (Zhouet al. 2019), notað í þessu verki.

Bæði gagnasöfn fyrir prótein- og umritunarrannsóknir voru samtímis hlaðið upp og greind með því að nota þetta nettól. Eftir að hafa sameinað framleiðslu bæði prótein- og umritunarbreytinga í hugbúnaðinum, voru nokkrir ferlar eins og svörun við útlendingaörvun, umbrot útlendingalyfja með cýtókróm P450, og dægurtjáningarstjórnun á genatjáningu. komu fram við DEPe meðferð (mynd 3a).

Þessi greining benti einnig til að bæla gildi líffræðilegra ferla eins og "Sjónskynjun", "Myndflutningur" og "G-prótein-tengd viðtaka innbyrðis." Breytingarnar á sjóntengdum tjáningarsniðum voru ekki óvæntar þar sem DEPe meðferð við snemma þroska leiddi til smærri augna (gögn ekki sýnd).

Merkjaboð um útlendingaefnaskipti

Xenobiotics, sem eru framandi náttúruleg eða tilbúin efnasambönd, geta kallað fram streituviðbrögð frumna, sem leiðir til aðgreiningar, fjölgunar, frumudauða eða dreps. Reyndar þarf líkaminn að verja sig á virkan hátt gegn útlendingalyfjum, og einnig eitruðum innrænum efnasamböndum og umbrotsefnum þeirra, með tjáningu ensíma og flutningsefna sem taka þátt í brotthvarfi þeirra og afeitrun.

Þessi ensím eru flokkuð í þrjá hópa: FaseI ensím (CYP, ALDH, FMO) sem koma skautum inn í útlendingalyfið; Fasa II ensím (UGT,GST, SULT) sem kynna vatnssækni með samtengingu vatnssækinna sameinda eins og súlfat, glúkúrónsýru og glútaþíon við útlendingalyfið; og III. stigs ensím (MDR1, OATP2, MRP) sem flytja útlendingalyfið eða samtengingar II sem myndast við Pha til utanfrumusvæðisins.

Þessi ensím eru framkölluð með merkjakaskada sem felur í sér sértæka viðtaka (CAR, PXR, AHR) og MAPK-miðlaða virkjun á umritunarþáttum (NRF2, MAF) (Omiecinski o.fl. 2011).

Þar sem virkjanir eru ekki til, er stofnvirki viðtakinn (CAR) staðsettur í umfrymi sem flókið með CCRP og HSP90. En þegar virkjunarefni er til staðar, færist CAR yfir í kjarnann og binst RXR til að mynda heterodimer og binst enn frekar nokkrum afbrigðum af endurteknu mótífinu, svo sem DR3, DR4, ER6 og ER8, og stuðlar að stjórnun erfðatjáningar (viðbótartafla 2).

Próteinfræðigreining okkar leiddi í ljós virkjun útlendingaefnaskipta. Reyndar sýnir skýr uppstýring CYP1A1, CYP3A7, HMOX1 (hem súrefnisasa 1), CAT (katalasi) og CES1 (karboxýlesterasa 1) örvun á fasa I umbrotum, en aukin tjáningu á UGT1A1 (UDP glúkúrónósýltransferasa fjölskyldu 1 meðlimur A1 og GSTP1) glutathioneS-transferase pi 1) gefur til kynna virkjun á fasa II umbrotum.

Athyglisvert er að niðurstýring súlfattransferasa eins og SULT1A1 (súlfótransferasafjölskyldu 1A meðlimur 1), SULT1C2 (súlfótransferasafjölskyldu 1C meðlimur 2) og SULT2B1 (súlfótransferasa fjölskyldu 2B meðlimur 1) bendir til þess að aukið vatnssækni í fasa II umbrotum með efnaskiptum í II. , en ekki súlfat samtengingu (mynd 4).

Niðurstöður umritunarrannsóknarinnar eru nokkuð samræmdar þar sem CYP1A, CYP1B, CYP3A7, GSTO1, GSTP1 og UGT1A1 eru öll uppstýrð á theRNA-gildum. Hins vegar sýnir SULT2B1 uppstjórnun á RNA stigi (meðan það er vantáknað á próteinmagni).

Þetta getur stafað af þátttöku annarra aðferða sem valda niðurbroti eða óvirkjun á súlfattransferasasímum við meðferð með DEPe. Það sem kemur sérstaklega á óvart er að þessar breytingar á útlendingaefnaskiptum áttu sér stað í hausum (væntanlega heila) fisksins. Tjáningu útlendinga gena hefur verið lýst í taugakerfi spendýra, en þetta er fyrsta skýrslan um þau í heila sebrafiska (McMillan og Tyndale 2018).

Þessar niðurstöður eru í samræmi við svipaða rannsókn sem gerð var af Shankar og félögum sem prófuðu áhrif mismunandi hópa umhverfis fjölhringa arómatískra kolvetna (PAH) á þróun fósturvísa og metin frekar áhrif hvers meðferðaráætlunar á umritasniðið.

Á öllum líkamanum 48 fósturvísa eftir frjóvgun (hpf) sýndu þeir að uppstjórnun Cyp1a bæði við umritunar- og próteingildi væri snemma áreiðanlegur lífmerki fyrir útlendingafræðilega AHR virkjun og niðurstreymis umritabreytingar (Shankar o.fl. 2019).

NRF2-miðlað oxunarálagssvörun

Oxunarálag getur komið af stað frumudauða og drepi og er talið taka þátt í taugahrörnun (Ahmadinejad o.fl. 2017; Jami o.fl. 2014b, 2015). Stór frumuvarnarviðbrögð við oxunarstreitu er framkalla andoxunarefna og afeitrunarsíma.

Nuclear factor-erythroid 2-tengdur þáttur 2(Nrf2) binst frumefnum andoxunarefna (ARE) og virkjar umritun þeirra. Óvirkt Nrf2 tengist aktínbindandi próteiniKeap1 og er haldið í umfryminu.

Kveikt af oxunarálagi er Nrf2 fosfórýlerað sem svar við próteinkínasa C, fosfatidýlinositól 3-kínasa og MAP kínasa ferlum. Fosfórýlerað Nrf2 getur síðan færst yfir í kjarnann og bundið AREtil að virkja afeitrunar- og andoxunarensím (viðbótartafla 3) (Ma 2013).

For more information:1950477648nn@gmail.com