Smíði nýrra hitastöðugra bóluefna fyrir arfgerð VII Newcastle sjúkdómsveiru

Ágrip: Arfgerð VII Newcastle Disease Virus (NDV) hefur valdið heimsfaraldri í mörgum löndum og veldur venjulega banvænum afleiðingum hjá sýktum kjúklingum. Þrátt fyrir að núverandi veiklað NDV bóluefni í atvinnuskyni geti veitt fullkomna vörn gegn arfgerð VII NDV, geta þau ekki komið í veg fyrir sýkingu og veirulosun að fullu og arfgerð sumra bóluefnisstofna getur ekki samsvarað ríkjandi stofni. Í þessari rannsókn, til þess að smíða hitastöðugt og arfgerð VII-samsvörun lifandi, veiklað bóluefni, notuðum við hitastöðugan meinvirkan HR09 stofn af arfgerð VIII sem burðarás og skiptum F geninu út fyrir arfgerð VII DT-2014 stofninn. Á sama tíma var klofningsstaður F gensins í DT-2014 stökkbreyttur í flokk IF prótein og æðakljúf flokks II F prótein, í sömu röð. Niðurstöðurnar sýndu að vírusveirurnar tvær, sem heita rcHR09-CI og rcHR09-CII, deildu svipuðum vaxtarhvörfum og hitastöðugleika með HR09 stofni móður sinnar. Meðaldánartími (MDT) og sjúkdómsstuðull í heila (ICPI) sýndu að vírusveirurnar tvær voru mjög veiklaðar. Þó að bæði chimeric NDVs og La Sota bóluefnisstofninn gæti veitt bólusettum kjúklingum fullkomna vernd gegn áskorun meindýra arfgerð VII ZJ1 stofnsins, gætu tveir chimeric NDVs framkallað hærra stig mótefnasvörunar gegn ZJ1 stofni og gætu dregið verulega úr veirulosun samanborið við La Sota bóluefnisstofn. Að lokum smíðaði rannsókn okkar tvo hitastöðuga arfgerð VII samsvörun NDV bóluefnisframbjóðendur, sem veittu fullkomna vörn gegn áskorun illvígrar arfgerð VII NDV.

cistanche tubulosa-bæta ónæmiskerfið

Lykilorð: Newcastle Disease Virus; hitastöðugleiki; arfgerð VII samsvörun chimeric veira; F prótein; skilvirkni verndar; veirulosun

1. Inngangur

Newcastle Disease Virus (NDV), orsakavaldur Newcastle Disease (ND), tilheyrir ættkvíslinni Orthoavulavirus í undirættinni Avulavirinae af fjölskyldunni Paramyxoviridae [1]. NDV hefur neikvætt, einþátta RNA erfðamengi, sem kóðar núkleóprótein (N), fosfóprótein (P), fylkaprótein (M), samrunaprótein (F), hemagglutinin-neuraminidasa prótein (HN) og stórt prótein (L) ) [2]. Byggt á þróun NDV stofna er hægt að skipta NDV í tvo flokka: annar er flokki I veirur, með erfðamengi stærð 15.198 núkleótíð; önnur eru veirur af flokki II, með stærð erfðamengisins 15.186 eða 15.192 [3]. Byggt á sjúkdómsvaldandi eiginleika þess hefur NDV verið flokkað í þrjár meingerðir: lentogenic, mesogenic og velogenic [4]. Hægt er að flokka NDV í tvo flokka, annar er flokkur I NDV sem er aðallega einangraður frá villtum fuglum og er alltaf illgjarn fyrir hænur. Hinn er flokkur II NDV, sem hefur fundist í húsfuglum og villtum fuglum, þar á meðal bæði illvígum og illvígum stofnum [1,5,6]. F prótein NDV er fyrst myndað sem óvirkur undanfari, F0, sem er frekar klofið í tvær virkar F1 og F2 undireiningar með hýsilfrumu próteasa [7]. Virka F próteinið getur miðlað samruna veiru- og frumuhimna [8]. Vísindamenn hafa komist að því að klofningsstaður mótíf F próteins er einnig vísbending um meinvirkni NDV. Greint var frá því að meinvirknistofninn fyrir kjúklinga sýndi klofningsstað mótíf 112R/KR-QK/RR↓F 117, en lág meinvirk NDVs hafa mótíf 112G/EK/R-QG/ER↓L 117 á sama svæði [9,10]. Þess vegna er breyting á klofningsstað mótíf F próteins skilvirk leið til að draga úr meinvirku NDV [11,12]. Þrátt fyrir mikilvægu hlutverki sínu í meinvirkni NDV, er F próteinið einnig stór þáttur í verndandi ónæmi arfgerðarsamhæfðra bóluefna [13]. Hitaþolið vírusbóluefni getur auðveldað geymslu þess og flutning, sérstaklega í sumum afskekktum héruðum þar sem frystikeðjuflutningar eru ekki tiltækir. Áður var náttúrulegur hitastöðugur NDV stofn, nefndur HR09, einangraður í rannsóknarstofu okkar og gat haldið smitandi í meira en eina klukkustund undir 56 ◦C meðferð [14]. Eftir það, með því að nota öfugt erfðakerfi, kom í ljós að leifarnar 315 og 369 í HN próteininu voru ábyrgar fyrir hitaþolsgetu þess [15]. Þar sem HR09 er illgjarn stofn, stökkbreyttum við klofningsstað hans á F próteini úr 112RRQKR↓F 117 í illgjarn mótíf 112GRQGR↓L 117 með því að nota öfugt erfðakerfi og komumst að því að raðbrigða vírusinn rHR09 gæti veitt fullkomna vörn gegn áskorun genotype VII NDV meinvirkur stofn [16]. Þar að auki var veiklað HR09 notað frekar sem bóluefnisferja til að tjá HA genið af H9N2 undirtegund fuglainflúensuveiru (AIV), sem einnig veitti fullkomna vörn gegn áskorun H9N2 AIV [17]. Í þessari rannsókn, til að smíða hitastöðugt og arfgerð VII-samhæft NDV veiklað bóluefni, notuðum við hitastöðugan arfgerð VIII NDV meinvirkan HR09 stofn sem burðarás og skiptum F gen þess út fyrir arfgerð VII DT-2014 stofninn. Á sama tíma var klofningsstaður F gensins í DT-2014 stökkbreyttur í flokk I NDV F prótein og þyrping flokks II NDV F prótein, í sömu röð. Niðurstöðurnar sýndu að vírusveirurnar tvær deildu svipaðri vaxtarhvörf og hitastöðugleika og HR09. Að auki sýndu meðaldánartími (MDT) og sjúkdómsstuðull innan heila (ICPI) að vírusveirurnar tvær tilheyrðu illkynja stofni. Báðar gætu þær framkallað mikla mótefnasvörun gegn sjálfum sér og arfgerð VII ZJ1 stofni í bólusettum kjúklingum, gætu dregið verulega úr útskilnaði veiru og veitt fulla vörn gegn þeim sem þjást af ZJ1 stofni. Niðurstaðan er sú að rannsóknin okkar veitir tvo hitastöðuglega bóluefnisframbjóðendur fyrir arfgerð VII NDV.

Kostir cistanche tubulosa-styrkja ónæmiskerfið

Smelltu hér til að skoða Cistanche Enhance Immunity vörur

【Biðja um meira】 Netfang:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2. Efni og aðferðir

2.1. Frumur og vírusar

BSR-T7/5 frumur, sértæk frumulína úr BHK frumum sem geta tjáð T7 RNA pólýmerasa, eru ræktaðar með Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM, Gibco) bætt við 15% fóstursermi (Pan Biotech, Þýskalandi) og 1% penicillin-streptomycin (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Bandaríkjunum) við 37 ◦C í 5% CO2 útungunarvélinni. Sérstök sjúkdómsvaldalaus (SPF) fósturvísuð kjúklingaegg, sem hægt er að nota til að fjölga NDV, eru keypt frá Beijing Boehringer Ingelheim Vital Biotechnology Co., Ltd. Hitastöðug arfgerð VIII NDV HR09 stofn (MF285077.1) og arfgerð VII ZJ1 eru á lager í rannsóknarstofu okkar.

2.2. Plasmíð smíði

Plasmíðið, nefnt pNDV/rHR09, var smíðað með því að klóna erfðamengisröð arfgerð VIII HR09 í fullri lengd með stökkbreytingunni í F próteini í TVT7R (0.0) vektor [16]. F genið af arfgerð VII DT-2014 stofninum, sem hafði mikla líkingu við ríkjandi arfgerð VII NDV stofna, var magnað og stökkbreytingar á klofningsstöðum þess mynduðust með staðstýrðri stökkbreytingu. Síðan var F geninu í pNDV/rHR09 skipt út fyrir stökkbreytta DT-2014 F genið. Allar grunnraðir sem notaðar eru í rannsókninni eru fáanlegar sé þess óskað.

2.3. Björgun á raðbrigða vírus

Í þessari rannsókn var tveimur bóluefnisbundnum NDV bóluefnisframbjóðendum bjargað eins og áður hefur verið lýst [18]. Helstu aðferðum er lýst hér að neðan: Í fyrsta lagi NDV plasmíð í fullri lengd sem innihéldu klofningsstaðina stökkbreyttu F genið af NDV DT-2014, nefnd pNDV/rcHR09-CI og pNDV/rcHR{{4} }CII, voru umbreyttir með hjálparplasmíðunum þremur pCI-NP, pCI-P og pCI-L með því að nota Lipofectamine 3000 hvarfefni (Thermo Fisher Scientific, USA) samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. Í öðru lagi var þvagleggsvökvanum úr SPF-fósturvísuðum kjúklingaeggjum bætt við 12 klst. og 36 klst. eftir flutning, í sömu röð. Í þriðja lagi var heilu frumulýsunum safnað 72 klst eftir flutning og sett í þrisvar sinnum frystingu/þíðingu. Að lokum var frumulýsunum sprautað í 10-dagsgömul SPF fósturvísuð kjúklingaegg í 3-5 daga, og þvagleggsvökvanum var safnað saman og HA prófað með tilliti til tilvistar bjargðra NDVs.

2.4. RT-PCR og QRT-PCR

RNA var dregið út með því að nota TRIzol hvarfefni (Merck, Darmstadt, Þýskalandi) úr þvagleggsvökvanum sem safnað var úr sýktum fósturvísuðum kjúklingaeggjum og síðan umritað aftur í cDNA með því að nota PrimeScript™ 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Takara, Peking, Kína). Full lengd NDV erfðamengisröðarinnar sem bjargað var var mögnuð upp með því að nota 10-par primers (fáanlegt sé þess óskað). Magn veirulosunar var magnmælt með algeru magni rauntíma RT-PCR með Life Technology tæki. Í stuttu máli var sýnum úr strokuþurrku og barkaþurrku safnað 3- og 5-dögum eftir áskorun (dpc), síðan var RNA dregið út, öfugt umritað í cDNA og sett í magnbundið rauntíma PCR (QRT-PCR) fyrir magngreiningu á veirulosun. Magn veirulosunar var reiknað út sem meðaltal ± SD af mRNA stigi allra strokanna sem safnað var. Grunn- og rannsakaraðirnar sem notaðar eru til að greina veirulosun eru fáanlegar ef óskað er eftir því.

cistanche tubulosa-bæta ónæmiskerfið

2.5. Veiruvaxtarferill

Vaxtarhvörf mismunandi NDVs voru mæld í 10-dagsgömlum fósturvísuðum hænsnaeggjum. Í stuttu máli voru NDVs þynnt og sprautað í 10-dagsgömul fósturvísuð kjúklingaegg með allantoic sáningu. Þvagblöðruvökvanum var safnað 24-, 48-, 72- og 96-klst. eftir sýkingu. EID50 hvers sýnis var reiknað með Reed og Muench aðferðinni [19].

2.6. Hitaþolspróf

Hitastöðugleiki hverrar veiru var mældur eins og áður hefur verið lýst [18]. Í stuttu máli var hver vírus með 108 EID50 títra við 0,1 ml í hverju hettuglasi settur í vatnsbað með 56 ◦C, síðan var sýnunum safnað við 10-, 20-, {{ 8}}, 40-,50- og 60-mín. eftir ræktun. Að lokum var vírustítrinn mældur með EID50 aðferðinni.

2.7. Ákvörðun um meinsemi og stöðugleika

Meinvirkni hverrar veiru var metin með því að nota meðaldánartíma (MDT) próf í 10-dagsgömlum SPF fósturvísuðum kjúklingaeggjum eins og áður hefur verið lýst [20,21]. Í stuttu máli var safnað þvagblöðruvökvi hvers kímerísks NDV stofns þynnt úr 10-6 til 10-9 í 10-faldri röð og sprautað í 10-dagsgömul SPF fósturvísuð kjúklingaegg með 5 í hverjum hópi ræktuð með 100 L af hverri þynningu. Síðan voru ögruðu fósturvísuðu kjúklingaeggin ræktuð við 37 ◦C og kertuð í samtals 7 daga. Dauði hvers hóps var skráður og MDT gildið var reiknað út. Að auki var ICPI prófið á 1-dagsgömlum SPF kjúklingum einnig mælt til að kanna meinvirkni chimeric veirunnar. Í stuttu máli var chimeric veiran þynnt í 10-faldri röð með PBS og sprautað í 1-dagsgömul SPF fósturvísuð hænsnaegg. Ræktuðu eggin voru kertuð í samtals 8 daga og ICPI gildið var reiknað út. Til að meta stöðugleika tveggja chimeric NDVs, var þeim fjölgað í 10-dagsgömlum SPF fósturvísuðum kjúklingaeggjum með allantoic sáningu í samtals 20 leiðum, síðan voru MDT og ICPI gildi valinna leiða mæld.

2.8. Kjúklingabólusetning og áskorun

Alls 48 8-dagsgömlum SPF kjúklingum var skipt af handahófi í fjóra hópa og þrír hópar voru sáðir með 106 EID50 af rcHR09-CI, rcHR09-CII og La Sota stofni í 100 µL DMEM um augnleiðina, í sömu röð. Kjúklingunum í samanburðarhópnum var sprautað með 100 µL DMEM. Sermi bólusettra kjúklinga var safnað 7-, 14- og 21 dögum eftir bólusetningu (dpi) til að ákvarða mótefnatítra. Við 21 dpi voru kjúklingarnir smitaðir með 105 EID50 NDV arfgerð VII ZJ1 stofni í gegnum auga. Kúpu- og munnkoksstrokunum var safnað 3- og 5-daginn eftir áskorun (dpc) til frekari greiningar á veirulosun. Klínísk einkenni og dauðsföll voru skráð á hverjum degi þar til 14 dpc.

2.9. Ákvörðun mótefna í sermi

Mótefnatítrinn gegn NDV var mældur með hemagglutination inhibition (HI) aðferð eins og áður hefur verið lýst [22].

2.10. Siðferðisyfirlýsing

Ónæmisaðgerðir og áskorun kjúklinganna voru samþykktar af stofnananefnd dýraumönnunar og -notkunar Yangzhou háskólans (nr. YZUDWLL-201904-002; Dagsetning: 4. febrúar 2019).

cistanche ávinningur fyrir karla styrkir ónæmiskerfið

2.11. Tölfræðigreining

Gögnin eru sýnd sem meðaltal ± staðalfrávik (SDs), og þau voru fengin úr þremur endurteknum. Tölfræðileg marktækni milli mismunandi hópa var greind með t-prófunaraðferð nemandans með GraphPad Prism 7.0 hugbúnaði (La Jolla, CA, USA). (* p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001).

3. Úrslit

3.1. Skýringarmynd fyrir smíði tveggja chimeric NDVs

Arfgerð VII NDV er dreift um allan heim og veldur oft banvænum afleiðingum fyrir hænur og aðra næma fugla [23]. Áður einangruðum við hitastöðugan arfgerð VIII NDV HR09 stofn, sem getur viðhaldið smithættu í meira en 60 mínútur þegar hann er ræktaður við 56 ◦C [14]. Í þessari rannsókn, til þess að búa til hitastöðugt, veiklað bóluefni gegn NDV arfgerð VII, notuðum við HR09 sem burðarás og skiptum F geninu út fyrir VII DT-2014 stofn; á sama tíma voru klofningsstaðirnir það stökkbreyttir úr 112RRQRR↓F 117 í flokk I NDV F prótein klofningsstaði 112ERQER↓L 117 og avirulent stofninn af flokki II NDV F prótein klofningsstöðum 112GRQGR↓L 117 sem innihalda fulla lengd af plasmíðum. HR09 erfðamengið með stökkbreytta F próteininu var tilgreint sem prcHR09-CI og prcHR09-CII, í sömu röð (Mynd 1).

mynd 1. Skipulagsáætlun fyrir smíði tveggja kímerískra NDV. F geninu af arfgerð VIII hitastöðuga HR09 stofninum var skipt út fyrir stökkbreytt F gen af ​​arfgerð VII DT-2014 stofni.

3.2. Smíði Chimeric NDV rcHR09-CΙ og rcHR09-CⅡ

Til að smíða kímeru vírusana voru plasmíðin prcHR09-CI eða prcHR09-CII samsmituð með hjálparplasmíðunum þremur, pCI-NP, pCI-P og pCI-L í BSR-T7/5 frumur , sem getur tjáð T7 RNA pólýmerasa. 72 klst. síðar var allt frumulýsið safnað og sprautað í 10-dagsgömul SPF-fósturvísuð egg, og þvagleggsvökvanum var safnað 4 dögum eftir ræktun. Til að athuga klofningsstaði tveggja björgunar kímerískra vírusa, var PCR tilraun F gensins framkvæmd og afurðirnar voru gerðar raðgreiningar; niðurstöðurnar sýndu að klofningsstaðirnir voru stökkbreyttir í 112ERQER↓L 117 í rcHR09-CI (Mynd 2A) og 112GRQGR↓L 117 í rcHR09-CII (Mynd 2B), sérstaklega. Að lokum var erfðamengi í fullri lengd tveggja hitastöðugustu chimeric NDVs magnað með því að nota 10 pör af primerum og niðurstöðurnar sýndu að bæði rcHR09-CI (Mynd 2C) og rcHR09-CII (Mynd 2D) innihéldu erfðamengi NDV í fullri lengd. Sameiginlega sýndu þessi gögn fram á að tvær hitastöðugustu chimeric vírusarnir voru smíðaðir með góðum árangri.

Mynd 2. Smíði og staðfesting á kímerískum NDV rcHR09-CI og rcHR09-CII. Heildar-RNA af björguðum veirum var dregið út og öfugt umritað í cDNA, F genið af rcHR09-CI (A) og rcHR09-CII (B) var magnað og stillt á raðgreiningu. Full lengd kímerískra NDV rcHR09-CI (C) og rcHR09-CII (D) var mögnuð með því að nota 10 pör af frumurum og S1–S10 eru framsetning þeirra.

3.3. Líffræðilegir eiginleikar chimeric NDV rcHR09-CI og rcHR09-CII

Til að athuga hvort skipti á F geninu hafi áhrif á afritun NDV, voru vaxtarhreyfingar framkvæmdar í 10-dagsgömlum fósturvísuðum kjúklingaeggjum með því að mæla EID50 þeirra. NDVs voru þynnt og ræktuð í 10-dagsgömlum fósturvísuðum kjúklingaeggjum og þvagblöðruvökvanum var safnað saman við 24-, 48-, 72- og 96- h eftir ræktun. Niðurstöður EID50 sýndu að bæði björgunarhimnu rcHR09-CI og rcHR09-CII deildu svipaðri vaxtarhvörf með HR09 stofni foreldra sinna (Mynd 3A), sem sýndi að skipting F gens hafði engin áhrif um afritun HR09.

Mynd 3. Líffræðilegir eiginleikar chimeric NDV rcHR09-CI og rcHR09-CII. (A) Tveir kímerísku NDV rcHR09-CI og rcHR09-CII hafa svipaða vaxtarhvörf og móðurstofninn HR09. Vaxtarferill tveggja chimeric vírusa og móðurstofns þeirra HR09 voru mældir með EID50 aðferðinni í 10-dagsgömlum SPF fósturvísuðum hænsnaeggjum. (B) Tveir kímerísku NDV rcHR09-CI og rcHR09-CII deila hitastöðugleikanum með HR09. Samtals 108 EID50 af NDV rcHR09-CI, rcHR09-CII, HR09 og La Sota stofnum voru ræktaðir í 56 ◦C fyrir 10-, 20-, {{21 }}, 40-, 50- og 60-mín., í sömu röð. Síðan voru títrar fjögurra NDVs mældir með EID50 aðferðinni.

Þar sem HR09 stofninn var hitastöðugur NDV stofn, var einnig kannað hvort skipti á F próteini hefði áhrif á hitastöðugleika þess. Hver kímerísk vírus og HR09 með sama vírustítra (108 EID5{{50}}) voru meðhöndlaðir með 10-, 20- , 30-, 40-, 50- og 60-mín. undir 56 ◦C. Síðan var vírustítrinn mældur með því að framkvæma EID50 prófun. Niðurstöðurnar sýndu að kímerísku vírusarnir tveir og foreldrastofninn HR09 gætu haldist smitandi í meira en 60 mínútur, á meðan óhitaþoli La Sota stofninn var bara smitandi í ekki meira en 20 mínútur (Mynd 3B). Þessi gögn gáfu til kynna að kímerísku vírusarnir rcHR09-CI og rcHR09- 218 CII væru enn hitastöðugir. Í þessari rannsókn var F geninu í VIII HR09 skipt út fyrir stökkbreytta F genið af VII DT- 2014 til að fá tvö veiklað chimeric NDVs. Til að meta meinvirkni chimeric rcHR09-CI og rcHR09-CII voru MDT og ICPI gildin greind. Niðurstöðurnar sýndu að MDT gildi allra tveggja chimeric NDVs var stærra en 120 klst. Sem viðmiðunargildi var MDT gildi HR09 foreldris stofns þeirra 57,6 klst. ICPI gildi rcHR09-CI og rcHR09-CII voru núll, sem viðmiðunargildi var ICPI fyrir HR09 1,8 (tafla 1). Meinvirkni NDV byggt á MDT-gildi hefur verið flokkuð í þrjá hópa: velogenic (undir 60 klst), mesogenic (60-90 klst) og lentogenic (meira en 90 klst.). Á sama tíma er ICPI-gildi einnig algeng viðmiðun til að ákvarða meinvirkni NDV: hraðfallandi (undir 60 klst.), mesogenic (60-90 klst.) og lentogenic (meira en 90 klst.): hraðamyndandi (1,5–2,0), mesogenic (0,7 klst. –1,5), og lentogenic (0,0–0,7) [24]. Samanlagt sýna þessi gögn fram á að bæði bjargað kímerískt rcHR09-CI og rcHR09-CII voru mjög veikt með því að breyta klofningsstöðum F próteins.

Tafla 1. Mat á sjúkdómsvaldandi áhrifum og stöðugleika tveggja chimeric NDVs (alls 20 rásir).

Að auki greindist stöðugleiki tveggja chimeric NDVs með því að rækta í 20 göngum í 10-dagsgömlum fósturvísuðum hænueggjum og göngur 10 og 20 voru valdir til að mæla MDT og ICPI gildi. Niðurstöðurnar sýndu að MDT gildin í leið 10 og leið 20 voru öll stærri en 120 klst. og ICPI gildin í leið 10 og leið 20 voru öll núll (tafla 1). Þessi gögn sýndu að eftir 20 leið í 10-dagsgömlum fósturvísuðum kjúklingaeggjum, höfðu MDT og ICPI gildi tveggja kímerískra NDVs engan marktækan mun, sem sýndi fram á að tveir björguðu kímeru NDVs voru tiltölulega stöðugir.

3.4. Hár HI mótefnatítur var framkallaður eftir bólusetningu á kímerískum NDVs

Til að kanna hvort ónæmisaðgerðir á björgunarhimnu NDV gæti framkallað mótefnasvörun í kjúklingum, var 48 8-dagsgömlum SPF kjúklingum skipt í fjóra hópa. Mismunandi hópar voru sáð með 106 EID50 af rcHR09-CI, rcHR09-CII, La Sota stofni, eða 100 µL DMEM í sömu röð. Sermi bólusettra kjúklinga var safnað á 7-, 14- og 21 dögum eftir bólusetningu (dpi) til að ákvarða HI mótefnatítra. HI mótefni safnaðs sermi gegn bólusetta NDV stofninum sýndi að enginn marktækur munur var á sermi rcHR09-CI, rcHR09-CII og La Sota í 7 dpi. Þar að auki, með tímanum, jókst HI mótefnatítrinn í sermi upp á 14 og 21 dpi og það var enginn marktækur munur á hópunum þremur (Mynd 4A)

Mynd 4. Chimeric vírusarnir framkalluðu mikið mótefnasvörun. SPF kjúklingarnir voru bólusettir með 106 EID50 rcHR09-CI, rcHR09-CII, og La Sota stofni bóluefnisins í sölu í gegnum augnleiðina, í sömu röð. Sermiinu var safnað á 1-, 2- og 3 vikum eftir bólusetningu, mótefnatítrinn var mældur með HI aðferðinni gegn þeim sjálfum (A) og kross HI mótefnatíterinn gegn ZJ1 (B). (ns: enginn marktækur munur; * p < 0,05; ** p < 0,01).

Að auki var krossviðbragðs HI mótefnatíterinn gegn ZJ1 stofninum greindur til að auka ónæmisáhrif kímerískra NDVs gegn arfgerð VII NDV. Niðurstöðurnar sýndu að það var enginn marktækur munur á NDV bólusettu hópunum þremur í 7 dpi og HI mótefnatítrinn fór vaxandi með tímanum. Ólíkt HI mótefnatítrinum gegn bólusettum stofni, voru HI mótefnatítrar gegn ZJ1 stofni rcHR09-CI- og rcHR09-CII-ónæmishópa marktækt hærri en La Sota bólusetti hópurinn og rcHR 09-CI hópur framkallaði hæsta HI mótefnatítrann meðal þessara þriggja hópa (Mynd 4B).

3.5. Dregið var úr veirulosun þegar bólusettu hænurnar voru ögraðar með meinvirkum arfgerð VII ZJ1 stofni

Í þessari rannsókn voru bólusettu SPF hænurnar ögraðar með arfgerð VII ZJ1 stofni til að meta verndandi áhrif chimeric vírusa gegn arfgerð VII NDV. Við 21 dpi voru bólusettu hænurnar ögraðar með 105 EID50 ZJ1 stofni, og skikkju- og munnkoksþurrkur úr öllum ögruðu kjúklingum hvers hóps var safnað 3- og 5-dagana eftir áskorun (dpc ) til að greina veirulosun. Niðurstöðurnar sýndu að bólusetning rcHR09-CI, rcHR09-CII og La Sota hópa gæti dregið úr veirulosun í húðþurrku (Mynd 5A, C) og munnkoksþurrkur við {{11} } og 5-dpc (Mynd 5B, D) samanborið við samanburðarhópinn. Samanborið við La Sota hópinn var veirulosun í tveimur kímerískum NDVs marktækt minni en í La Sota bólusettum hópum, sem sýndi fram á að tveir kímeru NDVs höfðu betri verndandi skilvirkni en La Sota stofninn gegn ögrun af arfgerð VII NDV.

Mynd 5. QRT-PCR magngreining á NDV ZJ1 losun í ögruðum kjúklingum. Kjúklingarnir fengu 1{{10}}6 EID50 NDV arfgerð VII ZJ1 stofn 21 dögum eftir bólusetningu. Stofnaþurrkunarsýnum (A,C) og munnkoksþurrkunarsýnum (B,D) var safnað 3- og 5-dögum eftir áskorun og magn NDV ZJ veirulosunar var magnmælt með QRT- PCR. Gildi voru sýnd sem meðalgildi ± staðalfrávik (meðaltal ± SD) í hverjum hópi. (ns: enginn marktækur munur; * p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001).

3.6. Tveir Chimeric NDVs veittu fulla vörn gegn áskorun arfgerð VII ZJ1 stofns

Vegna þess að ögrun af arfgerð VII ZJ1 stofni getur leitt til banvænna afleiðinga, að undanskildum greiningu á veirulosun, var dauði smitaðra kjúklinga einnig skráð á hverjum degi þar til 14 daga. Niðurstöðurnar sýndu að allar kjúklingar í samanburðarhópnum sýndu klínísk einkenni andlegs þunglyndis, öndunarfærasjúkdóma, niðurgangs og drápust við 5- til 6-dpc, og engin klínísk merki voru og engar kjúklingar dauður í rcHR{ {4}}CI, rcHR09-CII og La Sota hópar þar til 14 dpc (Mynd 6), sem sýndi fram á að allir chimeric NDVs og La Sota bóluefnisstofnar gætu veitt fulla vörn gegn ögrun arfgerð VII NDV.

Mynd 6. Chimeric NDV rcHR09-CI og rcHR09-CII veita fulla vörn gegn áskorun ZJ1. Þremur vikum eftir bólusetningu var 106 EID50 ZJ1 stofnum skorað á hænurnar. Fylgst var með lifunarstöðu í samtals 14 daga.

4. Umræður

Þrátt fyrir að margs konar NDV bóluefni séu notuð í heiminum, gerist ND enn víða um heim. Eitt vandamál gæti verið að arfgerð bóluefnisstofnsins passar ekki við ríkjandi stofn. Þessi arfgerðar-ósamræmdu bóluefni geta veitt nokkra vörn gegn áskorun illvígra NDVs; þó geta þeir ekki verndað hænurnar gegn sýkingu og geta ekki dregið úr veirulosun á áhrifaríkan hátt [25,26]. Flokkur II arfgerð VII NDV er aðal arfgerð sem er ríkjandi í Miðausturlöndum, Afríku og Asíu; hins vegar eru bóluefnin sem notuð eru á þessum stöðum venjulega arfgerð II La Sota og B1 stofnar, sem eru ekki sama arfgerð og algengar stofnar [27-29]. Í þessari rannsókn, til að búa til hitastöðugan arfgerð VII-samhæfðan bóluefnisframbjóðanda, var hitastöðugur arfgerð VIII HR09 stofn notaður sem burðarás, og tveir bóluefnisframbjóðendur sem passa við arfgerð VII voru smíðaðir til að uppfylla þörfina fyrir bóluefni fyrir arfgerð VII. Hingað til hafa margir hitastöðug NDV bóluefnisframbjóðendur verið þróaðir. Fyrsti hitastöðugleiki NDV V4 var einangraður frá kjúklingum árið 1966 [30]. V4 var náttúrulegur lentogenic stofn og niðurstöður greiningargreiningar sýndu að hann tilheyrði arfgerð II NDV. Ólíkt V4, var hitastöðugi stofninn HR09 sem notaður var í rannsókn okkar tilheyrandi illvígum stofni [14]. Ef við viljum taka það í klíníska notkun, þá er það fyrsta sem þarf að gera að ákveða hvernig á að gera það sem illkynja stofn. Þökk sé þróun hins öfuga erfðakerfis hefur bygging NDV bóluefnisframbjóðenda sem passa arfgerð með illkynja arfgerð náð verulegum framförum. Þar sem sýnt hefur verið fram á að klofningsstaður F próteins er aðal meinvirkniákvarðandi NDV [31], er einföld leið til að búa til veiklaða NDV að skipta klofningsstað F próteins í meinvirka stofninum út fyrir klofningsstaðinn fyrir avirulent stofninn. Á sama tíma hefur verið greint frá því að F próteinið sé mikilvægt ónæmisvaldandi prótein sem gæti framkallað hlutleysandi mótefni til að vernda bólusettu hænurnar gegn áskorun illvígra NDV [32-34]. Að auki var greint frá því að klofningsstaður NDV gæti haft áhrif á ónæmissvörun í bólusettum kjúklingum [11]. Í þessari rannsókn skiptum við út F geninu í hitastöðugu HR09 fyrir F genið af NDV arfgerð VII meindýrum DT-2014 stofni; á sama tíma voru klofningsstaðir DT-2014 einnig stökkbreyttir í þá sem eru af afirulent NDV stofnum af flokki I og flokki II, í sömu röð (Mynd 1).

cistanche tubulosa-bæta ónæmiskerfið

Eins og búist var við sýndu niðurstöður meinsemdarákvörðunar að báðir tveir kímerísku hitastöðugustu NDV eru mjög veikt (tafla 1). Á sama tíma kom einnig í ljós að báðir tveir chimeric NDVs sýndu svipaða vaxtarhvörf og foreldra HR09 stofninn þeirra (Mynd 3A). Þar sem HN próteinið var aðalpróteinið sem var ábyrgt fyrir hitastöðugleika HR09, héldu tveir chimeric NDVs enn hitastöðugleikanum alveg eins og foreldra HR09 stofninn þeirra (Mynd 3B). Margar rannsóknir hafa greint frá því að NDV bóluefni sem samsvarar arfgerð geti framkallað hærra stig ónæmissvörunar í húmor og er skilvirkara við að draga úr útskilnaði veiru en ólíkt bóluefni, þrátt fyrir að bæði arfgerðarsamsvörun og misleit bóluefni geti verndað sýktu hænurnar gegn augljósum klínískum einkennum og dauði [35–37]. Í þessari rannsókn var HI mótefnatítur mældur við 7-, 14- og 21-dpi, niðurstöður mótefnatítra gegn bólusettu lestinni sýndu að enginn marktækur munur var á milli rcHR{ {13}}CI, rcHR09-CII og La Sota stofnar (Mynd 4A), á meðan HI mótefnið gegn arfgerð VII ZJ1 stofninum sýndi að tveir hitastöðugustu chimeric NDVs framkalluðu marktækt hærra magn en La Sota stofninn, og meðal allra þriggja bólusettra NDVs, rcHR09-CI framkallaði hæsta magn HI mótefna (Mynd 4B). Þessi niðurstaða var í samræmi við fyrri skýrslur um að klofningsstaður F próteins gæti haft áhrif á ónæmissvörun bóluefnisframbjóðenda í kjúklingum. Arfgerð VII ZJ1 áskorunartilraunin sýndi að allir þrír bólusettu hóparnir sýndu marktæka minnkun á veirulosun samanborið við samanburðarhópinn, og tveir kímerískt hitastöðug NDV gátu dregið úr veirulosun á skilvirkari hátt en La Sota stofninn (Mynd 5). Lifunarferillinn sýndi að allir rcHR09-CI, rcHR09-CII og La Sota stofnar gætu veitt fullkomna vörn gegn áskorun ZJ1 stofnsins (Mynd 6). Samanlögð sýndu þessi gögn að tveir arfgerð VII samsvörun NDV sem smíðuð voru í þessari rannsókn gætu veitt skilvirka vörn gegn áskorun arfgerð VII ZJ1 stofns, og gætu dregið úr losun veirunnar á skilvirkari hátt en La Sota stofninn. Í stuttu máli, þessi rannsókn smíðaði tvo hitastöðuga kímeríska NDV bóluefnisframbjóðendur, sem nýta hitastöðuga arfgerð VIII NDV meinvirka HR09 stofninn sem burðarás og skiptu F gen þess út fyrir arfgerð VII DT-2014 stofninn. Á sama tíma breyttist klofningsstaður F próteins í DT-2014 úr 112RRQRR↓F 117 í 112ERQER↓L 117 og 112GRQGR↓L 117, í sömu röð. Tveir kímerísku NDVs varðveita hitastöðugleika HR09 og meinvirknipróf MDT og ICPI gefa til kynna að þau hafi tekist að veikjast. Bæði kímerísku NDVs gætu framkallað mikið mótefnasvörun, dregið verulega úr veirulosun og veitt fullkomna vörn gegn áskorun meindýrs arfgerðar VII ZJ1 stofns.

Heimildir

1. Dimitrov, KM; Abolnik, C.; Afonso, CL; Albina, E.; Bahl, J.; Berg, M.; Briand, FX; Brown, IH; Choi, KS; Chvala, I.; o.fl. Uppfært sameinað flokkunarkerfi og endurskoðað flokkunarkerfi fyrir Newcastle-veikiveiru. Smitast. Genet. Evol. 2019, 74, 103917. [CrossRef] [PubMed]

2. de Leeuw, O.; Peeters, B. Heill núkleótíðaröð Newcastle-veikiveiru: Vísbendingar um tilvist nýrrar ættkvíslar innan undirættarinnar Paramyxovirinae. J. Gen. Virol. 1999, 80 Pt 1, 131–136. [Krossvísun]

3. Czeglédi, A.; Ujvári, D.; Somogyi, E.; Wehmann, E.; Werner, O.; Lomniczi, B. Þriðji erfðamengisstærðarflokkur fugla paramyxoveiru sermisgerð 1 (Newcastle-veiki veira) og þróunarfræðilegar afleiðingar. Virus Res. 2006, 120, 36–48. [Krossvísun]

4. Ganar, K.; Das, M.; Sinha, S.; Kumar, S. Newcastle-sjúkdómsveiran: Núverandi staða og skilningur okkar. Virus Res. 2014, 184, 71–81. [Krossvísun]

5. Kabilov, MR; Alikina, TY; Yurchenko, KS; Glushchenko, AV; Gunbin, KV; Shestopalov, AM; Gubanova, NV Heildar erfðamengisraðir tveggja Newcastle veirustofna sem einangraðir voru úr villiönd og dúfu í Rússlandi. Erfðamengi tilkynnt. 2016, 4, e01348-16. [Krossvísun]

6. Ren, S.; Xie, X.; Wang, Y.; Tong, L.; Gao, X.; Jia, Y.; Wang, H.; Fan, M.; Zhang, S.; Xiao, S.; o.fl. Sameindagreining á Newcastle-veiki veirustofni af flokki I sem var einangraður úr dúfu í Kína. Avian Pathol. 2016, 45, 408–417. [Krossvísun]

7. Morrison, TG Uppbygging og virkni paramyxoveiru samrunapróteins. Biochim. Lífeðlisfræði. Acta 2003, 1614, 73–84. [Krossvísun]

8. Bossart, KN; Fusco, DL; Broder, CC Paramyxovirus innganga. Adv. Exp. Med. Biol. 2013, 790, 95–127. [Krossvísun]

9. Collins, MS; Bashiruddin, JB; Alexander, DJ Dregnar úr amínósýruröðum á klofningsstað samrunapróteins Newcastle-veikiveira sem sýna breytileika í mótefna- og sjúkdómsvaldandi áhrifum. Arch. Virol. 1993, 128, 363–370. [Krossvísun]

10. Panda, A.; Huang, Z.; Elankumaran, S.; Rockemann, DD; Samal, SK Hlutverk samrunapróteins klofningsstaðar í meinvirkni Newcastle-veikiveiru. Örvera. Pathog. 2004, 36, 1–10. [Krossvísun]

11. Kim, SH; Chen, Z.; Yoshida, A.; Paldurai, A.; Xiao, S.; Samal, SK Mat á samrunapróteini klofningsstaðaröðum Newcastle-veikiveiru í bóluefnum sem passa við arfgerð. PLoS ONE 2017, 12, e0173965. [CrossRef] [PubMed]

12. Manoharan, VK; Varghese, BP; Paldurai, A.; Samal, SK Áhrif samrunapróteins klofningsstaðaröðar á myndun arfgerðar VII Newcastle-veikiveirubóluefnis. PLoS ONE 2018, 13, e0197253. [CrossRef] [PubMed]

13. Kumar, S.; Nayak, B.; Collins, PL; Samal, SK Mat á Newcastle-veiki veirunni F og HN próteinum í verndandi ónæmi með því að nota raðbrigða fugla paramyxoveiru tegund 3 ferju í kjúklinga. J. Virol. 2011, 85, 6521–6534. [CrossRef] [PubMed]

14. Cao, Y.; Liu, Q.; Zhang, X.; Hu, H.; Wu, Y. Heill erfðamengisröð af hitaþolnum Newcastle-sjúkdómsveirustofni HR09. Erfðamengi tilkynnt. 2017, 5, e01149-17. [CrossRef] [PubMed]

15. Ruan, B.; Zhang, X.; Zhang, C.; Du, P.; Meng, C.; Guo, M.; Wu, Y.; Cao, Y. Leifar 315 og 369 í HN próteini stuðla að hitastöðugleika Newcastle-sjúkdómsveiru. Framan. Örverur. 2020, 11, 560482. [CrossRef] [PubMed]

16. Ruan, B.; Liu, Q.; Chen, Y.; Niu, X.; Wang, X.; Zhang, C.; Guo, M.; Zhang, X.; Cao, Y.; Wu, Y. Myndun og mat á bóluefnisframbjóðanda af veiklaðri og hitaþolnum arfgerð VIII Newcastle-sjúkdómsveiru. Poult. Sci. 2020, 99, 3437–3444. [Krossvísun]

17. Zhang, X.; Bó, Z.; Meng, C.; Chen, Y.; Zhang, C.; Cao, Y.; Wu, Y. Myndun og mat á raðbrigðum hitastöðuglegum Newcastle-sjúkdómsveiru sem tjáir HA af H9N2 fuglaflensuveiru. Veirur 2021, 13, 1606. [CrossRef]

18. Wen, G.; Chen, C.; Guo, J.; Zhang, Z.; Shang, Y.; Shao, H.; Luo, Q.; Yang, J.; Wang, H.; Wang, H.; o.fl. Þróun nýrrar hitastöðugrar Newcastle-veiki veiru bóluefnisferju til tjáningar á ólíku geni. J. Gen. Virol. 2015, 96, 1219–1228. [Krossvísun]

19. LaBarre, DD; Lowy, RJ. Umbætur á aðferðum til að reikna út veirutítramat frá TCID50 og skellugreiningum. J. Virol. Aðferðir 2001, 96, 107–126. [Krossvísun]

20. Alexander, DJ Newcastle-sjúkdómur og aðrar fugla-paramyxovírusar. Séra Sci. Tækni. Alþj. Af. Faraldur. 2000, 19, 443–462. [Krossvísun]

21. Yu, XH; Cheng, JL; Xue, J.; Jin, JH; Söngur, Y.; Zhao, J.; Zhang, GZ Hlutverk pólýmerasatengdra próteingena í meinvirkni Newcastle-sjúkdómsveiru. Framan. Örverur. 2017, 8, 161. [CrossRef] [PubMed]

22. Maamary, J.; Array, F.; Gao, Q.; García-Sastre, A.; Steinman, RM; Palese, P.; Nchinda, G. Newcastle-sjúkdómsveira sem tjáir HIV-gag-prótein sem miðar á dendritic frumur framkallar öflugt gag-sértækt ónæmissvörun í músum. J. Virol. 2011, 85, 2235–2246. [CrossRef] [PubMed]

23. Eið, AAM; Hussein, A.; Hassanin, O.; Elbakrey, RM; Daines, R.; Sadeyen, J.-R.; Abdien, HMF; Chrzastek, K.; Iqbal, M. Newcastle Disease Arfgerð VII Algengi í alifuglum og villtum fuglum í Egyptalandi. Veirur 2022, 14, 2244. [CrossRef] [PubMed]

24. Hejazi, Z.; Tabatabaeizadeh, SE; Toroghi, R.; Farzin, H.; Saffarian, P. Fyrsta uppgötvun og lýsing á undirarfgerð XIII.2.1 Newcastle-veikiveiru einangruð frá hænum í bakgarði í Íran. Dýralæknir. Med. Sci. 2022, 8, 2521–2531. [CrossRef] [PubMed]

25. Tsai, HJ; Chang, KH; Tseng, CH; Frost, KM; Manvell, RJ; Alexander, DJ Mótefnavaka og arfgerð einkenni Newcastle-veiki veira einangruð í Taívan á milli 1969 og 1996. Dýralæknir. Örverur. 2004, 104, 19–30. [Krossvísun]

26. Kapczynski, DR; King, DJ Vernd kjúklinga gegn augljósum klínískum sjúkdómum og ákvörðun veirulosunar í kjölfar bólusetningar með Newcastle-veikiveirubóluefnum sem fáanleg eru í verslun við ögrun við mjög illvíga veiru frá framandi Newcastle-sjúkdómsfaraldri í Kaliforníu 2002. Bóluefni 2005, 23, 3424–3433. [CrossRef] [PubMed]

27. Cho, SH; Kim, SJ; Kwon, HJ Erfðafræðileg röð af mótefnavaka afbrigði Newcastle-veikiveiru einangruð í Kóreu. Veiru gen 2007, 35, 293–302. [Krossvísun]

28. Khan, TA; Rue, CA; Rehmani, SF; Ahmed, A.; Wasilenko, JL; Miller, PJ; Afonso, CL Sýklafræðileg og líffræðileg einkenni einangra Newcastle-veikiveiru frá Pakistan. J. Clin. Örverur. 2010, 48, 1892–1894. [Krossvísun]

29. Liu, Y.; Sun, C.; Chi, M.; Wen, H.; Zhao, L.; Söngur, Y.; Liu, N.; Wang, Z. Erfðafræðileg einkenni og fylgjufræðileg greining á Newcastle-veikiveiru frá Kína. Smitast. Genet. Evol. 2019, 75, 103958. [Krossvísun]

30. Simmons, GC Einangrun Newcastle-veikiveiru í Queensland. Aust. Dýralæknir. J. 1967, 43, 29–30. [Krossvísun]

31. Toyoda, T.; Sakaguchi, T.; Imai, K.; Inocencio, NM; Gotoh, B.; Hamaguchi, M.; Nagai, Y. Uppbyggingarsamanburður á klofningsvirkjunarstað samruna glýkópróteinsins milli meinvirkra og illrænna stofna Newcastle-veikiveiru. Veirufræði 1987, 158, 242–247. [CrossRef] [PubMed]

32. Ding, L.; Chen, P.; Bao, X.; Li, A.; Jiang, Y.; Hu, Y.; Ge, J.; Zhao, Y.; Wang, B.; Liu, J.; o.fl. Raðbrigða garnabólguveirur sem tjá F-genið Newcastle-sjúkdómsveiru (NDV) vernda kjúklinga gegn banvænu NDV-áfalli. Dýralæknir. Örverur. 2019, 232, 146–150. [CrossRef] [PubMed]

33. Jia, W.; Zhang, X.; Wang, H.; Teng, Q.; Xue, J.; Zhang, G. Bygging og ónæmisvirkni raðbrigða kalkúnaherpesveiru bóluefnisstofns sem tjáir samrunaprótein af arfgerð VII Newcastle-veikiveiru. Dýralæknir. Örverur. 2022, 268, 109429. [CrossRef] [PubMed]

34. Shao, Y.; Sun, J.; Han, Z.; Liu, S. Raðbrigða smitandi barkakýlisbólguveiru sem tjáir Newcastle-veikiveiru F-prótein verndar kjúklinga gegn smitandi barkakýlisbólguveiru og Newcastle-veikiveiruáskorun. Bóluefni 2018, 36, 7975–7986. [Krossvísun]

35. Miller, PJ; King, DJ; Afonso, CL; Suarez, DL Mismunur á mótefnavaka milli Newcastle-veikiveirustofna af mismunandi arfgerðum sem notaðir eru í bólusetningarformi hefur áhrif á veirulosun eftir illvíga áreiti. Bóluefni 2007, 25, 7238–7246. [Krossvísun]

36. Mohamed, MH; Abdelaziz, AM; Kumar, S.; Al-Habib, MA; Megahed, MM Áhrif phylogenetic fjölbreytileika velogenic Newcastle-veiki veiru áskorun á veirulosun eftir einsleita og ólíka DNA bólusetningu í kjúklingum. Avian Pathol. 2016, 45, 228–234. [Krossvísun]

37. Wajid, A.; Basharat, A.; Bibi, T.; Rehmani, SF Samanburður á vernd og veirulosun eftir bólusetningu með Newcastle-veiki veirustofnum af mismunandi arfgerðum sem notaðir eru við bólusetningar. Trop. Anim. Heilsuframleiðsla. 2018, 50, 1645–1651. [Krossvísun]