Klónun, virkni auðkenning og tjáningargreining á Chalcone Synthasa frá Cistanche Tubulosa Ⅱ

3 Niðurstöður og greining

3.1 Klónun CtCHS gens

Fjórar raðir merktar sem „chalcone synthase“ voru skimaðar út með því að nota transcriptome gögn af Cistanches tubulosa blómum. Í gegnum Blast-samanburð NCBI kom í ljós að aðeins ein röð var með fulla lengd CHS gensins og hafði FPKM meira en 10. Sérstakir primers voru hannaðir út frá þessari röð og um 1200 bp brot fékkst með PCR mögnun með því að nota Cistanches tubulosa flower cDNA sem sniðmát (Mynd 1). PCR afurðin var endurheimt hlaup og tengd við pCE2TA/Blunt-Zero vektorinn. Niðurstöður raðgreiningar voru í samræmi við umritagreininguna. Genið fékk nafnið CtCHS. Röð lengd er 1173 bp og kóðar 390 amínósýrur.

Stuðningsþjónusta Wecistanche-Stærsti cistanche útflytjandi í Kína:

Netfang:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Sími:+86 15292862950

Verslaðu fyrir frekari upplýsingar:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

3.2 Lífupplýsingagreining á CtCHS

3.2.1 CtCHS eðlis- og efnafræðilegir eiginleikar og greining á himnusviði

Nethugbúnaðurinn ProtParam var notaður til að greina eðlis- og efnafræðilega eiginleika próteinsins sem CtCHS genið kóðaði. CtCHS kóðar 390 amínósýrur, sameindaformúlan er C1908H3041N511O562S22, hlutfallslegur mólmassi er 42 836.54, fræðilegi samrafmagn punkturinn er 5.85 og hann er óstöðugur. Stuðullinn II er 43,24, sem er óstöðugt prótein, og heildarmeðal vatnssækni (GRAVY) er -0,052, sem er vatnssækið prótein. Prot Scale nettólið var notað frekar til að greina vatnssækni prótein/vatnsfælni. Niðurstöður greiningarinnar sýndu að hámarksgildi CtCHS prótein vatnssækni/vatnsfælni var 2,422 (342) og lágmarksgildi var -2,489 (119). Amínósýrupeptíðkeðjan sem er kóðað af CtCHS geninu hefur fleiri vatnssæknar amínósýruleifar en vatnsfælin amínósýruleifar, svo það er vatnssækið prótein. Nethugbúnaðurinn TMHMM var notaður til að spá fyrir um himnubyggingu próteinsins. CtCHS próteinið hefur ekkert yfirhimnusvæði.

Mynd 1 PCR mögnun á CtCHS geni

3.2.2 Spá um aukabyggingu og háskólabyggingu CtCHS próteins

Nettólið SOPMA var notað til að spá fyrir um aukabyggingu próteina. Niðurstöðurnar eru sýndar á mynd 2-A. 44,87% -helices, 31,03% handahófskenndar spólur, 15,64% útbreiddar keðjur og 8,46% -blöð mynda aukabyggingu CtCHS próteinsins. stig uppbyggingu. Netgreiningarhugbúnaðurinn SWISS-MODEL var notaður til að spá fyrir um háskólabyggingu próteinsins og kristalbygging hrísgrjóna CHS1 var notuð sem sniðmát til að spá fyrir um þrívíddarbyggingu CtCHS próteinsins. Niðurstöðurnar eru sýndar á mynd 2-B. Samræmi milli Cistanche tubulosa CtCHS og hrísgrjóna CHS1 er 83,55%.

3.2.3 Samanburður á raðir og greiningu á fylgjutré og notkun

DNAMAN hugbúnaður framkvæmir samlíka samanburð á CtCHS og CHS amínósýruröðum annarra tegunda. Niðurstöðurnar eru sýndar á mynd 3-C. CtCHS amínósýruröðin er í samræmi við Sesamum indicum L. (XP_011091402.1) og Antirrhinum majus L. (P06515. 1), Mazus pumilus (NL Burman) Steenis (AAN05791.1), Erythranthe lewisiiG. L. Nesom & NS Fraga (AHJ80976.1), Perilla frutescens (L.) Britton (O04111.1 ) og Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. (NP_196897.1). Amínósýruraðir CHS eru mjög svipaðar, þar sem líkindin eru 90,93%, 90,68%, 90,18%, 89,42%, 89,42% og 81,61%.

NÁTTÚRLEGT LÍFRÆNT CISTANCHE EXTRAKT MEÐ 30% ECHINACOSIDE OG 12% ACTEOSIDE

Að auki sýndi margföld röð röðun einnig að CtCHS hefur varðveitt hvataleifar Cys164, His303 og Asn336. Til þess að skilja frekar þróunarlega stöðu Cistanche tubulosa CtCHS í plöntu CHS fjölskyldunni var MEGA-X hugbúnaður notaður til að smíða sýklatré milli CtCHS og CHS próteina annarra plantna. Niðurstöðurnar eru sýndar á mynd 3-DE lewisii AHJ80976.1) ElCHS er náskyld.

3.3 CtCHS dreifkjörnungatjáning og hreinsun

pET-28a-CtCHS plasmíðinu var umbreytt í E. coli tjáningarstofn BL21 (DE3) og próteintjáning var framkölluð af IPTG við lágan hita. Próteinið var hreinsað með nikkeljónasækni litskiljunarsúlu og hreinsaða próteinið var greint með 10% SDSPAGE. Niðurstöðurnar eru sýndar á mynd 3. CtCHS próteinbandið birtist nálægt 40,000, sem er í samræmi við hlutfallslegan mólmassa CtCHS próteinsins upp á 42.800.

3.4 CtCHS ensímvirknigreining

Til að bera kennsl á virkni CtCHS var hreinsað CtCHS prótein ræktað með malonyl-CoA, 4-cumaroyl-CoA og afurðirnar fundust með HPLC og MS. Við náttúrulegar aðstæður er naringenin-chalcone óstöðugt í lausn og er auðvelt að hringlaga í naringenin. Þess vegna voru naringenin-chalcone og naringenin valin sem staðlað viðmið.

Niðurstöður HPLC prófsins eru sýndar á mynd 4-A og B. Viðhaldstími ensímhvarfafurðarinnar er svipaður og naringenin staðallsins. Báðir hafa hámarks frásog við 289 nm í UV frásogsrófinu, sem er frábrugðið varðveislutíma naringenin-chalcone. Tími og UV frásogsróf voru mismunandi, en sem neikvæð viðmiðun innihélt afurðin eftir ræktun á háhitaóvirkjaða CtCHS próteininu með hvarfefninu ekki naringenin, chalcone og naringenin. Frekari greiningu með massarófsmælingu sýndi fyrsta stigs massarófið (Mynd 4-C, D) að ensímhvarfafurðin hefur [MH]-topp m/z271.060 97, en naringenin hefur [MH] ]-toppur m/z 271.060 91.

Þegar MS2 litrófið er borið saman (Mynd 5-E, F), hafa CtCHS ensímhvarfafurðin og naringenin bæði einkennandi brotatoppa við m/z 107, 151 og 177, sem er í samræmi við heimildaskýrsluna [19], sem gefur til kynna að CtCHS sé með kalkónakomplex. Ensímvirkni, það getur hvatt hvarf malónýl-CoA og 4-kúmaróýl-CoA í naringenin-chalcone.

3.5 Staðsetningargreining undirfrumu

Til þess að rannsaka hlutverk CtCHS próteins í frumum var pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS plasmíðið smíðað og umbreytt í Arabidopsis thaliana frumefni til að fylgjast með staðsetningu undirfrumu þess. Niðurstöðurnar eru sýndar á mynd 5. Sem viðmið var pCAMBIA1300-35S-GFP próteinið dreift í kjarna og umfrymi, en pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS samrunapróteinið var aðallega dreift í umfrymið, sem gefur til kynna að CtCHS próteinið geti virkað í umfrymi plöntufrumna. Virka.

3.6 CtCHS tjáningarmynsturgreining

qRT-PCR var notað til að greina hlutfallslega tjáningu CtCHS í Cistanche deserticola blómum með þremur litum: hvítum, fjólubláum og rauðum. Niðurstöðurnar eru sýndar á mynd 6. Tjáning CtCHS í fjólubláum og rauðum blómum var marktækt hærri en í hvítum blómum. magni. Í samanburði við hvít blóm er tjáningarstig CtCHS í fjólubláum blómum 8,44 sinnum hærra og tjáningarstig CtCHS í rauðum blómum er 3,21 sinnum hærra. Þessar niðurstöður benda til þess að breytingar á tjáningargildum CtCHS geti tengst mismun á blómaliti Cistanche deserticola. Því hærra sem tjáningarstigið er, því dekkri er blómaliturinn. , því lægra sem tjáningarstigið er, því ljósari er blómaliturinn.

****P＜0.000 1Mynd. 6 Hlutfallslegt tjáningarstig CtCHS í blómum með mismunandi litum

4 Umræður

CHS er alykilensím í flavonoid lífmyndunarferlinuog tengist þe reglugerð um lit blómaí mörgum plöntum. Til dæmis er blómaliturinn áDianthus chinensisL.[20] og Petunia × hybrida Hort. exVilm.[22] eru allir fyrir áhrifum af CHS. stjórna.Cistanches tubulosahefur aðallega þrjá blóma liti: hvítt, rautt og fjólublátt, en ekki hefur enn verið greint frá stjórnun blómalita. Í þessari rannsókn var CtCHS gen klónað með RT-PCR gegnumtranscriptome gagnagreining á Cistanches tubulosa blómum, og þess

Lífupplýsingagreiningvar gerð og niðurstöðurnar sýndu að CtCHS hefur mikla líkt og náið erfðafræðilegt samband við amínósýruröð ElCHS af Physalis nigra (AHJ80976.1). CHS er tegund III pólýketíð synthasi (PKSIII) og rannsóknir hafa leitt í ljós að CHS hefur varðveitta Cys-His-Asn hvataþrenningu [23]. Í þessari rannsókn sýndi amínósýruröðunargreining að CtCHS hefur varðveitt hvataleifar Cys164, His303 og Asn336, sem gefur til kynna að CtCHS gæti haft dæmigerða kalcone synthasa virkni.

fær. Ensímvirknigreining var gerð með því að nota dreifkjörnungatjáningu á CtCHS próteini í Escherichia coli og greind með HPLC og MS. Það kom í ljós að CtCHS prótein getur hvatt 4-kúmaróýl-CoA og malónýl-CoA til að framleiða naringenin-chalcone.

CHS tekur þátt í myndun flavonoids í mörgum plöntum, en undirfrumu staðsetning þess er mismunandi í mismunandi tegundum. Til dæmis Carthamus tinctorius L. CtCHS1[24], Morus atropurpurea Roxb. MaCHS[25], Eupatorium adenophorum Spreng. Hvert CHS[26] er öll staðsett í umfryminu en Paeonia delavayi var. lutea (Delavay ex Franch.) Finet et Gagnep. PdCHS

[27], eggaldin Solanum melongena L. SmCHS [28] er staðsett í umfrymi og kjarna, og í þrúgunni Vitis vinifera L. VvCHS er staðsett í umfrymi, kjarna og frumuvegg [29]. Í þessari rannsókn var pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS plasmíð notað til að umbreyta Arabidopsis thaliana frumfrumum og kom í ljós að CtCHS prótein var aðallega staðbundið í umfryminu og getur hvatt myndun naringenin-chalcone í umfryminu til að stuðla að uppsöfnun flavonoids.

Fenýlprópanóíð ferillinn greinist frá 4-cumaroyl-CoA í flavonoid nýmyndunarferlið og lignan lífmyndunarferilinn. CHS hvatar 4-cumaroyl-CoA og malonyl-CoA til að mynda naringenin og chalcone til að hefja flavonoids. Lífmyndunarferill efnasambandalíkra efnasambanda er fyrsta lykilensímið í þessari leið [30]. Þess vegna er mjög tjáð CHS gagnlegt fyrir plöntur til að safna hærra magni flavonoids og framleiða dekkri blóm. Til dæmis er tjáningarstig CHS í fjólubláum blómaafbrigðum af Hosta plantaginea (Lam.) Aschers hærra en í hvítblómuðum afbrigðum. Hosta HpCHS er umbreytt í tóbak til að fá Samanborið við villt tóbak, hafa oftjáningarplöntur dekkri blöð og hærra heildar anthocyanin innihald [31].

Í þessari rannsókn er tjáningarstig CtCHS gensins tengt litnum á Cistanches tubulosa blómum. Það kemur mjög fram í dekkri fjólubláum blómum og rauðum blómum og er lítið í ljósum hvítum blómum. Tjáningarmunur CtCHS gæti stafað af muninum á Cistanches tubulosa blómum. Ein af ástæðunum fyrir því að hafa mismunandi jakkaföt og liti. Í stuttu máli klónaði þessi rannsókn CtCHS gen úr Cistanche deserticola blómum og framkvæmdi lífupplýsingagreiningu á því. CtCHS raðbrigða próteinið var fengið með utanaðkomandi tjáningu í Escherichia coli. Ensímvirknigreiningin sannaði að CtCHS próteinið getur hvatt 4-kúmaróýlkóensím. A og malónýl-kóensím A mynda naringenin-chalcone. Það kom í ljós að CtCHS genið er mjög tjáð í fjólubláum og rauðum blómum og lítið í hvítum blómum. Þessar niðurstöður benda til þess að CtCHS genið kunni að stjórna framleiðslu mismunandi blóma lita í Cistanche deserticola, sem er gagnlegt fyrir frekari rannsóknir á stjórnunarmáta Cistanche tubulosa blóma litar og veitir tilvísun fyrir síðari rannsóknir á hlutverki CtCHS í stjórnun á blómalitur í Cistanche deserticola.