Ilmkjarnaolíur sem innihalda sítral sem hugsanlegir týrósínasahemlar: lífstýrð brotaaðferð

Tengiliður: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Netfang:audrey.hu@wecistanche.com

Ágrip:

Óhófleg framleiðsla melaníns veldur alvarlegum húðsjúkdómum sem og minniháttar fagurfræðilegum vandamálum (þ.e. freknunum og sólarlinsu). Lækkun týrósínasa er útbreidd aðferð til að meðhöndla slíkar kvillar og plöntuþykkni hefur oft reynst dýrmæt uppspretta aftýrósínasahemlar. Citral (blanda af neral og geranial) er mikilvægt ilmefni sem hefur sýnt andstæðingur-tyrosinasa möguleika. Það er mjög einbeitt í ilmkjarnaolíum (EOs) Cymbopogon schoenanthus (L.) Spreng., Litsea cubeba (Lour.) Pers., Melissa officinalis L. og Verbenaofficinalis L. Hins vegar hefur aðeins L. cubeba EO verið rannsakað fyrir nota sem hugsanlegt húðhvítandi efni. Þessi vinna metur in vitrotýrósínasahamlandi virkni þessara EOs og rannsóknir, með því að nota lífgreiningarmiðaða skiptingu, hvort mismunandi efnasamsetning þeirra hafi áhrif á heildarEO hamlandi virkni með mögulegum samverkandi, aukefnum og/eða samkeppnislegum samskiptum milli EOs efnisþátta. Hindrandi virkni C. schoenanthus EO og M. officinalis EOs, með óverulegu (plús)-sítrónellum magni, var í samræmi við sítrónuinnihald þeirra. Á hinn bóginn hindraði L. cubebaand V. officinalis EOstýrósínasaí töluvert meira mæli þar sem þau innihéldu -myrcene, sem stuðlaði að heildarvirkni EO. Svipaðar athuganir voru gerðar fyrir M. officinalis EO, sem hefur hátt (plús)-sítrónellal innihald sem jók sítrónuvirkni.

Leitarorð:týrósínasahömlun; nauðsynlegar olíur; sítral

cistanche hefur hvítandi virkni

Kynning

Týrósínasier lykilensímið í nýmyndun melanín litarefna í nokkrum bakteríum, sveppum, plöntum, dýrum og mönnum. Hjá mönnum hvatar týrósínasi hraðatakmarkandi skrefin í melanín lífmyndunarferlinu. Þessi lífmyndun einkennist af nokkrum ensím- og efnahvörfum sem leiða til melanínmyndunar úr amínósýrunni L-týrósíni, þar sem týrósínasi hvatar hýdroxýleringu þess í o-dópakínón í gegnum mýkófenólat- og dífenólvirkni. Þó að önnur ensím séu þátt í sortumyndun, geta aðeins týrósínasa-hvötuð viðbrögð ekki átt sér stað af sjálfu sér, en hin skrefin geta haldið áfram án ensímvirkni við lífeðlisfræðilegt pH [1]. Af þessum sökum er lækkun týrósínasa mjög útbreidd aðferð til að draga úr of miklu melaníni. framleiðslu og notkun týrósínasahemla sem húðhvítandi efni hefur sýnt verulegan klínískan og snyrtifræðilegan áberandi stað [2].

Á markaði ESB ertýrósínasahemla sem eru notaðir sem húðhvítandi efni má flokka í tvo meginflokka: þá sem eru bönnuð samkvæmt snyrtivörureglugerð ESB 1223/2009 (þ.e. hýdrókínón og mónóbensýleter hýdrókínón) vegna alvarlegra aukaverkana þeirra, en eru samt notaðir til að meðhöndla oflitarefni samkvæmt læknisfræði eftirlit; og týrósínasahemlar sem eru leyfðir til notkunar í snyrtivörur (þ.e. arbútín, alósín, kojínsýra) [2,3]. Þessi seinni hópur einkennist þó enn af hugsanlega marktækum aukaverkunum; Klínískar rannsóknir á kojínsýru hafa sannarlega bent á tilfelli af roða, stingtilfinningu og snertiexem eftir notkun. Að sama skapi hefur Evrópska vísindanefndin um neytendaöryggi vakið upp áhyggjur varðandi notkun arbutinas sem snyrtivöruefni [2], vegna hugsanlegrar vatnsrofs á glýkósíðtengi þess sem losar hýdrókínón. Það er því þörf fyrir ný sameindasniðmát og/eða blöndur af lífvirkum efnasamböndum til að meðhöndla oflitarefni.

Plöntur hafa verið dýrmætar uppsprettur húðhvítandi efna og þrír af fimm af þeim efnum sem mest hafa verið notaðir, bæði læknisfræðilega og snyrtifræðilega, eru plöntusérhæfð umbrotsefni (þ.e. hýdrókínón, -arbútín, alóesín). Hingað til hafa fenólsambönd aðallega verið rannsökuð sem hugsanlegtýrósínasahemlar, og þar á meðal eru flavonoids (td quercetin [4]), stilbenes (td resveratrol [1]), fenýlprópanóíð (td cinnamaldehýð [5] og eugenol [6]) og fenólsýrur (td anísínsýra og bensósýra [7]). Áhugi forterpenoids hefur verið talsvert lægri og þau hafa tiltölulega lítið verið rannsökuð sem and-tyrosinasa lyf.

Citral er meðal takmarkaðs fjölda terpenoid afleiða með and-tyrosinasa eiginleika sem hafa verið rannsakaðir. Það er blanda af tveimur hverfum, cis- og trans-3,7-dímetýl-2,6-oktadíenal (þ.e. neral og geranial), sem hefur verið sannað að blokka in vitro ensímvirkni sveppatýrósínasa[8]. Til viðbótar við mikilvægi þess sem lyktandi innihaldsefni í drykkjum, matvælum og snyrtivörum, hefur citral sýnt lofandi líffræðilega virkni in vitro, þar á meðal sveppaeyðandi, bakteríudrepandi, andoxunarefni og bólgueyðandi áhrif [9-11]. Þar að auki hafa nýlegar rannsóknir benti á að citral hefur hugsanlega lækningalega þýðingu sem slökunarefni fyrir slétta vöðva og staðdeyfilyf, þar sem það stuðlar að slökun í sléttum vöðvum í barka, legi og ósæðar og hindrar taugaspennu í dýralíkönum [12-15].

Citral er fengin úr ilmkjarnaolíum (EOs) nokkurra grasategunda, þar á meðal Cymbopogon schoenanthus (L.) Spreng., Litsea cubeba (Lour.) Pers., Melissa officinalis L. og Verbena officinalis L. þekkingu, aðeins L. cubeba EO hefur verið rannsakað vegna þesstýrósínasahamlandi virkni [16]. Þess vegna miðar þessi rannsókn að því að meta týrósínasahemjandi virkni C. schoenanthus, L. cubeba, M. officinalis og V.officinalis EOs, með því að nota in vitro litmælingapróf, til að meta hvort mismunandi efnasamsetningar hafi áhrif á heildar EO hamlandi virkni með einhverjum möguleg samlegðaráhrif, aukefni og/eða samkeppnisleg samskipti milli íhluta þeirra. Þessi rannsókn notar abioassay-guided fractionation approach til að meta alhliða EO efnisþætti og handhverfur þeirra, þegar þær eru breytilegar, sem stuðla að EO hamlandi virkni gegn sveppum uppsprettu týrósínasa, sem er gott fyrirmyndarkerfi fyrir bráðabirgðaskimun átýrósínasahemlar [17].

2. Niðurstöður og umræður

2.1. Efnasamsetning og sítral innihald ilmkjarnaolíunnar sem rannsakað var

Í tilraun okkar til að lýsa ítarlega alla hugsanlega EO efnisþætti sem stuðla að íhugaðri líffræðilegri virkni, voru rannsökuðu EOs greind með GC, með bæði FID og MS uppgötvun. Staðlað hlutfallslegt hlutfallsmagn (reiknað út frá algildum svæðum sem staðlað var að innri staðlinum C13 með því að nota svörunarstuðla [18,19]) allra greindra efnasambanda voru ákvörðuð og notuð til að bera saman EO samsetningar. Mynd 1 greinir frá GC-MS prófílnum af rannsökuðum EOs sem greind voru með hefðbundinni dálki. Tafla 1 sýnir, fyrir hvert rannsakað EO, efnasamböndin sem sýndu staðlað prósentumagn yfir 0.1, en heildarsamsetning EO efnasamsetninga er greint frá í viðbótarefnum (töflum S1–S5).

Öll könnuð EO eru rík af neral (cis{{0}},7-dímetýl-2,6-oktadíenal) og geranial (trans-3,{ {5}}dímetýl-2,6-oktadíenal), sem eru algengustu efnasamböndin. Hlutfall milli æðar og pelargóna var mjög svipað í öllum könnuðum EO og samsvaraði 0.74 ± 0,05. C. schoenanthus og L. cubeba EO-efnin sýna hæsta nörda- og geranial-innihaldið, sem stendur fyrir að meðaltali 60 prósent af allri EO-samsetningu þeirra, og sem er 1.5-falt meira en í V. officinalis EO og í þrjú M. officinalis EO (þ.e. sýni 1, 2 og 3). Auka súrefnisríku efnasamböndin sem eru sameiginleg öllum EO eru 6-metýl-5-hepten-1-ón, linalool og sítrónellal. Hið síðarnefnda er marktækt meira í M. officinalis EO 1 en í hinum rannsökuðu EOs, þar á meðal M. officinalis EO2 og 3.

Gnægð kolvetnishlutans er mjög mismunandi í mismunandi EOs.M. officinalis EO 1 inniheldur aðeins trans- -karýófýlen og -húmulen sem seskvíterpenvetniskolefni, sem eru 2,7 prósent og 0,13 prósent af heildar EO, ​​í sömu röð. C.schoenanthus EO sýnir aðeins ríkara kolvetnishlutfall en M. officinalis EO 1 (þ.e. 7.0 prósent ), sem inniheldur bæði mónóterpena (þ.e. kamfen, cis{{1{{20 }}}}ocimene, limonene, -pinene,trans- -ocimene, -thujene) og sesquiterpenes (þ.e. trans- -caryophyllene, -cadinene,δ-cadinene, germacrene D, -elemene) í meðallagi upphæðir. Í L. cubeba og V. officinalis EO er kolvetnishlutinn 20 prósent af heildar EO og limonene er algengasta efnasambandið (þ.e. 15,0 og 10,9 prósent, í sömu röð), fylgt eftir af -pinene, pinene , sabinene, trans- -karýófýlen, -myrcene, camphene og -copaene. Að lokum, M. officinalis EO 2 og 3 einkennast af hæsta innihaldi kolvetnishluta (38,8 prósent og 31,8 prósent af heildar EO, ​​í sömu röð). Í báðum sýnunum inniheldur kolvetnishlutinn aðallega seskvíterpena, þ.e. trans- -karýófýlen (27,8 prósent og 20,0 prósent, í sömu röð), og -humulene (3,0 prósent og 2,6 prósent), og minnkað mónóterpenhluti sem einkennist aðallega af límóneni ( 4,2 prósent og 3,2 prósent, í sömu röð).

Þrjú sýni af L. cubeba, V. officinalis og C. schoenanthus Eos framleidd á mismunandi árum auk þriggja sýnis af M. officinalis EOs frá mismunandi framleiðendum voru rannsökuð. GC-MS greiningar á C. schoenanthus, L. cubeba, M. officinalis og V. officinalis leiddu ekki í ljós marktækan eigindlegan og megindlegan mun á efnasamsetningu þriggja sýna af mismunandi framleiðsluárum. Þetta má rekja til ákjósanlegra geymsluaðstæðna, þ.e. í gulbrúnu gleríláti við 4 ◦C í myrkri með óverulegu höfuðrými. Á hinn bóginn sýndu GC-MS greiningar marktækan mun á magni sítrónellals og trans{{4 }}caryophyllene í þremur rannsökuðu M. officinalis EOs. Citronella nam 19,6 prósentum, 0.26 prósentum og 0.31 prósentum í M. officinalis EO 1, 2 og 3, í sömu röð. Þvert á móti, eins og áður hefur verið lýst, er trans- -karýófýlen töluvert meira í M. officinalis EO 2 og 3 en í M. officinalis EO 1. Þessar niðurstöður eru í samræmi við niðurstöður Seidler-Lozykawska o.fl., sem benti á marktækan mun á citral-, citronellal- og trans{19}}caryophyllene-magni í EO-efnum sem fengin eru úr 22 völdum M. officinalis arfgerðum sem koma frá evrópskum grasagörðum [20].

Raunveruleg magngreining var framkvæmd með ytri staðalkvörðuninni til að meta nákvæmt magn hugsanlegra lífvirkra sérhæfðra efnasambanda (þ.e. neral, geranial, limonene, -myrcene og sítrónellal. Töflur 2 og 3 segja frá greiningarjónum (m/z) sem notaðar eru fyrir SIM- MS magngreining merkjaefnasambandanna sem eru til rannsóknar ásamt kvörðunarsviðinu, kvörðunarferiljöfnunni, fylgnigildum og aðhvarfsstaðalvillu hvers greiniefna og magngreiningarniðurstöðum, í sömu röð.

2.2. In vitro hamlandi virkni rannsakaðra ilmkjarnaolía gegn sveppum tyrósínasa

Eins og áður hefur verið lýst sýna EOs C. schoenanthus, M. officinalis, L. cubeba og V.officinalis mikið magn af citral, sem einkennist af ósamkeppnishamlandi virkni gegn sveppagjafa tyrosinasa [8,16,21] . Þessi rannsókn miðar að því að skoða in vitrotýrósínasahamlandi virkni þessara EOs til að kanna hvort hamlandi virkni þeirra megi eingöngu rekja til sítrunarinnihalds þeirra, eða hvort það séu önnur lífvirk efni sem hafa áhrif á hamlandi áhrif EOs.

Sveppirtýrósínasavar hér tekin upp vegna mikillar samlíkingar þess við humantyrosinasa, tiltölulega lágs kostnaðar og tilbúins framboðs, sem gerir það að góðu fyrirmyndarkerfi fyrir bráðabirgðaskimun á týrósínasahemlum [17]. Nákvæmni in vitrotýrósínasahömlunarpróf var metið með tilliti til endurtekningarhæfni (með því að framkvæma ensímhömlunarprófið fimm sinnum á sama degi) og miðlungs nákvæmni (með því að endurtaka ensímhömlunarprófið fimm sinnum á fjögurra vikna fresti á sex mánaða tímabili). Í töflu 4 er greint frá breytileikastuðlinum (CV) fyrir hömlunarprófanir sem gerðar voru með kojínsýru, sem var notuð sem jákvæður samanburður, og með L. cubeba EO. Niðurstöður voru viðunandi þar sem ferilskráin fór aldrei yfir 7 prósent fyrir endurtekningarnákvæmni og 10 prósent fyrir millinákvæmni. Í töflu 4 er greint frá breytileikastuðlinum fyrir hömlunarpróf sem gerðar voru með kójínsýru, notuð sem jákvæð viðmiðun, og með L. cubeba EO. Svipuð nákvæmnisgildi fengust fyrir öll prófuð EO.

Kúrfa sítralstyrks-svörunar var rannsökuð með því að teikna upp hindrunarvirkni sem sást sem fall af styrk hennar í hvarfblöndunni. Öll EO voru prófuð með styrk 166,7 µg/mL, sem gaf, óháð EO, sítrónustyrk innan styrkleika-svörunarlínulínusviðs þess (y=0.3956x plús 1.8094,R{{7} }.9951, aðhvarfsvilla: 2,08448, línuleiki: 6,7–166,7 µg/mL) og myndaði ekki leysnivandamál í hvarfblöndunni.

Kassalóðin sem greint er frá á mynd 2 sýnir hlutfall aftýrósínasahömlun fyrir hvert EO. Fyrir L. cubeba, V. officinalis og C. schoenanthus EOs samsvara niðurstöðurnar sem greint er frá á mynd 2 til sveppa tyrosinasa hamlandi virkni EOs af 2020 vegna þess að dreifnigreining leiddi í ljós engan tölfræðilega marktækan mun milli EOs af mismunandi framleiðsluár (p > 0,05). Að því er varðar L. cubeba og C. schoenanthus EOs, eru þessar niðurstöður í góðu samræmi við niðurstöður sem fengust úr megindlegum GCMS greiningum sem leiddu í ljós næstum eins sítrónumagn í EOs mismunandi framleiðsluára. Lotan 2020 af V. officinalis EO inniheldur örlítið hærra sítralmagn en loturnar 2019 og 2018. Hins vegar, samkvæmt sítralstyrk-svörunarkúrfu, er umfram sítral í lotu 2020 ekki nægilegt til að ákvarða tölfræðilega marktækt hærra hlutfall af ensímhömlun miðað við slembihömlunina. villu í tengslum við mælingar. Fyrir frekari upplýsingar, sjá mynd S1 í viðbótarefninu. Aftur á móti leiddi dreifnigreiningin (ANOVA) á eftir Tukey–Kramer eftir prófið í ljós að hinir þrír prófuðu M. officinalis EOs, útvegaðir af mismunandi framleiðendum, hamluðu sveppumtýrósínasaí mismunandi mæli, sem nánar verður lýst í eftirfarandi málsgreinum. Mesta hindrunarvirkni sást fyrir EOs L.cubeba, M. officinalis 1 og V. officinalis, sem hamluðu 59 ± 6 prósent, 55 ± 7 prósent og 52 ± 6 prósent aftýrósínasavirkni, í sömu röð, þegar hún er prófuð í styrknum 166,7 µg/ml. Tölfræðilega marktæk (p < {2}}.05)="" minni="" virkni="" sást="" fyrir="" eos="" c.="" schoenanthus="" og="" m.="" officinalis="" 2="" og="" 3,="" þar="" sem="" ensímhamlandi="" virkni="" var="" 42="" ±="" 5="" prósent,="" 40="" ±="" 5="" prósent="" og="" 38="" ±="" 6="" prósent,="" í="" sömu="" röð.="" tafla="" 5="" gefur="" upp="" hemlastyrkinn="" sem="" minnkaði="" ensímvirknina="" um="" helming="" við="" gefnar="" tilraunaaðstæður="" (ic50)="" fyrir="" hvern="" rannsakaðan="" hemil="" (þ.e.="" eos,="" staka="" efnasambönd="" og="" kojínsýra).="" öll="" eo="" hömluðu="" á="" áhrifaríkan="" hátt="" sveppatýrósínasa="" og="" sýndu="" hamlandi="" virkni="" sem="" var="" að="" meðaltali="" 100-falt="" minni="" en="" kójicacid,="" sem="" var="" notað="" sem="" jákvæð="">

2.3. Að bera kennsl á fleiri lífvirka efnisþætti, fyrir utan sítral, með lífgreiningarstýrðri hlutun. Súluritið sem greint er frá á mynd 3 ber saman hlutfall af tilraunamældum ensímhömlum við þau gildi sem búast mætti ​​við ef neral og geranial (litið á sem summa, þ.e. sítral) væru aðeins virk efnasambönd í könnuðum EOs. Þessi gildi voru mæld með innskot frá sítrastyrk-svörunarferilnum. Eins og hægt er að taka fram sýndu C. schoenanthus, M. officinalis 2 og M. officinalis 3 hamlandi virkni sem var í samræmi við sítrónuinnihald þeirra, en L. cubeba, M. officinalis 1 og V. officinalis EO hamluðu sveppum tyrosinasa í meira mæli en búist var við. Lífstýrð nálgun var notuð til að bera kennsl á viðbótarefnasamböndin sem stuðla að sítrölvirkni. Súrefnis- og kolvetnishlutar L. cubeba, M. officinalis 1 og V. officinalis EO voru einangraðir með leifturskiljun og prófaðir hver fyrir sig fyrir sveppum sínum.týrósínasahamlandi starfsemi. Hlutarnir phytohemical prófaðir fyrir sveppa tyrosinasa hamlandi virkni þeirra. Frumfrumuefnabrotin voru prófuð við sama styrk og styrkurinn sem varð til þegar prófaður var 166,7 µg/ml af viðkomandi EO (sjá efnis- og aðferðir kafla í kafla 3.2). Tafla 6 sýnir styrk neral, geranial, sítrónellal, limonene, og -myrcen í súrefnis- og kolvetnishlutum skiptu EO-efnanna.

Hvað varðar L. cubeba og V. officinalis EOs, þá hamluðu bæði súrefnis- og kolvetnishlutarnir sveppatýrósínasa, þó í mismunandi mæli. Virkni súrefnisbundinna hluta (53 ± 3 prósent og 44 ± 5, í sömu röð) skýrir mestan hluta EOsand-týrósínasamöguleiki og voru í samræmi við viðkomandi sítrunarinnihald, sem bendir til þess að efnasamböndin sem stuðla að sítrölvirkni tilheyra kolvetnishlutunum. Kolvetnishlutar L. cubeba og V. officinalis EO hafa nokkuð svipaða efnasamsetningu. Limonene (68,4 og 50,3 prósent, í sömu röð), trans- -karýófýlen (12,0 og 7,8 prósent, í sömu röð), -pinen (1,7 og 7,5 prósent, í sömu röð), -pinen (2,5 og 12,9 prósent, í sömu röð), sabinen (2,7 og 3,8, í sömu röð) og -myrcene (2,0 og 2,4 prósent, í sömu röð) eru algengustu efnasamböndin í báðum hlutunum og eru til staðar í frekar svipuðu magni, nema fyrir -pinen og -pinen, sem eru ríkjandi í V. officinalis EO kolefnishlutanum.

The chiral recognition revealed high enantiomeric purities in favor of the (-)-configured enantiomers for trans-β-caryophyllene (>99 prósent í báðum EOs), limonene (97 og 94 prósent í L. cubeba og V. officinalis EO, í sömu röð) og sabinene (87 prósent í báðum EO), en mismunandi handhverfa umframmagn sást fyrir -pinene ((-)- handhverfa: 38 prósent í L. cubebaEO og 73 prósent í V. officinalis EO) og -pinen ((-)-handhverfa: 67 prósent í L. cubeba EO og 88 prósent í V. officinalis EO). Í báðum EO er (-)-límónen meira en 50 prósent af öllu brotinu. Hins vegar, þó að fyrri rannsóknir hafi greint frá hamlandi virkni gegn sveppum tyrosinasa vegna mikils gnægðar hans [22,23], sýndi (-)-limonene hér ekki tyrosinasa hamlandi virkni. Svipaðar niðurstöður fengust fyrir (plús)-límónen, kynþáttablönduna og efnasamböndin (-)-trans- -karýófýlen, (±)- -pinen og (±)- -pinen . Sabinene var ekki prófað þar sem þegar hafði verið sannað að það væri með óverulegum sveppumtýrósínasahamlandi áhrif [8]. Í samræmi við fyrri niðurstöður [8] dró myrsen úr sveppum tyrosinasavirkni. Þegar hún var prófuð við styrkinn sem sést í 166,7 µg/mL af L. cubeba og V. officinalis EOs, brúaði -myrcene virkni bilið á milli væntanlegra hamlandi áhrifa EOs ef citral var eina virka efnasambandið og tilraunaniðurstöðurnar. Öfugt við athuganir Matsuura o.fl. [8], -myrcene reyndist vera öflugri sveppir týrósínasa hemill en citral, þar sem IC50 þess var næstum tífalt lægra (13,3 µg/mL á móti 121,8 µg/mL). Þennan mun má rekja til mismunandi hvarfefna sem notuð eru; Matsuura o.fl. könnuðu eingöngu virkni tyrosinasa dífenólasa sveppa, þar sem þeir notuðu L-DOPA sem hvarfefni, en í þessari rannsókn var L-tyrosín notað. Núverandi niðurstöður benda til þess að -myrcene gæti verið áhrifaríkara við að hamla týrósínasa mónófenólasavirkni sveppa en dífenólasa.

M. officinalis EO 1 sýnir lítið kolvetnishlutfall sem er innan við 3 prósent af heildinni og hefur enga týrósínasa-hemjandi virkni. Hins vegar hamlaði M. officinalisEO 1 súrefnishlutinn sveppatýrósínasa í meira mæli en búast mátti við af sítrunarinnihaldi hans (Mynd 3). Þessi hluti inniheldur umtalsvert magn af sítrónellal auk neral og geranial og chiral greiningin leiddi í ljós háan andhverfa hreinleika sítrónellals í þágu (plús) handhverfu (98,3 prósent). Þegar það var prófað sjálfstætt, í styrk 166,7 µg/ml, hamlaði (plús )-sítrónellal sveppatýrósínasa að óverulegu leyti, þó að virkni þess hafi aukist verulega þegar það var prófað í samsettri meðferð með citral. Þessar niðurstöður gætu skýrt þann mun sem sést á hlutfalli sveppatýrósínasahömlun á hinum ýmsu M. officinalis EOs. M. officinalis EO 2 og 3 eru með mjög lágt sítrónellal innihald, sem gæti verið ástæðan fyrir því að hindrandi virkni þeirra er verulega minni en M. officinalis EO 1.

3. Efni og aðferðir

3.1. Hvarfefni

Dímetýlsúlfoxíð (DMSO), sveppir týrósínasi frá Agaricus bisporus (JE Lange)Imbach, L-týrósín, kojínsýra, sítral, sítrónellal, -myrcene, (plús )-limonene, (-)-limonene, (±)-limonene, ( ±)- og pinene voru keyptir frá Merck Life Science Srl (Mílanó, Ítalíu). Litsea cubeba, Verbena officinalis og Cymbopogon schoenanthus EOs voru útvegaðir af Erboristeria Magentina Srl (Poirino, Ítalíu). Þrjár lotur af mismunandi árum (þ.e. 2020,2019, 2018) voru prófaðar fyrir hvern. Þrjú sýni af Melissa officinalis EOs voru rannsökuð; eitt var veitt af Agronatura (Spigno Monferrato, Alessandria), eitt af ErboristeriaMagentina Srl, en það síðasta var keypt í staðbundinni verslun og var frá SpecchiasolS.rl (Bussolengo, Ítalíu). Í textanum vísa höfundar til mismunandi EOs Melissaofficinalis sem M. officinalis EOs 1, 2 og 3, í sömu röð. Meðfylgjandi EOs voru fengnar samkvæmt aðferðum sem lýst er í evrópsku lyfjaskránni [24]. Melissa officinalis og Verbena officinalis EOs voru framleidd með vatnseimingu úr laufum og plöntuhlutum, í sömu röð; á sama hátt voru Litsea cubeba og Cymbopogon schoenanthus EOs fengnar með gufueimingu á ferskum ávöxtum og ferskum lofthlutum, í sömu röð. Sérhver EO var greindur fyrir sig af GC-MS um leið og hann var keyptur/útvegaður af samsvarandi framleiðanda, á hverju geymsluári, og rétt áður en rannsóknin var gerð á sveppatýrósínasa hamlandi virkni þess.

3.2. In vitro týrósínasa hemlunarpróf

Thetýrósínasahamlandi virkni EOs og einangraðra efnasambanda voru rannsökuð in vitro með því að nota litamælingu sem byggir á ensímprófi sem var fínstillt af Zengh et al. [25], með smávægilegum breytingum. Týrósínasahamlandi virkni EOs, sem og kolvetni og súrefnisbundin hlutar þeirra og hreinar efnasambönd, voru rannsökuð í gleraugum ensímprófi sem byggir á litamælingu sem var fínstillt af Zengh et al. [25], með smávægilegum breytingum: greiningin var framkvæmd við stofuhita ogtýrósínasahömlun var mæld með hliðsjón af eftirliti og sýnisgleypni eftir 6 mínútur af ræktun, frekar en eftir 20 mínútur, til að starfa undir línulega hluta ensímverkunarinnar, sem gefur nákvæmari hömlunarniðurstöður [26,27]. Sveppir tyrosinase frá Agaricus bisporus (JE Lange) Imbach var valinn í þessa rannsókn. L-týrósín var notað sem hvarfefni, sem þýðir að heildar týrósínasa hindrandi virkni var rannsökuð án þess að gera greinarmun á týrósínasa mónófenólasa og dífenólasa virkni. Ljósmyndamælingar við 475 nm voru gerðar á Thermo spectronic Genesys6 og jákvæði samanburðarhemillinn var notaður sem. Lausnirnar af mögulegum hemlum sem rannsakaðir voru (EOs, EO einangraðir hlutar, EO einstök efnasambönd og kojicacid) voru útbúnar í DMSO. Tafla 7 sýnir prófaðan styrk fyrir hvern rannsakaðan hugsanlegan hemil. Sveppurinntýrósínasalausn 200 U/mL (27,9 µg/mL) var útbúin í natríumfosfatbuffi (pH 6,8) og 9 ml skammtar voru geymdir við -18 ◦C og þíðað rétt fyrir tilraunirnar. Týrósínlausn 0,1 mg/ml var útbúin í natríumfosfatbuffi (pH 6,8) og endurnýjuð daglega. Hlutar hvarfblöndunnar voru settir í hettuglasið í eftirfarandi röð: 1 ml af sveppatýrósínasalausn 200 einingar/ml; 1 ml af natríumfosfatjafnalausn; 10 µL af EO/eint efnasambandi/kojínsýrulausn; og að lokum 1 ml af týrósínlausn 0,1 mg/ml. Lokahlutfall DMSO í hvarfblöndunni var 0,3 prósent. Greiningin var framkvæmd í lokuðu 4 ml hettuglasi til að koma í veg fyrir að EO efnisþættir tapist í umhverfið í kring og til að lágmarka losun þeirra í höfuðrýmið fyrir ofan hvarfblönduna. Hvarfblandan var ræktuð í hitastilltu vatnsbaði við 25 ◦C í 6 mín. Í kjölfarið var gleypni við 475 nm skráð, þar sem þessi bylgjulengd gerir kleift að bera kennsl á dópakróm. Frásog sem samsvarar 100 prósentum af týrósínasavirkni var mæld með því að skipta út EOs/einstaka efnasambandinu/kojínsýrulausninni fyrir 10 µL af hreinu DMSO. Auðar lausnir voru útbúnar sem hér segir: 2 mL af natríumfosfatjafnalausn, 10 µL af EO/stöku efnasambandi /kojínsýru/DMSO lausn, og 1 ml af týrósínlausn 0,1 mg/ml. Hlutfall týrósínasa hömlunar var mælt samkvæmt jöfnunni hér að neðan: prósent hömlun=∆A (stýring) − ∆A (sýni) / ∆A (stýring) × 100,∆A (stýring) eða (sýni) {{ 33}} A475 (stýring) eða (sýnishorn) − A475 (stýring autt) eða (sýnishorn).

3.3. Flash Column Chromatography

EO skipting var framkvæmd á leiftursúluskiljunarkerfi PuriFlash450 frá Sepachrom (Rho, Mílanó, Ítalíu), búið bæði UV og ELSD skynjara. Magn EO brotið: 900,0 mg. Stöðugur fasi: kúlulaga kísilgel agnir, 50 µm, 25 mg (Purezza®-Sphera Cartridge Stationary) var frá Sepachrom; hreyfanlegur fasi: bensíneter (A) og etýlasetat (B); rennsli 25 ml/mín. Línuleg hallaskolun var tekin upp úr 100 prósent af A í 80 prósent af A og 20 prósent af B á 20 mínútum.

3.4. Greiningarskilyrði

EOs lausnirnar og þær hlutar þeirra voru útbúnar í sýklóhexan sem styrkur 5,0 mg/ml og greindar með GC-MS. Citral, sítrónellal, -myrcene og limonene voru magngreind í hverju EO og samsvarandi einangruðum brotum með ytri staðlaðri kvörðunaraðferð. Hentug kvörðunarstig voru útbúin insýklóhexan og greind með GC-MS. Tridecan (C13) 1.0 mg/ml var notað sem innri staðall til að staðla greiningarmerkin. Tafla 2 tekur saman talið styrkleikabil fyrir hvert magnbundið efnasamband.

GC-MS greiningar voru gerðar með því að nota Gerstel MPS-2 fjölnota sýnatökutæki (Mülheim an der Ruhr, Þýskalandi) sem settur var upp á Agilent 6890 N GC sem tengdur var við 5975 MSD og búinn ChemStation útgáfu E. 02.02.1431 gagnavinnslukerfi (AgilentTechnologies, Santa Clara, CA, Bandaríkjunum). GC skilyrði: hitastig inndælingartækis: 250 ◦C; innspýtingarhamur: skipt; hlutfall: 1/20; burðargas: helíum; stöðugt flæði: 1 ml/mín; súlur: Mega5 (95 prósent pólýdímetýlsíloxan, 5 prósent fenýl) df 0,25 µm, dc 0,25 mm, lengd 25 m, frá MEGA (Legnano, Ítalíu). Hitastig: 50 ◦C//3 ◦C/mín//180 ◦C//10 ◦C/mín//250 ◦C(5 mín). MSD aðstæður: MS starfrækt í EI ham (70 eV); skannasvið: 35 til 350 amu; dvalartími 40 ms; jónauppspretta hitastig: 230 ◦C; fjórpólshiti: 150 ◦C; flutningslínuhiti: 280 ◦C. EO merki voru auðkennd með því að bera saman báðar línuhaldsvísitölur þeirra (IT), reiknaðar á móti C9-C25 kolvetnisblöndu, og massaróf þeirra annaðhvort á móti ósviknum sýnum eða frá fjöldarófssöfnum sem eru fáanleg í verslun (Adams, 2007). EO chiral greiningar voru framkvæmdar með því að nota sömu greiningarskilyrði á 2,3-dí-O-metýl-6-Ot-bútýldímetýlsilýl- -CD (2,3DM6TBDMS -CD) df 0,25 µm, dc 0,25 mm, lengd 25 m frá MEGA. Hitakerfi: 40 ◦C(1 mín)//2 ◦C/mín//220 ◦C (5 mín).

GC-FID greiningar voru gerðar á sama tæki. GC skilyrði: hitastig inndælingartækis: 250 ◦C; innspýtingarhamur: skipt; hlutfall: 1/20; burðargas: vetni; rennsli: 1 ml/mín. Hitaforrit: 40 ◦C (1 mín)//2 ◦C/mín//220 ◦C (5 mín).

4. Niðurstöður

Tilgangur þessarar rannsóknar var (1) að skoða ítarlega in vitro-sveppinntýrósínasahamlandi virkni Cymbopogon schoenanthus, Litsea cubeba, Melissa officinalis og Verbena officinalis EOs og (2) til að ákvarða hvort líffræðileg virkni þeirra sé eingöngu rakin til sítralainnihalds þeirra eða hvort það séu fleiri lífvirk mónóterpenar sem stuðla að líffræðilegri virkni sem rannsakað er með því að nota bioassay-guided fractionation nálgun. Þessi rannsókn hefur bent á að í L. cubeba og V. officinalis EOs, stuðlar -myrcene að EOs hamlandi virkni þrátt fyrir lítið magn þess og það hefur verið sýnt fram á að það hefur meiri hamlandi áhrif á sítral. Önnur helstu uppgötvunin var sú að (plús)-sítrónellal-bættur sítrólsveppurtýrósínasahamlandi kraftur, hugsanlega samverkandi víxlverkun þar sem það sýndi enga virkni eitt og sér. Síðarnefnda niðurstaðan útskýrði hvers vegna í M. officinalis EOs sem bera hverfandi (plús)-sítrónellal magn, hindrunarvirknin var í takt við sítrónuinnihald þeirra á meðan hið gagnstæða átti við um M. officinalis EO með tiltölulega mikið (plús)-sítrónusítrónumagn. þó að frekari rannsóknir séu enn nauðsynlegar til að skilgreina nákvæmlega hvers konar milliverkanir eiga sér stað á milli -myrcene og citral og á milli sítrónellals og citrals, og til að meta hamlandi virkni þessara EO og einstakra efnasambanda á mönnumtýrósínasa, niðurstöður þessarar rannsóknar geta hjálpað til við að hanna skynsamlega blöndur af EOs eða auðgað EOs sem bæta líffræðilega virkni þeirra og auka möguleika þeirra sem hjálparefni við meðferð á oflitarefni.

Heimildir

1. Pillaiyar, T.; Manickam, M.; Namasivayam, V. Húðhvítunarefni: Lyfjaefnafræðileg sjónarmið týrósínasahemla.J. Ensím. Inhib. Med. Chem. 2017, 32, 403–425. [Krossvísun]

2. Desmedt, B.; Courselle, P.; De Beer, JO; Rogiers, V.; Grosber, M.; Deconinck, E.; De Paepe, K. Yfirlit yfir húðhvítunarefni með innsýn í ólöglegan snyrtivörumarkað í Evrópu. J. Eur. Acad. Dermatol. Venereol. 2016, 30, 943–950. [CrossRef] [PubMed]

3. Desmedt, B.; Van Hoeck, E.; Rogiers, V.; Courselle, P.; De Beer, JO; De Paepe, K.; Deconinck, E. Einkenni grunaðra ólöglegra húðhvítunar snyrtivara. J. Pharm. Biomed. endaþarm. 2014, 90, 85–91. [CrossRef] [PubMed]

4. Kubo, I.; Ikuyo, KH Flavonól úr saffranblómi: Týrósínasa hindrandi virkni og hömlunarkerfi. J. Agric. Food Chem.1999, 47, 4121-4125. [Krossvísun]

5. Chang, C.-TT; Chang, W.-LL; Hsu, J.-CC; Shih, Y.; Chou, S.-TT Efnasamsetning og týrósínasahemjandi virkni Cinnamomum kassia ilmkjarnaolíur. Bot. Stud. 2013, 54, 2–8. [Krossvísun]

6. Garcia-Molina, MDM; Muñoz-Muñoz, JL; Garcia-Molina, F.; García-Ruiz, PA; Garcia-Canovas, F. Verkun týrósínasa á ortó-setnum fenólum: Hugsanleg áhrif á brúnun og sortumyndun. J. Agric. Food Chem. 2012, 60, 6447–6453. [Krossvísun]

7. Kubo, I.; Kinst-Hori, I. Tyrosinasa hemlar frá kúmeni. J. Agric. Food Chem. 1998, 46, 5338–5341. [Krossvísun]

8. Matsuura, R.; Ukeda, H.; Sawamura, M. Tyrosinasa hamlandi virkni sítrus ilmkjarnaolíur. J. Agric. Food Chem. 2006,54, 2309–2313. [Krossvísun]

9. Lertsatitthanakorn, P.; Taweechaisupapong, S.; Aromdee, C.; Khunkitti, W. In vitro lífvirkni ilmkjarnaolíur sem notuð eru við unglingabólur. Alþj. J. Aromather. 2006, 16, 43–49. [Krossvísun]

10. Bouzenna, H.; Hfaiedh, N.; Giroux-Metges, M.-A.; Elfeki, A.; Talarmin, H. Líffræðilegir eiginleikar citral og hugsanleg verndandi áhrif þess gegn frumueiturhrifum af völdum aspiríns í IEC-6 frumum. Biomed. Lyfjafræðingur. 2017, 87, 653–660. [Krossvísun]

11. Lee, HJ; Jeong, HS; Kim, DJ; Nei, YH; Yuk, DY; Hong, JT Hindrandi áhrif citrals á NO framleiðslu með bælingu á iNOS tjáningu og NF-KB virkjun í RAW264.7 frumum. Arch. Pharm. Res. 2008, 31, 342–349. [Krossvísun]

12. Carvalho, PMM; Macêdo, CAF; Ribeiro, TF; Silva, AA; Da Silva, RER; de Morais, LP; Kerntopf, MR; Menezes, IRA;Barbosa, R. Áhrif Lippia alba (Mill.) NE Brún ilmkjarnaolíunnar og helstu innihaldsefni hennar, sítral og limonene, á sléttan barka vöðva rotta. Líftækni. þingmaður 2018, 17, 31–34. [CrossRef] [PubMed]

13. Pereira-de-Morais, L.; Silva, AdA; da Silva, RER; Costa, RHSd; Monteiro, Á.B.; Barbosa, CRdS; Amorim, TdS; deMenezes, IRA; Kerntopf, MR; Barbosa, R. Tocolytic virkni Lippia alba ilmkjarnaolíunnar og helstu innihaldsefna hennar, citral andlimonene, á einangruðu legi rotta. Chem. Biol. Samskipti. 2019, 297, 155–159. [Krossvísun]

14. Da Silva, RER; de Morais, LP; Silva, AA; Bastos, CMS; Pereira-Gonçalves, Á.; Kerntopf, MR; Menezes, IRA; Leal-Cardoso,JH; Barbosa, R. Vasorelaxant áhrif Lippia alba ilmkjarnaolíunnar og helstu innihaldsefni hennar, citral, á samdráttarhæfni einangraðrar ósæðar rottu. Biomed. Lyfjafræðingur. 2018, 108, 792–798. [CrossRef] [PubMed]

15. Sousa, DG; Sousa, SDG; Silva, RER; Silva-Alves, KS; Ferreira-da-Silva, FW; Kerntopf, MR; Menezes, IRA; Leal-Cardoso,JH; Barbosa, R. Ilmkjarnaolía af Lippia alba og aðalefni hennar citral hindra spennu í sciatic taugum hjá rottum. Braz. J. Med.Biol. Res. 2015, 48, 697–702. [CrossRef] [PubMed]

16. Huang, X.-W.; Feng, Y.-C.; Huang, Y.; Li, H.-L. Hugsanleg snyrtivörunotkun ilmkjarnaolíu unnin úr Litsea cubeba ávöxtum frá Kína. J. Essent. Oil Res. 2013, 25, 112–119. [Krossvísun]

17. Zolghadri, S.; Bahrami, A.; Hassan Khan, MT; Munoz-Munoz, J.; Garcia-Molina, F.; Garcia-Canovas, F.; Saboury, AA Alhliða endurskoðun á týrósínasahemlum. J. Ensím. Inhib. Med. Chem. 2019, 34, 279–309. [Krossvísun]

18. Bicchi, C.; Liberto, E.; Matteodo, M.; Sgorbini, B.; Mondello, L.; Zellner, Bd; Costa, R.; Rubiolo, P. Magngreining á ilmkjarnaolíum: Flókið verkefni. Bragð Fragr. J. 2008, 23, 382–391. [Krossvísun]

19. Rubiolo, P.; Sgorbini, B.; Liberto, E.; Cordero, C.; Bicchi, C. Ilmkjarnaolíur og rokgjörn efni: Undirbúningur og greining sýnis. A review.Flavour Fragr. J. 2010, 25, 282–290. [Krossvísun]

20. Seidler-Łozykowska, K.; Bocianowski, J.; Król, D. Mat á breytileika formfræðilegra og efnafræðilegra eiginleika þessara völdum sítrónu smyrsl (Melissa officinalis L.) arfgerða. Ind. Crops Prod. 2013, 49, 515–520. [Krossvísun]

21. Kubo, I.; Kinst-Hori, I. Tyrosinasa hamlandi virkni ólífuolíubragðefnasambandanna. J. Agric. Food Chem. 1999, 47, 4574–4578.[CrossRef] [PubMed]

22. Fiocco, D.; Arciuli, M.; Arena, þingmaður; Benvenuti, S.; Gallone, A. Efnasamsetning og andstæðingur-melanogenic möguleiki mismunandi ilmkjarnaolíur. Bragð Fragr. J. 2016, 31, 255–261. [Krossvísun]

23. Hu, JJ; Li, X.; Liu, XH; Zhang, WP Hindrandi áhrif sítrónu ilmkjarnaolíu á sveppa tyrosinasa virkni in vitro. Mod. FoodSci. Tækni. 2015, 31, 97–105. [Krossvísun]

24. Evrópuráðið. European Pharmacopoeia, 10. útgáfa; Evrópuráðið: Strasburg, Frakklandi, 2020; ISBN 978-92-871-8921-9.

25. Zheng, ZP; Tan, HY; Chen, J.; Wang, M. Einkenni týrósínasahemla í kvistum Cudrania tricuspidata og rannsókn á tengslamyndun þeirra og virkni. Fitoterapia 2013, 84, 242–247. [CrossRef] [PubMed]

26. Williams, KP; Scott, JE ensímgreiningarhönnun fyrir skimun með miklum afköstum. Í skimun með miklum afköstum. Aðferðir í sameindalíffræði (aðferðir og samskiptareglur); Janzen, WP, Paul, B., Ritstj.; Humana Press: Clifton, NJ, Bandaríkjunum, 2009; 565. bindi, bls. 107–126.

27. Brooks, HB; Geeganage, S.; Kahl, SD; Montrose, C.; Sittampalam, S.; Smith, MC; Weidner, JR Grunnatriði ensímgreininga fyrir HTS. Í prófunarleiðbeiningarhandbók; Markossian, S., Sittampalam, S., Grossman, A., Ritstj.; Eli Lilly & Company og NationalCenter for Advancing Translational Sciences: Bethesda, MD, Bandaríkin, 2004