Cistanche Deserticola þykkni eykur beinmyndun í beinþynningar--I. hluti

Tengiliður:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Te-Mao Li^aet a

Ágrip
Markmið Við könnuðum áhrif afCistanchedeserticolaMa. (CD) ábeinmyndunaf ræktuðum osteoblastum. Aðferðir Steinefnafræðilega hnúðamyndunargreiningin var notuð til að kanna in vitro áhrif CD(Cistanchedeserticola)ábeinmyndun. Alkalískur fosfatasi (ALP), beinformandi prótein (BMP)-2 og osteopontin (OPN) mRNA tjáning voru greind með magnbundinni rauntíma pólýmerasa keðjuverkun. Verkunarháttur CD(Cistanchedeserticola)útdráttur var rannsakaður með Western blotting. In vivo and-beinþynningaráhrif CD(Cistanchedeserticola)útdráttur var metinn í músum sem voru gerðar með eggjastokkum.
Helstu niðurstöður

geisladiskur(Cistanchedeserticola)útdráttur hafði engin áhrif á útbreiðslu, flutning eða sárgræðslu ræktaðra beinfrumuefna, en jók ALP, BMP-2 og OPN mRNA og steinefnamyndun beina. Mítógenvirkjaður próteinkínasa (MAPK) eða kjarnaþáttur (NF)-kB hemlar minnkuðu CD(Cistanchedeserticola)útdrætti af völdumbeinmyndunog ALP, BMP-2 og OPN tjáning. Hins vegar CD(Cistanchedeserticola)þykkni hafði ekki áhrif á beinþynningu. Auk þess geisladiskur(Cistanchedeserticola)þykkni kom í veg fyrir beintap sem orsakast af eggjastokkatöku in vivo.
Ályktanir

geisladiskur(Cistanchedeserticola)gæti verið skáldsagabeinmyndunlyf til meðferðar á beinþynningu.

Leitarorðbeinmyndun; Cistanchedeserticola; Kínversk jurt; beinþynningar

Cistanche deserticolaer gott fyrirbeinmyndun

Kynning

Bein er flókinn vefur sem samanstendur af nokkrum frumugerðum sem gangast undir stöðugt endurnýjunar- og viðgerðarferli sem kallast „beinendurgerð“. Tvær helstu frumugerðir sem bera ábyrgð á endurgerð beina eru beinþynningar, sem gleypa bein, og beinfrumuefni, sem mynda nýtt bein. Beinendurgerð er stjórnað af nokkrum almennum hormónum (td kalkkirtilshormóni, 1, 25-díhýdroxý D3 vítamíni, kynhormónum og kalsítóníni) og staðbundnum þáttum (td nituroxíði, prostaglandínum, vaxtarþáttum og cýtókínum).[1] Beinþynning verður til þegar uppsog og myndun beina er ósamræmd og umfram niðurbrot beina fer yfir beinbyggingu.[2] Núverandi meðferðir við beinþynningu fela í sér bisfosfónöt, kalsítónín og estrógen, sem eru beinuppsogshemlar sem viðhalda beinmassa með því að hindra beinþynningarvirkni.[3] Hins vegar eru áhrif þessara lyfja til að auka eða endurheimta beinmassa tiltölulega lítil, örugglega ekki meira en 2 prósent á ári.[3] Það er því þörf fyrir beinbyggjandi efni, eins og teriparatid, sem örva nýbeinmyndunog leiðrétta þá breytingu á örbylgjubyggingu sem er einkennandi fyrir staðfesta beinþynningu.[4,5] Vegna þess að nýbeinmynduner fyrst og fremst hlutverk beinþynninga, efni sem verka með því að annaðhvort auka fjölgun frumna úr beinfrumuætt eða örva aðgreining beinþynna geta aukið beinmyndun.[5,6]
Þrátt fyrir að leiðir beinþynningar séu enn óljósar, eru þær líklega tengdar minni aðgengi eða áhrifum beinvaxtarþátta, svo sem beinformandi próteina (BMP).[7] BMPs, sem eru byggingarlega tengd við umbreytandi vaxtarþátta-b yfirfjölskylduna, voru upphaflega auðkennd með getu þeirra til að framkalla utanlegsbein myndunhjá nagdýrum.[8] BMPs gegna mikilvægu hlutverki íbeinmyndunog aðgreining beinfrumna með því að örva virkni alkalísks fosfatasa (ALP) sem og myndun próteóglýkans, kollagens og osteopontíns (OPN).[9] Nýleg rannsókn fann tengsl á milli beinþynningar og sérstakra fjölbrigða í BMP-2, ALP og OPN genum, sem bendir til þess að þau tengist þróun beinþynningar.[10]

CistanchedeserticolaMa. (Orobanchaceae; skammstafað sem CD)(Cistanchedeserticola)er innfædd jurt í Kína og er mikið notuð í hefðbundnum lækningum sem lækningaefni vegna róandi, verkjastillandi og ónæmisörvandi eiginleika.[11] Nútíma lyfjafræðilegar rannsóknir hafa sýnt að CD(Cistanchedeserticola)útdrættir geta örvað ónæmi,[12] hreinsað sindurefna[13] og aukið virkni súperoxíðdismútasa.[14] Bólgueyðandi og andoxunarefni geta meðhöndlað beinþynningu með því að aukabein myndunog/eða bæla beinupptöku.[15,16] Hins vegar áhrif CD(Cistanchedeserticola)um starfsemi beinfrumna hefur ekki enn verið ákvarðað. Hér greinum við frá þeim geisladiski(Cistanchedeserticola)þykkni hafði ekki áhrif á útbreiðslu, flæði eða sárgræðsluvirkni ræktaðra beinfrumuefna, en jók ALP, BMP-2 og OPN tjáningu og steinefnamyndun beina. Að auki sýnum við að mítógenvirkjaður próteinkínasa (MAPK) og kjarnaþáttur (NF)-kB merkjaleiðir geta átt þátt í CD-miðlaðri aukningu á tjáningu gena og steinefnamyndun beina. Aftur á móti geisladiskurinn(Cistanchedeserticola)útdráttur bæli ekki beinþekjumyndun in vitro. Sérstaklega meðferð á músum með CD(Cistanchedeserticola)útdráttur kom í veg fyrir beintap af völdum eggjastokkanáms in vivo. Gögn okkar benda því til þess að geisladiskur(Cistanchedeserticola)má nota til að örvabeinmynduntil meðferðar á beinþynningu.

Cistanche deserticolaauka friðhelgi

Efni og aðferðir

Cistanche deserticola þykkni og efni

geisladiskur(Cistanchedeserticola)útdráttur var keyptur frá Chuang Song-Zong Pharmaceutical Company (Kaohsiung, Taívan). Útdráttur og einangrun CD(Cistanchedeserticola)var fylgt eftir eins og áður hefur verið lýst (á grundvelli litrófsgagna hafa þeir greint efnasamsetninguna þar á meðal beta-sítósteról, daukósteról, súrsteinssýru, tríakóntanól, akteósíð, betaín og fjölsykra).[17] Kanínu fjölstofna mótefni sértæk fyrir p-utanfrumu merkjastýrða kínasa (ERK), ERK, p-p38, p38, pc-Jun N-enda kínasa (JNK), JNK, p-p65 og p65 voru keypt frá Santa Cruz Biotechnology ( Santa Cruz, Bandaríkjunum). Osteocalcin ELISA settið var keypt frá Biosource Technology (Nivelles, Belgíu). C-enda telopeptíðin af tegund I kollagen ELISA settinu voru fengin frá Cross Laps (Herlev, Danmörku). P38 ríkjandi-neikvæða stökkbrigðið var útvegað af Dr. J. Han (South-Western Medical Center, Dallas, Bandaríkjunum). JNK ríkjandi-neikvæða stökkbrigðið var útvegað af Dr. M. Karin (University of California, San Diego, Bandaríkjunum). ERK2 ríkjandi-neikvæða stökkbrigðið var veitt af Dr. M. Cobb (South-Western Medical Center). Öll önnur hvarfefni voru fengin frá Sigma-Aldrich (St Louis, Bandaríkjunum).

Frumuræktun

Murine osteoblast frumulínan MC3T3-E1 var keypt frá American Type Culture Collection (ATCC; Rockville, Bandaríkjunum). Frumur voru ræktaðar í 95 prósent lofti, 5 prósent CO2 með a-MEM sem var bætt við 20 mm HEPES og 10 prósent hitaóvirkjuð fósturkálfasermi, 2 mm-glútamín, penicillín (100 einingar/ml) og streptómýsín (100 mg) /ml).

Mæling á steinefnamyndun hnúta

Myndun steinefnabundinna hnúða var metin eins og lýst er.[18] Í stuttu máli voru beinfrumur ræktaðar í æti sem innihélt C-vítamín (50 mg/ml) og b-glýserófosfat (10 mm) í tvær vikur og skipt var um miðil á þriggja daga fresti. Eftir ræktun með CD(Cistanchedeserticola)útdrætti í 12 daga, frumur voru þvegnar tvisvar með 20 mm tris-bufferðri saltlausn sem innihélt 0,15 m NaCl (pH 7,4), festar í ísköldu 75 prósent (v/v) etanóli í 30 mínútur, og loft- þurrkað. Kalsíumútfelling var ákvörðuð með því að nota alizarin red-S litun. Í stuttu máli voru etanólfastar frumur og fylki litaðar í 1 klst með 40 mm alizarin red-S (pH 4,2) og skolaðar mikið með vatni. Bundinn blettur var skolaður með 10 prósentum (w/v) cetýlpýridínklóríði og alizarin red-S í sýnunum var magnmælt með því að mæla gleypni við 550 nm og borið saman við staðlaða feril. Eitt mól af alizarin red-S bindur sértækt um það bil tvö mól af kalsíum.

Cistanche deserticolaer gott fyrirbeinmyndun

Magnbundin rauntíma pólýmerasa keðjuverkun

Heildar-RNA var dregið úr beinfrumum með TRIzol setti (MDBio Inc., Taipei, Taívan). Öfug umritun var framkvæmd með því að nota 2 mg heildar-RNA og oligo(dT) primer.[19,20] Megindleg rauntíma pólýmerasa keðjuverkun (qPCR) var framkvæmd með TaqMan® eins þrepa PCR Master Mix (Applied Biosystems, Carlsbad, BANDARÍKIN). Heildar cDNA var bætt við (100 ng á 25-ml hvarf) með raðsértækum frumurum og Taqman® rannsaka. Allir markgena frumrar og rannsakar voru keyptir í atvinnuskyni, þar á meðal b-aktín sem innra eftirlit (Applied Biosystems). qPCR mælingar voru framkvæmdar í þríriti á StepOnePlus raðgreiningarkerfi (Applied Biosystems). Hringrásarskilyrðin voru 10-mín. pólýmerasavirkjun við 95 gráður og fylgt eftir af 40 lotum af 95 gráðum í 15 sekúndur og 60 gráður í 60 sekúndur. Þröskuldurinn var settur fyrir ofan samanburðarbakgrunn sem ekki var sniðmát og innan línulegs fasa markgenamögnunar til að reikna út lotunúmerið þar sem afritið greindist (táknað CT).

Western blot greining

Frumulýsi voru útbúin eins og áður hefur verið lýst. [21,22] Prótein voru leyst upp með SDS-PAGE og flutt yfir á Immobilon pólývínýldíflúoríð himnur (Millipore, Billerica, Bandaríkjunum). Blettirnir voru lokaðir með 4 prósenta sermi albúmíni úr nautgripum í 1 klst við stofuhita og síðan rannsakað með kanínum and-manna mótefnum gegn p-65, eða p-p65 (1: 1000) í 1 klst. við stofuhita. Eftir þrjá þvotta voru blettirnir ræktaðir með peroxidasa-tengdu asna-and-kanínu auka mótefni (1: 1000) í 1 klst við stofuhita. Blettirnir voru sýndir með aukinni efnaljómun með því að nota X-OMAT LS filmu (Eastman Kodak, Rochester, Bandaríkjunum).

Beinþynning af völdum eggjastokkanáms

Kvenkyns ICR mýs, fjögurra vikna gamlar, 22~28 g, voru notaðar í þessa rannsókn. Mýs voru teknar úr eggjastokkum tvíhliða undir svæfingu með tríklórasetaldehýð (100 mg/kg) og viðmiðunarmýs voru sýndaraðgerðir (Sham) til samanburðar. Beinþéttni og steinefnainnihald bein voru mæld eftir inntöku á ýmsum styrkjum CD(Cistanchedeserticola)útdráttur á tveggja daga fresti í fjórar vikur. Heildarbeinþéttni líkamans og steinefnainnihald bein voru ákvörðuð með tvíorku röntgengleypnimæli (DEXA; XR-26; Norland, Fort Atkinson, Bandaríkjunum) með því að nota stillingu fyrir lítil einstaklinga eins og áður hefur verið lýst.[18, 23] Allar samskiptareglur voru í samræmi við leiðbeiningar stofnana og voru samþykktar af dýraverndarnefnd Kína læknaháskóla.

tölfræðigreining

Tölfræðileg greining var gerð með Prism 4.01hugbúnaði. (GraphPad Software Inc., San Diego, Bandaríkjunum). Gildin sem gefin eru eru meðal SEM. Tölfræðileg greining á milli tveggja sýna var gerð með t-prófi nemandans. Tölfræðilegur samanburður á fleiri en tveimur hópum var gerður með einhliða dreifigreiningu með Bonferroni's posthoc prófi. Í öllum tilvikum var P < 0,05="" talið="">

Cistanche deserticolaer gott fyrirbeinmyndun

Niðurstöður

Cistanche deserticolaútdráttur eykur steinefnamyndun beina af beinþynningum. Viðbót á geisladiskinum(Cistanchedeserticola)útdráttur í 24 eða 48 klst. hafði ekki áhrif á útbreiðslu osteoblast MC3T3-E1 frumna í músum í MTT prófi (gögn ekki sýnd). Vegna þess að beinfrumugreining er flókið ferli sem felur í sér frumufjölgun og flæði, prófuðum við einnig flutningsgetu MC3T3-E1 frumna eftir meðferð með CD(Cistanchedeserticola)útdráttur. Með því að nota Transwell og sáragræðslupróf fundum við þennan geisladisk(Cistanchedeserticola)útdráttur hafði ekki áhrif á flutning beinfrumuefna (gögn ekki sýnd). Myndun steinefnabundinna hnúða er eitt af vísbendingum um þroska beinþynningar. Alizarin rauð S litun sýndi að steinefnalausir hnúðar mynduðust þegar beinfrumur voru ræktaðir í tvær vikur í æti sem innihélt C-vítamín (50 ug/ml) og -glýserófosfat (10 mm), styrkleikaháðan hátt með því að bæta við CD(Cistanchedeserticola)(Mynd 1a). Því CD(Cistanchedeserticola)þykkni framkallaða beinhnútamyndun af ræktuðum beinþynningum, en ekki fjölgun þeirra eða flæði. Við skoðuðum líka hlutverk geisladiska(Cistanchedeserticola)útdráttur í RANKL-framkallaðri beinþynningarmyndun en fann engin áhrif (gögn ekki sýnd).

Cistanche deserticola þykkni eykur basískan fosfatasa, beinformandi prótein-2 og tjáningu osteopontíns í ræktuðum osteoblastum

Aðgreindar beinfrumur sýna aukna ALP virkni, sem tengist miklu magni ensímatjáningar.[18] Við fundum þá meðferð með CD(Cistanchedeserticola)útdráttur í 72 klst jók marktækt ALP virkni osteoblast (Mynd 1b). Með hliðsjón af mikilvægu hlutverki BMP-2, ALP og OPN í beinþynningaraðgreiningu, prófuðum við hvort CD(Cistanchedeserticola)útdráttur hefur áhrif á beinþynningaraðgreiningu með því að stjórna tjáningu BMP-2, ALP og OPN. Meðferð á frumum með CD(Cistanchedeserticola)útdrættir aukna mRNA tjáningu ALP, BMP-2 og OPN á styrkleikaháðan hátt (mynd 1c), sem sýnir fram á að CD(Cistanchedeserticola)draga út framkallaða aðgreiningu beinþynningar með því að hækka ALP, BMP-2 og OPN tjáningu.

Cistanche deserticola þykkni eykur myndun beinhnúta í gegnum mítógenvirkjaða prótein kínasa feril

Það hefur verið greint frá því að MAPK gegnir mikilvægu hlutverki íbeinmyndun[24,25] svo við skoðuðum næst hvort þessi boðleið tengist CD(Cistanchedeserticola)steinefnaútdráttur af völdum útdráttar. Formeðferð á frumum með ERK hemli U0126, p38 hemli SB203580 eða JNK hemli SP600125 minnkað CD(Cistanchedeserticola)útdrætti aukin steinefnamyndun beina (myndir 2a, 3a og 4a). Ennfremur lokuðu hemlarnir einnig CD(Cistanchedeserticola)útdráttarframkallað ALP, BMP-2 og OPN tjáning (myndir 2b–4c). Flutningur frumna með ERK2, p38 eða JNK stökkbreyttum minnkaðri CD(Cistanchedeserticola)útdráttaraukning á ALP, BMP-2 og OPN mRNA tjáningu (myndir 2c, 3c og 4c). Næst skoðuðum við ERK, p38 og JNK virkjunina beint eftir CD(Cistanchedeserticola)þykkni meðferð. Ræktun frumna með CD(Cistanchedeserticola)útdráttur framkallaði ERK, p38 og JNK fosfórun (myndir 2d, 3d og 4d). Þess vegna hafa ERK, p38 og JNK milligöngu um aukningunabeinmyndunframkallað af geisladiski(Cistanchedeserticola)meðferð á beinþynningum.

Cistanche deserticola þykkni eykur myndun beinhnúta í gegnum kjarnaþátt-kB ferilinn

Eins og áður hefur komið fram er NF-kB virkjun nauðsynleg fyrirbeinmyndun.[26,27] Næst meðhöndluðum við beinfrumur með NF-kB hemlum pýrrólidíndíþíókarbamati (PDTC) og N-tósýl-L-fenýlalanín klórmetýl ketón (TPCK) voru keyptir frá Calbiochem (Darmstadt, Þýskalandi) til að ákvarða hvort NF-kB virkjun sé þátt í CD(Cistanchedeserticola)steinefnaútdráttur af völdum útdráttar. Mynd 5a sýnir að formeðferð beinþynningar með PDTC eða TPCK hamlaði CD(Cistanchedeserticola)myndun beinhnúða af völdum útdráttar og minnkaði einnig aukningu á ALP, BMP-2 og OPN tjáningu (Mynd 5b og 5c). Fosfórun á NF-kB p65 undireiningunni er vísbending um NF-kB virkjun; [28] í samræmi við þetta fundum við að CD(Cistanchedeserticola)útdráttur jók p65 fosfórýleringu í beinfrumum (mynd 5d). Þessar niðurstöður gáfu til kynna að NF-kB virkjun er mikilvæg fyrir CD útdrátt af völdum ALP, BMP-2 og OPN tjáningu og myndun beinhnúta.

Mynd 4 Þátttaka c-Jun N-enda kínasa (JNK) íCistanchedeserticola(CD) útdrætti af völdum beinsteinefnamyndunar í beinþynningum. (a) Frumur voru húðaðar í 24-brunnsplötur og ræktaðar í æti sem innihélt C-vítamín (50 mg/ml) og b-glýserófosfat (10 mM) í tvær vikur. Frumurnar voru samhliða meðhöndlaðar með CD(Cistanchedeserticola)útdráttur (26 mg/ml) auk SP600125 (3 mM). Myndun steinefnabundinna hnúða var metin með alizarin rauðum-S litun (n=5). (b, c) Frumur voru formeðhöndlaðar með SP600125 í 30 mínútur eða transsýktar með JNK stökkbreyttum eða 24 klst. fylgt eftir með örvun með CD útdrætti, og basískum fosfatasa (ALP) virkni og ALP, beinformandi prótein (BMP)-2 og osteopontin (OPN) mRNA tjáning var mæld með ALP setti og magnbundinni rauntíma pólýmerasa keðjuverkun. (d) Frumur voru meðhöndlaðar með CD útdrætti í tiltekið tímabil og p-JNK tjáning var skoðuð með Western blotting. *P< 0.05,="" compared="" with="" control="" group;="">< 0.05,="" compared="" with="" cd="">(Cistanchedeserticola)hópur sem hefur fengið útdrætti.

Hömlun á beinatapi með Cistanche deserticola þykkni í músum sem hafa verið gerðar með eggjastokkum

Til að skoða áhrif CD(Cistanchedeserticola)útdráttur við beinmissi, var beinþynning framkölluð í kvenkyns músum með eggjastokkatöku. Eins og búist var við, sýndu mýs sem höfðu verið gerðar með eggjastokkum, minnkaðan heildarbeinþéttni líkamans og beinsteinainnihald (Mynd 6a og 6b). Meðferð með CD(Cistanchedeserticola)þykkni í fjórar vikur hamlaði tapi á beinþéttni og beinþéttni á skammtaháðan hátt (mynd 6a og 6b). Styrkur ALP í blóði getur endurspeglað beinþynningarvirkni.[29] Eins og sýnt er á mynd 6c, CD(Cistanchedeserticola)útdráttur hamlaði minnkun á ALP virkni í sermi af völdum eggjastokkanáms. Auk þess geisladiskur(Cistanchedeserticola)þykkni jók einnig magn osteókalsíns, merki umbeinmyndun, og minnkaði magn C-enda telopeptíða af kollageni af tegund I, merki um beinupptöku (Mynd 6d og 6e). Þessar niðurstöður styðja þannig virkni og virkni CD(Cistanchedeserticola)þykkni til að koma í veg fyrir beinmissi in vivo.

Mynd 6 Hömlun á eggjastokkanámum af völdum minnkunar á steinefnaþéttni og beinþéttniCistanchedeserticola(CD) útdráttur. Kvenkyns ICR mýs voru gerðar sýndaraðgerð eða voru teknar úr eggjastokkum. Mýs með eggjastokkaskurði voru meðhöndlaðar með tilgreindum styrk CD(Cistanchedeserticola)útdráttur með inntöku. Heildarbeinþéttleiki líkamans (a), steinefnainnihald beins (b), virkni alkalísks fosfatasa (ALP) í sermi (c), osteókalsíns í sermi (d) og C-enda telopeptíð í sermi af kollageni af tegund I (e), voru ákvörðuð fjórir. vikum eftir aðgerð. Gögn eru sett fram sem meðal SE, n=8–10 mýs/hópur. *P < 0.05,="" samanborið="" við="" sýndarmennsku;="" #p="">< 0,05,="" samanborið="" við="" hóp="" sem="" var="" tekinn="" úr="">

UMRÆÐA

Smelltu hér til að fá upplýsingar um II. hluta (Umræður og ályktun) þessarar greinar.

Frá: 'Cistanchedeserticolaútdráttur eykstbeinmynduní beinþynningar' byTe-Mao Li^ao.fl

---© 2012 Höfundarnir. JPP © 2012 Royal Pharmaceutical Society 2012Tímarit lyfjafræði og lyfjafræði, 64, bls 897–907