Genklónun, hagnýt auðkenning, byggingar- og tjáningargreining á súkrósasyntasa frá Cistanche Tubulosa Ⅱ

Niðurstöður og greining

1 Námuvinnsla og klónun súkrósa synthasa gena í Cistanche tubulosa

The amino acid sequence of the identified Arabidopsis thaliana sucrose synthase AtSus1 was used as a template[16], and sequence alignment was performed in the Cistanche tubulosa transcriptome database by local Blastp. At the same time, two sucrose synthase gene sequences with FPKM values greater than 10 were screened out in combination with transcriptome gene annotation and gene expression abundance data, which were named CtSus and CtSus1, respectively. The comparative transcriptome data of different parts of Cistanche (haustoria, underground parts and aerial parts) were further analyzed. The distribution of chemical components in different parts of Cistanche plants has been studied in depth. The results showed that glycoside compounds represented by phenylethanoid glycosides in Cistanche are mainly present in its underground parts, with the highest content in the haustoria[22]. In the early stage of this study, the content of phenylethanoid glycosides in plant materials used for comparative transcriptome sequencing of different parts was also determined, confirming that the content of phenylethanoid glycosides in different parts of Cistanche tubulosa was different in the following manner: haustorium>underground part>>lofthluti.

Þess vegna voru tjáningarstig FPKM gildi tveggja frambjóðenda súkrósasyntasa gena sem fengust í fyrstu skimun í umritagögnum mismunandi hluta Cistanche tubulosa staðlað með Z-Score og mismunagreining var framkvæmd (Mynd 1A). Niðurstöðurnar sýndu að CtSus genið hafði hæsta tjáningarstigið í haustorium og tjáningarstigið í neðanjarðarhlutanum var hærra en í lofthlutanum, sem var í samræmi við uppsöfnunarmynstur glýkósíðefna í mismunandi hlutum Cistanche tubulosa, á meðan tjáningarstig CtSus1 gensins í haustorium var lágt. Þess vegna, á grundvelli ofangreindra niðurstaðna, var CtSus genið valið fyrir síðari raðmögnun, utanaðkomandi tjáningu og starfræna auðkenningu. Með því að nota Cistanche tubulosa cDNA sem sniðmát var einbandsafurð fengin við ~2500 bp eftir PCR mögnun (Mynd 1B). PCR afurðin var endurheimt úr hlaupi og bundin við klónunarferjuna og kóðunarsvæði markgensins í fullri lengd var fengið með raðgreiningu. Lengd CtSus röðarinnar var 2418 bp.

Mynd 1 Genkönnun og klónun CtSus frá C. tubulosa og lífupplýsingagreining á kóðuðu próteini þess. A: Tjáningarmagn CtSus og CtSus1 gena í mismunandi hlutum C. tubulosanormalized sem Z-Scores byggt á FPKM gildi þeirra; B: Genmögnun á CtSus; M: DNA merki;C: Íhaldssamt lén CtSus próteins spáð af SMART; D: Margföld röð röðun CtSus og súkrósa synthasa auðkennd frá öðrum plöntum þar á meðal Arabidopsis thaliana, Solanumtuberosum og Albuca bracteata. Súkrósa nýmyndun lén og sykur flytja lén eru táknuð með rauðum og bláum kassa, í sömu röð; E: Sýklafræðileg greining á CtSus og súkrósasyntasa frá öðrum plöntum; F: SDS-PAGE greining á misleitri tjáningu CtSus með því að nota pCold™ I vektor í E. coli. Braut 1: Próteinmerki; Braut 2: Flotflæðishluti; 3. braut: Úrkomubrot. Rauða örin sýnir CtSus próteinið. G: Colony PCR af einum klóni sem inniheldur bæði tvö raðbrigða plasmíð. M: DNA merki; 1: pET-28a-UGT71BD1; 2: pCold™ I-CtSus

HETIAN DICHEN CISTANCHE RÆKTAR BAESES Í SAMSTARF VIÐ PEKING HÁSKÓLA

Stuðningsþjónusta Wecistanche - Stærsti útflytjandi cistanche í Kína:

Netfang:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Sími:+86 15292862950

SMELLTU FYRIR NEIRI UPPLÝSINGAR

2 Lífupplýsingagreining á CtSus geni og kóðuðu próteini þess

2.1 Greining á eðlisefnafræðilegum eiginleikum CtSus og spá um uppbyggingu yfirhimnuléns

Eðlisefnafræðilegir eiginleikar CtSus kóðaðs próteins voru greindir með ProtParam nethugbúnaði. Próteinið inniheldur 805 amínósýrur, með sameindaformúluna C4189H6548N1104O1187S28 og hlutfallslegan mólmassa 92266,44; fræðilegi jafnrafpunkturinn er 6.00; óstöðugleikastuðullinn II er 35,45, sem er stöðugt prótein; heildarmeðal vatnssækni (GRAVY) er -0,187, sem er vatnssækið prótein. MHMM 2.0 var notað til að spá fyrir um himnusvið súkrósasyntasa CtSus og niðurstöðurnar sýndu að próteinið sem þetta geni kóðar hefur ekkert yfirhimnulén.

HETIAN DICHEN CISTANCHE RÆKTAR BAESES Í SAMSTARF VIÐ PEKING HÁSKÓLA

2.2 Spá um CtSus íhaldssama uppbyggingu og röðun

Nethugbúnaðurinn SMART var notaður til að spá fyrir um íhaldssöm lén CtSus próteins (Mynd 1C). Próteinið inniheldur tvö íhaldssöm lén. N-endinn (amínósýrur 8 til 553) er súkrósa synthasa lénið, sem getur hvatt afturkræf viðbrögð UDP og súkrósa til að mynda UDP-glúkósa og D-frúktósa; C-endinn (amínósýrur 557 til 739) tilheyrir glýkósýltransferasa léninu (mynd 1D). DNAMAN hugbúnaður var notaður til að samræma CtSus próteinröðina við súkrósa syntasa amínósýruröðina í NCBI gagnagrunninum (tafla 2). Niðurstöðurnar sýndu að CtSus amínósýruröðin sýndi mikla líkingu við súkrósasyntasaröð frá öðrum plöntum. Mesta líkindin milli CtSus og súkrósasyntasaröðarinnar úr sesam (Sesamum indicum) var 94,78% og líkindin við súkrósasyntasaröðina frá öðrum plöntum var einnig yfir 65%, sem gefur til kynna að súkrósasyntasa frá plöntum hafi mikla röð. náttúruvernd.

Tafla 2 Amínósýruröð líkindi milli CtSus og súkrósa synthasa auðkennd frá annarri plöntu

2.3 Sýklafræðileg greining

Fræðslutréð sem smíðað var með MEGA hugbúnaði var notað til að greina sýklafræðilegt samband milli súkrósasyntasans CtSus frá Cistanche tubulosa og súkrósasyntasa frá öðrum plöntum. Niðurstöðurnar eru sýndar á mynd 1E. Súkrósasyntasar frá plöntum sýna aðgreindar þróunargreinar í tvíblöðungum (svæði I og II) og einblaða (svæði III). CtSus er í tvíþættu greininni og raðirnar sem eru náskyldar CtSus eru allar frá Lamiaceae plöntum (Cistanche tubulosa er Lamiaceae Orobanchaceae planta), en hin greinin er aðallega samsett af Solanales plöntum, sem gefur enn frekar til kynna mikla varðveislu og samstöðu. af súkrósa synthasa genum sem eru unnin úr plöntum í þróun plantna í sömu röð. Meðal þeirra er súkrósasyntasinn PrSus (AEN79500.1) frá Phelipanche ramosa af Orobanchaceae plöntunni næst CtSus.

3 Utanaðkomandi tjáning og virknigreining á CtSus

3.1 Exogen tjáning CtSus gena

pET-28a-CtSus, pET-24b-CtSus og pCold™ I-CtSus plasmíðin sem staðfest voru með raðgreiningu voru flutt inn í tjáningarhæfa E. coli Transetta (DE3) og jákvæðu klónarnir voru skimaðir með PCR nýlendu til að sannprófa raðgreiningu. Fengdu raðbrigða tjáningarstofnarnir voru framkallaðir af IPTG lágum hita fyrir prótein tjáningu og bakteríunum var safnað með skilvindu. Lysis buffer var bætt við til að brjóta bakteríurnar til að fá ofanvatnið og botnfallið og SDS-PAGE var framkvæmd til að greina. Niðurstöðurnar sýndu að þegar pET-28a og pET-24b voru notuð sem tjáningarferjur, var CtSus ekki tjáð í E. coli, en þegar pCold™ I var notað sem tjáningarvigur, skýr CtSus raðbrigða próteinband greindist á ~100 kDa svæðinu, sem var í samræmi við fræðilega spáð hlutfallslegan mólmassa þess 92,2 kDa (Mynd 1F).

HETIAN DICHEN CISTANCHE RÆKTAR BAESES Í SAMSTARF VIÐ PEKING HÁSKÓLA

3.2 Heilfrumubreyting

Til að staðfesta bráðabirgðavirkni CtSus var samtjáningarstofn af CtSus og glýkósýltransferasa geninu UGT71BD1 smíðaður. UGT71BD1 var klónað og auðkennt úr Cistanche tubulosa og er UDP-glúkósýltransferasi sem getur víða tekið við arómatískum efnasamböndum eins og fenýletanóíð glýkósíðum, mismunandi tegundum flavonoids, stilbene og kúmaríns sem viðtaka og hvatt glúkósýlerunarhvarf hvarfefnis-lúkósahópsins með UDP-hýdroxýglúkósi. sem sykurgjafi[18]. Innleiðing CtSus getur fræðilega séð fyrir nægjanlegri glýkósýlgjafa UDP-glúkósa fyrir glúkósýlerunarhvarfið sem hvatt er af UGT71BD1, og stuðlar þar með að hvarfjafnvægi til að fara í átt að myndun glýkósýleringarafurða og auka þar með afrakstur glýkósýlunarafurða. pCold™ I-CtSus plasmíðinu og pET-28a-UGT71BD1 plasmíðinu var samtímis umbreytt í tjáningarhæfa E. coli Transetta (DE3). Stakir klónar sem innihéldu bæði raðbrigða plasmíðin voru skimuð með nýlendu PCR og jákvæðir raðbrigða tjáningarstofnar voru fengnir með sannprófun á raðgreiningu (Mynd 1G). Samtjáning tvöföld gena var framkölluð in vitro og pET-28aUGT71BD1 stak genatjáningarstofninn var notaður sem viðmiðunarhópur. Virkni CtSus við að hvetja myndun UDP-glúkósagjafa var staðfest með frumumbreytingu. Niðurstöður HPLC og háupplausnarmassagreininga sýndu að þegar heilfrumubreytingarviðbrögð voru framkvæmd með aesculetin 1 og resveratrol 2 sem hvarfefni, greindist myndun augljósra glýkósýleringarafurða eftir 24 klst umbreytingu, eins og sýnt er á mynd 2.

Mynd 2 Heilfrumuumbreyting hvarfefnis 1 eða 2 með raðbrigðastofni sem inniheldur UGT71BD1 eða raðbrigða stofn sem inniheldur UGT71BD1 tengingu við CtSus, í sömu röð. A: HPLC litskiljun af heilfrumu umbreytingu hvarfefnis 1. Uppgötvun bylgjulengd var 360nm; B: HRESI-MS og MS2 litróf vöru 1a; C: HPLC litskiljun á heilfrumuumbreytingu hvarfefnis 2; Uppgötvunarbylgjulengdin var 330 nm. D: HRESI-MS litróf afurða 2a og 2b

Þegar 1 (m/z 179.034 4 [M+H]+, sameindaformúla C9H6O4) var notað sem hvarfefni, var litskiljunartoppurinn 1a (m/z 41.087 2 [M+H] +, spáð sameindaformúla C15H16O9) greindist eftir 5,39 mín, sem var í samræmi við UV frásog undirlagsins og samanburðarafurðarinnar. Á sama tíma greindist brotatoppurinn m/z 179.033 4 [M+H]+ í MS2 litrófinu 1a, sem var framleitt með því að 1a tapaði glúkósasameind (162 Da), sem gefur til kynna að 1a væri afurð hvarfefnis 1 sem tengdist glúkósasameind. Viðskiptahlutfallið var reiknað út með því að samþætta toppsvæðið. Það kom í ljós að umbreytingarhlutfall UGT71BD1 heilra frumna sem hvata hvarfefni 1 til að mynda glýkósýleraða vöru 1a var 71,87%, á meðan viðbót CtSus jók umbreytingarhraða hvarfsins í 95,84%, sem var 1,3 sinnum meiri en viðmiðunarhópsins. Þegar hvarfefnið var efnasamband 2 (m/z 227.072 5 [MH]-, sameindaformúla C14H12O3), toppar litskiljun vörunnar 2a (m/z 389.123 4 [MH]-, spáð sameind formúla C20H22O8) og 2b (m/z 575.175 9 [M+Na]+, spáð sameindaformúla 26H32O13) greindust við 10.32 og 6.52 mín, í sömu röð, sem voru í samræmi við einkennandi UV frásog undirlagsins og eftirlitsvaran. Brotstopp greindist við 227.071 3 [MH]-, sem var framleitt með tapi á einni glúkósasameind (162 Da), sem gefur til kynna að 2a væri afurð hvarfefnis 2 sem tengdist einni glúkósasameind. Með því að bera saman við gögnin í bókmenntum [18] og upplýsingar um massarófsmælingar, var komist að því að vara 2b væri afurð hvarfefnis 2 sem tengdist tveimur glúkósasameindum. Viðskiptahlutfallið var reiknað út með því að nota samþætta toppsvæðið. Það kom í ljós að viðbót CtSus gæti aukið umbreytingarhraða glýkósýleringarhvarfs hvarfefnis 2 úr 64,01% í 78,51%, þar á meðal jókst afrakstur einsykruafurðar 2a úr 45,09% í 63,58% og afrakstur tvísykruafurðar 2b breyttist úr 18,92% í 14,93%.

3

HETIAN DICHEN CISTANCHE RÆKTAR BAESES Í SAMSTARF VIÐ PEKING HÁSKÓLA

3.3 CtSus

Raðbrigðapróteinhreinsun og in vitro hvatavirkni ensíma. Niðurstöður tilrauna um að breyta frumum í heilum frumum bentu til þess að CtSus hafi þá virkni að hvata framleiðslu á virkum glúkósagjafa UDP-glúkósa. Til að sannreyna enn frekar hvatavirknina með in vitro ensímhvatningu, var samrunaprótein CtSus gensins í pCold™ tjáningarkerfi aðskilið og hreinsað með sækniskiljun. Niðurstöðurnar sýndu að þegar pCold™ I var notað sem tjáningarferju, var raðbrigða próteinið tjáð í miklu magni, en aðallega í botnfallinu. Þegar pCold™ TF var notað sem tjáningarferju, var CtSus gen tjáð í miklu magni í E. coli (mynd 3A). Samrunapróteinið var hreinsað með HisTrap FF sækniskiljun fyrir in vitro ensímhvarf. Niðurstöðurnar eru sýndar á mynd 3B. Þegar súkrósa og UDP voru notuð sem hvarfefni, samanborið við neikvæða viðmiðunarhópinn, greindist nýr afurðatoppur eftir 10,32 mín. Varðveislutími þess og UV frásog voru í samræmi við UDP-glúkósa. Varan reyndist vera UDP-glúkósa í samanburði við staðalinn. Hins vegar, þar sem samrunapróteinið sem tjáð er af pCold™ TF tjáningarferjunni inniheldur stórt kveikjuþátta leysanlegt merki (merkjapróteinstærð er 48 kDa), mun það hafa mikil áhrif á hvatavirkni próteinsins. Þess vegna var merkið á samrunapróteininu skorið enn frekar með Factor Xa ensíminu og CtSus próteinið án utanaðkomandi merkja var hreinsað (Mynd 3A). Próteinið fór í in vitro ensímhvatningu og niðurstöðurnar sýndu að afrakstur UDP-glúkósa jókst úr 3,53% í 10,66% (Mynd 3B). Ofangreindar niðurstöður staðfestu virkni CtSus við að hvetja framleiðslu á UDP-glúkósa með in vitro ensímhvata, og sýndu einnig að tilvist stórs sæknimerkis stuðlar að leysanlegri tjáningu CtSus, en það mun einnig hafa veruleg áhrif á vitro hvatavirkni ensímsins.

Mynd 3 Misleitt tjáning og starfræn auðkenning á CtSus. A: SDS-PAGE greining á CtSus próteinum. Braut 1: Próteinmerki; Braut 2: Raðbrigða CtSus með trigger factor; Braut 3: Trigger13factor merki klofning með því að nota Factor Xa próteasa til að gefa CtSus próteinið merkt með rauðu örinni. B: Invitro ensímgreiningar sem nota samrunaprótein og kveikja þáttalaus CtSus prótein til að hvetja nýmyndun UDP-glúkósa í nærveru súkrósa og UDP, í sömu röð, með viðmiðunarstaðli UDP-glúkósa. Soðið prótein var notað sem viðmiðunarhópur við sömu aðstæður. Uppgötvunarbylgjulengdin var 260 nm