Cistanche fjölsykrur auka frásog echinacoside in vivo og hafa áhrif á örveru í þörmum

Tengiliður: emily.li@wecistanche.com

Zhifei Fu, o.fl

Ágrip

Fjölsykrurnar ogfenýletanóíð glýkósíðfráCistanche deserticolaSýnt hefur verið fram á ýmsa heilsufarslegan ávinning, hins vegar eru gagnvirk áhrif á milli þessara tveggja tegunda efnasambanda in vivo ekki þekkt í smáatriðum. Markmið þessarar rannsóknar var að kanna samverkandi verkun cistanche fjölsykra með fenýletanóíð glýkósíði og áhrif fjölsykra á örveru í þörmum. Sprague-Dawley rottur voru fóðraðar með mismunandi tegundum af cistanche fjölsykrum í 20 daga, á síðasta degi var öllum rottum gefiðechinacosidevið 100 mg/kg. Niðurstöðurnar voru aðallega bornar saman út frá mismun á lyfjahvörfum, samsetningu örveru í þörmum og innihaldi stuttkeðju fitusýra. Niðurstöðurnar gáfu til kynna að allar cistanche fjölsykrurnar, þar með talið óhreinar fjölsykrur, eru hásameindafjölsykrurþyngdar fjölsykrur, og fjölsykrur með litlum mólþunga, gætu stjórnað fjölbreytileika örveru í þörmum, aukið gagnlegar bakteríur og sérstaklega aukið vöxt Prevotella spp. auk þess að bæta framleiðslu á stuttkeðju fitusýrum og frásog echinacosides. Með því að kanna samverkandi virkni fjölsykrna með litlum sameindum, benda þessar niðurstöður til þess að cistanche fjölsykrur, sérstaklega fjölsykrur með litla sameindarþyngd, gætu verið notaðar sem örverumeðferð í þörmum til heilsueflingar.

Leitarorð:CistanchedeserticolafjölsykraEchinacosideÞarma örvera

Smelltu hér til að fá frekari upplýsingar um cistanche vörur

1. Inngangur

Á undanförnum árum hefur komið í ljós að fjölsykrur móta samsetningu örveru í þörmum og að breytingar geta miðlað margvíslegu næringarupptöku [1], sem framleiðir lífeðlisfræðilega virkni [2,3]. Sýnt hefur verið fram á að fjölsykrur úr hefðbundinni kínverskri læknisfræði (TCM) séu tilvalin til að stjórna örverum í þörmum og sýndu prebiotic áhrif. Í meltingarfærum sýna fjölsykrurnar og nokkur lítil sameindasambönd óhjákvæmilega nokkur áhrif á líffræðilega starfsemi [4]. Sem ein tegund af aðal virka efninu í Panax ginseng, sem hefur verið mikið notað í þúsundir ára, sýndu fjölsykrurnar góðaframföríþarmaEfnaskiptiogfrásogafginsenósíðurin vivo [5]. Codonopsis pilosula fjölsykrur sýndu hvetjandi áhrif frásogs sapónína í ristilbólgumúsum af völdum dextransúlfatnatríums [6]. Ganoderma lucidum fjölsykrur, sérstaklega hámólþungahlutinn, kom í ljós að hafaprebioticaðgerðirí líkönum af fituríku mataræði af völdum gut dysbiosis músa [7]. Longan fjölsykrur stjórnuðu örveru í þörmum og umbrotsefnum í þörmum (auka innihald pýruvats og bútanóats) til að framleiða ónæmisbælandi virkni [8].

Cistanche deserticola, sem hefðbundin kínversk læknisfræði, hefur verið mikið notað sem fæðubótarefni í Kína. Lyfjafræðilegar rannsóknir sýndu að það sýnditaugaverndandi, ónæmisbælandi, hormónajafnvægi, andstæðingur-þreytu, andstæðingur-bólgueyðandi, lifrarvörn,andstæðingur-oxandi, andstæðingur-baktería, andstæðingur-veiru, ogandstæðingur-æxliáhrif [9]. Efnafræðileg greining sýndi að fenýletanóíð glýkósíð og fjölsykrur voru helstu virku innihaldsefnin. Echinacoside, helsta fenýlethanoid glýkósíð í C. deserticola, hefur sýnt víðtæka lyfjafræðilega verkun, hins vegar er lyfjahæfni þess takmörkuð vegna lélegs aðgengis, hröðra og víðtækra umbrota in vivo. Rannsóknir hafa staðfest að echinacoside gæti umbrotnað af örveru í þörmum in vitro [10,11]. Hins vegar hafa sönnunargögnin in vivo ekki verið rannsökuð. Eins og við vitum gegndi örvera í þörmum mikilvægu hlutverki við að miðla umbrotslífvirkni náttúrulyfja. Þess vegna var meginmarkmið þessarar vinnu að kanna áhrif frácistanche fjölsykrurá örveru í þörmum og áhrif á efnaskipti echinacosides.

2. Efniviður og aðferðir

2.1. Efni og kemísk efni

Cistanche deserticola YC Ma var fengin frá Alashan, Inner Mongolia Mandela sand industry Development Co., LTD, Kína. Þau voru staðfest af prófessor Lijuan Zhang (Tianjin háskólinn í hefðbundinni kínverskri læknisfræði). Skírteinissýni var afhent á rannsóknarstofu okkar. Staðlað efni eins og echinacoside, acteoside og chlorogenic acid var fengið frá National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products (Peking, Kína). Hreinleiki hvers staðals var meiri en eða jafnt og 98 prósent. Asetónítríl og metanól af litskiljunargráðu voru keypt frá Fisher Scientific (Pitts burgh, PA). Maurasýra var keypt frá Anaqua Chemical Supply Inc. (Wilmington, Bandaríkjunum). Hin efnafræðilegu hvarfefnin voru af greiningargráðu og keypt frá Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. (Shanghai, Kína).

Sprague-Dawley karlkyns rottur (200–220 g) voru útvegaðar af Beijing HFK Bioscience CO., LTD (Beijing, Kína, leyfisnr. SCXK (Jing) 2014- 0004). Öll dýrin voru ræktuð og hýst við SPF aðstæður í dýraaðstöðunni. Tilraunin var framkvæmd í samræmi við leiðbeiningarnar sem settar voru af dýraverndinni og notar nefnd TJUTCM og í samræmi við leiðbeiningar um umönnun og notkun tilraunadýra sem gefin voru út af US National Institute of Health (NIH útgáfunúmer 85–23, endurskoðuð 1996 ). Eftir 1 viku aðlögunartímabil var rottum skipt af handahófi í fjóra hópa: samanburðarhóp, heildarfjölsykruhóp, hásameindafjölsykruhóp og lágsameindafjölsykruhóp. Í hverjum hópi voru 6 rottur sem voru ræktaðar í sama búri.

2.2. Cistanche fjölsykrur undirbúningur

3.0 kg af Cistanche deserticola YC Ma var hreinsað og þurrkað við 40 gráður í loftþurrkandi ofninum, síðan mulið í gróft duft. Þurrt grófa duftið var dregið út með 85% etanóli vatnskenndu (v/v) við 60 gráður tvisvar og 2 klst í hvert skipti. Hlutföllin á föstu formi og vökva voru 1:12 og 1:10, í sömu röð. Jurtaleifarnar voru dregnar út með vatni við 100 gráður enn tvisvar sinnum, útdráttartíminn og hlutfall fasts og vökva var það sama með 85 prósent etanóli. Vatnslausnin var sameinuð og þétt undir lækkuðum þrýstingi og síðan botnfelld í 80 prósent etanóli, sem stóð við 4 gráður í 24 klst. Botnfallið var einangrað með skilvindu við 8000 rpm í 10 mínútur við 4 gráður og síðan frostþurrkað til að fá heildarfjölsykrurnar (ZT). ZT var síðan leyst upp í afjónuðu vatni og síað á 100 kDa holtrefja ofursíunarhimnu, hlífðar ísíunar hásameindafjölsykrum (HM) var safnað saman. Gegndrætt síuvökvinn var síaður með 6 kDa ofursíunarhimnu. Haldandi síunarefnisfjölsykrurnar (MM) og gegnsýrðu síuvökvans lágsameindafjölsykrurnar (LM) fengust.

2.3. Aðal einkenni cistanche fjölsykra

Innihald fjölsykrunnar var ákvarðað með brennisteinssýrufenólaðferðinni með glúkósa sem staðal [12]. Heildarpróteininnihald var ákvarðað með BCA aðferðinni [13]. Greining á einsykrum samsetningu var framkvæmd með HPLC (UltiMate 3000 kerfi) með SinoPak C18 súlu (5 μm, 150 mm × 4,6 mm) og díóða fylkisskynjara (VWD-3000). Litskiljun á PMP (1-fenýl-3- metýl-5-pýrasólón) forsúluafleiðum var framkvæmd með því að nota 100 mM fosfatjafna og asetónítríl í hlutfallinu 82:18 (v/v) , prósent ) sem hreyfanlegur fasi við flæðihraða 1,0 ml/mín. 10 μL af hverju sýni var sprautað og 30 mínútur í greiningartíma með greiningu við 245 nm. Gagnaöflun og úrvinnsla var framkvæmd með Chromeleon hugbúnaði 7.1 (Dionex, Sunnyvale, CA, Bandaríkjunum).

Mólþunginn (Mw) var ákvörðuð með hágæða stærð útilokunarskiljun (HPSEC, UltiMate 30{{10}}0 kerfi), búið TSK gel G3000 PWXL (7,8 × 300,0 mm, Tosoh, Japan) og TSK gel GMPWXL (7,8 × 300,0 mm, Tosoh, Japan) súlu og RefractoMax521 brotstuðulsskynjara (RID). Sýnin voru skoluð með 0,1 mL/L Na2SO4 við flæðihraða 0,5 mL/mín. Hitastigi súlunnar var haldið við 35 gráður. Dextran sem staðlar og staðalferillinn var teiknaður í samræmi við skolunartímann sem teiknaður var á móti lógaritma mólþunga.

2.4. Rannsókn á lyfjahvörfum

Blóðsýnum var safnað úr innri kantinum við {{0}} klst., 0.083 klst., 0.167 klst., 0.25 klst, 0.5 klst., 0.75 klst., 1.0 klst., 2.0 klst., 3.{{20}} klst., 4.0 klst., 6.0 klst., 8.0 klst., 10 klst., 12 klst. og 24 klst. eftir gjöf echinacosides (100 mg/kg). Plasmasýni voru fengin með skilvindu í 10 mínútur við 7500 pm. Í 100 μL af plasmasýninu var bætt við 10 μL af IS (klórógensýru) lausn og 500 μL af metanóli. Blandan var síðan hrærð í 3 mínútur og skilvindu við 14,000 snúninga á mínútu í 10 mínútur. Vökvanum var safnað saman og þurrkað í köfnunarefni við stofuhita. Í kjölfarið var leifin leyst upp í 100 μL 50 prósent vatnskenndu metanóli, skilvindu við 14,000 snúninga á mínútu í 10 mínútur aftur. Að lokum var 3 μL af flotinu sprautað í LC-MS/MS kerfið til greiningar. Sýnin voru greind með aðferðinni samkvæmt áður greint. Hreyfanlegur fasi samanstóð af CH3CN (leysi A) og H2O (inniheldur 0,1 prósent HCOOH; leysi B) með því að nota eftirfarandi halla: 0–1 mín, 10 prósent A; 1–8 mín, 10–90 prósent A; 8–9 mín., 90–10 prósent A; 9–11 mín: 10 prósent A. Sýnið var aðskilið á ACQUITY HSS T3 súlunni (1,8 μm, 100 mm × 2,1 mm id). Rennslishraði var 0,3 ml/mín og súluhitastigið var stillt á 35 gráður. Í MS greiningu var neikvæð jónunarhamur notaður, með eftirfarandi fínstilltu breytum: háræðaspenna, 2,5 kV; upplausnarhitastig, 450 gráður. Köfnunarefni var notað sem desolvation og keilugas, með flæðihraða 900 L/klst og 150 L/klst., í sömu röð. Magngreining var þannig framkvæmd með því að nota MRM á umbreytingum m/z 785,29 → 623,26 fyrir echinacoside, m/z 353,06 → 191,07 fyrir klórógensýru (IS), m/z 623,24 → 161,09 fyrir akteósíð. Keiluspennan fyrir echinacoside, IS og acteoside var 100 V, 32 V og 74 V; árekstraorka, 32 V, 14 V og 30 V.

2.5. Rannsókn á stuttum fitusýrum (SCFA).

Sprague-Dawley karlkyns rottur fengu ZT, HM og LM til inntöku í 3 vikur. Ákvörðun á SCFA (ediksýru, própíónsýra, ísósmjörsýra, smjörsýra, ísóvalerínsýra, valerínsýra og hexansýru) með gasskiljun (GC) var gerð eins og áður hefur verið lýst með nokkrum breytingum [14]. Í stuttu máli var 0,5 g saursýni dreift í 2,5 ml af Milli-Q vatni, hringið í hringið í 10 mín., og 7,5 ml 1 prósent HCl/etanól lausn sem innihélt innri staðla (smjörsýra 24,0 ug) /ml og 2- etýlhexansýru 1,32 ug/mL sem innri staðlar) var bætt við. Blöndurnar voru einsleitar í 5 mínútur og skildar í skilvindu við 14,000 snúninga á mínútu í 10 mínútur við 4 gráður. Fimm míkrólítrum af floti var sprautað í skiptan hátt í hlutfallinu 30:1. Burðargasið var N2 (99,999 prósent) við 1 ml/mín. Aukagasið (N2) var 25 ml/mín. Rennsli H2 og lofts var 30 ml/mín og 300 ml/mín., í sömu röð. Saursýnum var safnað á 20. degi þessarar rannsóknar og geymd strax við -80 gráður.

2.6. Söfnun hægða, DNA útdráttur og 16S rRNA gena raðgreining

Um það bil 200 mg af fersku saursýni var safnað í 1,5 ml dauðhreinsað Eppendorf rör frá hverri rottu og geymt við -80 gráður til síðari DNA undirbúnings. DNA var dregið úr hægðum með því að nota QIAamp DNA Stool Mini Kit (QIAGEN). Magn DNA var ákvarðað með NanoDrop litrófsmæli (Thermo Electron Corporation); heilleika og stærð voru athugað með 1,0 prósent agarósa gel rafdrætti. Samkvæmt styrkleikanum var DNA þynnt í 1 ng/μL með dauðhreinsuðu vatni.

16S rRNA var magnað upp með því að nota sérstakan grunn (V4: 515F-806R) með strikamerkinu. Öll PCR viðbrögð voru framkvæmd með Phusion® High Fidelity PCR Master Mix (New England Biolabs). Blandið jafnmiklu rúmmáli af 1× hleðslubuffi (inniheldur SYB grænt) með PCR vörum og gerið rafdrætti á 2 prósent agarósageli til greiningar. Björtu aðalræmurnar á milli 400 og 450 bp voru valdar fyrir frekari tilraunir. PCR vörum var blandað í ESB þéttleikahlutföllum. Síðan var blanda af PCR vörum hreinsuð með Qiagen Gel Extract Kit (Qiagen, Þýskalandi).

Raðunarsöfn voru smíðuð með TruSeq® DNA PCR Free Sample Preparation Kit (Illumina, Bandaríkjunum) í samræmi við tilmæli framleiðandans og vísitölukóðum var bætt við. Gæði safnsins voru metin á Qubit® 2.0 flúormæli (Thermo Scientific) og Agilent Bioanalyzer 2100 kerfinu. Bókasafnið var raðgreint á Illumina HiSeq 2500 vettvang og 250 bp pöruð enda les voru mynduð.

2.7. Lífupplýsingagreining

Strikamerki og grunnur klipping, raðsamsetning og gagnasíun samkvæmt QIIME (V 1.7.0). Röðum með meira en eða jafnt og 97 prósent líkt var úthlutað til sömu OTUs. OTU eru merkt sem SILVA merki. Alfa-fjölbreytileikavísitölurnar sem meta auðlegð örverusamfélagsins í þörmum (ACE og Chao1 mælikvarðar) og fjölbreytileika samfélagsins (Shannon og Simpson mælikvarðar) voru reiknaðar með Qiime (útgáfa 1.9.1). Beta fjölbreytileikagreining var notuð til að kanna burðarvirki örverusamfélaganna með UniFrac fjarlægð. Mismunur meðal allra hópa var prófaður með Tukey prófinu og Wilcox prófinu. Aðalhnitagreiningu (PCoA) var beitt til að útskýra samsetningarmun milli hópanna fjögurra sem notuðu R pakka. Línuleg aðgreiningargreiningaráhrifsstærð (LEfSe) aðferðin er sérstaklega hönnuð fyrir uppgötvun lífmerkja og skýringar á raðgreiningargögnum. Og línuleg aðgreiningargreining (LDA) var notuð til að reikna út áhrifastærð hvers kyns örvera í þörmum og eiginleika sem tengjast hverjum hópi rotta. Fylgnigreiningin var útfærð með því að nota R pakka gcorrplot (útgáfa 1.1.463).

SCFA gögn voru greind með ANOVA SPSS 22.0.

3. Niðurstöður og umræður

3.1. Undirbúningur og efnagreining á cistanche fjölsykrum

Cistanches Herba er notað sem matur og lyf í Kína. Fjölsykrur einangraðar úr henni hafa vakið mikla athygli vegna umtalsverðrar starfsemi. Í þessari rannsókn voru fjórir hlutar cistanche fjölsykranna (ZT, HM, MM og LM) fengnir með aðferð við vatnsútdrátt, útfellingu alkóhóls og ofsíun. Efnasamsetning fjögurra hluta fjölsykrna er sýnd í töflu 1.

Heildarsykurinnihald sýnanna með því að nota staðlaðan glúkósaferil. Niðurstaðan sýndi að afrakstur HM og LM var hærri en MM. Fjölsykrur sýndu fjölbreytta lyfjafræðilega eiginleika, sérstaklega ónæmisvirkni. Rannsóknir hafa sýnt að einsykra innihald og gerð, mólþungi, tegund skiptihóps gegna mikilvægu hlutverki í virkni fjölsykra [15]. Mismunandi hlutar einsykrunnar samsetningar cistanche fjölsykra voru svipaðar og mannósi (Man), galaktúrónsýra (GalUA), glúkósa (Glc), galaktósa (Gal) og arabínósi (Ara) voru helstu einsykrurnar.

Innihaldið var hins vegar ólíkt í hlutunum fjórum. Glúkósi og arabínósi voru aðalefnisþættir ZT og HM, en glúkósa var aðal sykureining LM, auk þess greindist lítið af ramnósi og glúkúrónsýru (GlcUA) í þessum brotum.

Hlutfallslegur mólþungi sýnanna var rannsakaður með hágæða stærð útilokunarskiljun (HPSEC). Samkvæmt stöðluðu ferli dextrana og varðveislutíma í súlunum, sáust helstu hámarksmólþyngd í ZT við 1,68 × 106 Da og 1,70 × 104 Da, í HM voru ákvörðuð vera 1,54 × 106, 2,06 × 105, og 4,81 × 104, í MM og LM voru ákvörðuð að vera 1,09 × 104 og 2,05 × 104, í sömu röð. Uppskera þeirra var skráð í töflu 1 og var uppskeran af MM lág og ekki nóg fyrir dýratilraunina. Fyrri rannsóknir hafa bent til byggingarháðra áhrifa cistanche fjölsykra á fjölbreytta lífvirkni [16]. Enn er þörf á frekari tilraunum, sérstaklega hreinsun, Fifine burðargreiningu ætti að beita fyrir uppbyggingu-virkni rannsóknina

3.2. Rannsókn á lyfjahvörfum

Lyfjahvörf echinacosíðsins voru rannsökuð með ofur-high-performance vökvaskiljun þrífjögurra póla massagreiningu (UPLC og Xevo TQ-S) eftir inntöku echinacosides. Meðal plasmaþéttni-tímasnið echinacosíðs voru sýnd á mynd 1. Samkvæmt lyfja- og tölfræðihugbúnaðinum (DAS, útgáfa 2.0) passa lyfjahvörf echinacosides í einu hólfi líkani og hitt. breytur í ZT, HM og LM hópum voru teknar saman í töflu 2, þar á meðal tíminn til að ná hámarksstyrk (Tmax), hámarksstyrk (Cmax), flatarmáli undir styrkleika-tíma ferlinum (AUC) og meðaldvalartíma (MTR) ). Lyfjahvarfarannsókn sýndi að meðal Cmax fyrir echinacoside í ZT, HM og LM hópum reyndist vera 646,4 ng/ml, 732,0 ng/ml og 898,4 ng/ml sem voru 1,6, 1,8 og 2,2 sinnum samanborið við samanburðarhópinn (406,8 ng/ml), í sömu röð. Með formeðferð með fjölsykrum jókst AUC(0-24 klst) echinacosides um 6,6 prósent, 36,7 prósent og 63,6 prósent í ZT, HM og LM hópum, samanborið við samanburðarhópinn, sem sannaði að fjölsykrurnar sýndu. virkni þess að stuðla að frásogi lítillar sameindar. Þessar niðurstöður voru nokkuð svipaðar því að kítólýkrurnar bættu aðgengi fenýletanóíð glýkósíða í Fructus Forsythia þykkni [17] og fjölsykrurnar af Polygonum multiflorum bættu líflyfjafræðilega eiginleika 2, 3, 5, 4'-tetrahýdroxý-stilbens. O- -D-glúkósíð í venjulegum Sprague-Dawley rottum [18]. Örverur í þörmum innihalda margs konar lyfjaumbrotstengda ensím og verkunarháttur örveruformanna lyfjahvörf og lyfhrif eru enn óþekkt [19]. Fjölsykrur geta nært örveru í þörmum með því að auka ónæmiskerfið, taka upp næringarefni og draga úr vexti sýkla [20,21]. Þrátt fyrir að fræðirit hafi greint frá því að cistanche fjölsykrur gætu aukið umbrotsefni echinacosides (eins og acteoside) in vitro, fundum við ekki að fjölsykrurnar sem eru til hafa gagnast við að echinacoside breytist í acteoside in vivo [10,11].

3.3. Innihald SCFAs í saur rottum

Gerjaðar fjölsykrur í örverum í þörmum, sem framleiða ýmsar lífvirkar fjölliður og umbrotsefni, svo sem SCFAs [3]. Sem aðalumbrotsefni fjölsykra voru SCFAs greind í hægðum. Greint hefur verið frá því að SCFA, þar á meðal ediksýra, própíónsýra og bútýrat, hafi jákvæð áhrif á umbrot glúkósa, kólesteróls og lípíða. Asetat er aðal SCFA í ristli og er mikilvægt hvarfefni fyrir nýmyndun kólesteróls, própíónat er hvarfefni fyrir glúkógenmyndun í lifur og bútýrat er ákjósanlegur orkuhvarfefni ristilfrumna og hefur bólgueyðandi áhrif í þörmum [22,23].

Niðurstöður okkar sýndu að asetat var aðal SCFA sem myndast í hægðum fyrir alla hópa, þar á eftir bútýrat og própíónat, en styrkur valerats og greinóttra SCFAs (ísósmjörsýru og ísóvalerínsýru) var lægri. Sýnt hefur verið fram á að asetatið eykur ensímvirkni í lifrarvef, sem leiðir til betri blóðsykursstjórnunar [24]. Á 20 degi (mynd 2) hafði LM hópurinn marktækt hærra asetatmagn (pb 0,05), hlutfall própíónats hafði tilhneigingu til að minnka og hlutfall bútýrats hafði tilhneigingu til að aukast þó breytingin var óveruleg í saur miðað við samanburðarhópinn.

Hins vegar var HM hópurinn með marktækt lægra hlutfall af bútýrati en samanburðarhópurinn (pb 0.05). Innihald heildar SCFA milli LM og HM var gagnstæð þróun miðað við samanburðarhópinn og aðeins LM hópurinn hafði marktækan mun.

Margir þættir hafa áhrif á magn SCFAs í hægðum, þar á meðal samsetning og magn örveru í þörmum, uppspretta fæðu og tíma sem það tekur fæð að fara í gegnum meltingarveginn [22]. Uppsafnaðar rannsóknir sýna að uppbygging fjölsykrna, þar á meðal samsetning einsykrurleifa, fjölliðunarstig, bæði getur haft áhrif á gerjunareiginleika og framleiðslu SCFAs [25]. Af niðurstöðum okkar getum við ályktað að cistanche fjölsykrur stýra framleiðslu SCFAs og fjölsykrur með mismunandi uppbyggingu hafa mismunandi áhrif.

3.4. Cistanche fjölsykrur ollu kjarnabreytingum á samsetningu og fjölbreytileika örveru í þörmum

Bakteríusamsetning saursýnanna (n=4) var skoðuð með Illumina raðgreiningartækni með mikilli afköstum. Safnið var raðgreint á Illumina HiSeq2500 vettvang og 250 bp pöruð enda les voru framleidd. Þau voru unnin til flokkunarfræðilegrar auðkenningar og fjölbreytileikagreiningar. Sjaldgæf breytingaferlar (mynd 3a) sýndu að fyrir hvert sýni jafnaðist tegundaauðgi baktería eftir því sem sýnatökudýpt jókst, sem gefur til kynna að raðgreiningarátakið hafi verið nægjanlegt og að heildarfjölbreytileiki sýnisins hafi náðst. Shannon ferillinn (mynd 3b) sýndi að einstökum bakteríutegundum fjölgaði eftir því sem greindum röðum fjölgaði. Mettun Shannon-ferilanna þýðir að raðgreiningargögnin dugðu til að ná yfir allar bakteríutegundirnar.

Alfa fjölbreytileikagreining er notuð til að mæla fjölbreytileikann innan úrtaks. Chao1, ACE, Shannon og Simpson fjölbreytileikavísitölur voru reiknaðar út með Tukey prófi til að lýsa alfa fjölbreytileikanum. Fjölbreytileikagreiningin sem byggð var á ACE og Chao 1 vísitölum leiddi í ljós samfélagslegan auð í örveru í þörmum á OTU stigi. ACE og Chao 1 vísitölur voru marktækt lægri í saursýnum LM hópsins samanborið við samanburðarhópinn (pb 0.05) (mynd 4a, b), sem gefur til kynna að tegundaauðgi örveru í þörmum hafi minnkað. með LM fóðrun. Fjölbreytileikagreiningin sem byggð var á Shannon og Simpson vísitölum leiddi í ljós fjölbreytileika samfélagsins í örveru í þörmum. Engin augljós breyting var á Shannon og Simpson fjölbreytileikastuðulum þegar þeir voru meðhöndlaðir með cistanche fjölsykrum samanborið við samanburðarhópinn.

Cistanche fjölsykrur ollu miklum breytingum á taxa. Þar að auki, í fjórum hópum voru N98 prósent OTUs tengd phyla Bacteroidetes, Firmicutes og Proteobacteria. Algengasta flokkurinn var Bacteroidetes sem lagði til 55.09 prósent , 57.89 prósent , 52.72 prósent og 69. {{20}}4 prósent af saurörveru í stjórn, ZT, HM og LM hópar í sömu röð, þar á eftir Firmicutes, sem leggja fram 41,39 prósent, 38.03 prósent, 42,15 prósent og 28,15 prósent í sömu röð (mynd 5a, b). Í samanburði við viðmiðunarhópinn var sýnt fram á að ZT hópurinn hefði veik áhrif á hlutfallslega gnægð helstu þyrna, að því undanskildu að lítið magn Actinobacteria var marktækt aukið (MetaStat, pb 0,05). Í HM hópnum jókst Proteobacteria marktækt (pb 0,01). Þetta gaf til kynna að HM Cistanche fjölsykra gæti stuðlað að auðgun Proteobacteria til að hafa áhrif á umbrot efna í rottum. Í LM hópnum jókst magn Bacteroidetes, en helstu þátttakendur þeirra voru Prevotellaceae og Prevotellaceae_UCG-001 marktækt (pb 0,05) og magn Firmicutes, þar á meðal Peptococcaceae, minnkaði verulega (1p marktækt) . Meðlimum Prevotella og Bacteroides var áður lýst sem trefjum niðurbrotsefni [26], sem framleiða efnaskiptaafurðir eins og súksínat og asetat [27]. Slíkar niðurstöður staðfestu fyrri rannsóknir sem sýndu að sumar Prevotella spp. geta brotið niður flóknar plöntufjölsykrur. Fyrri skýrslur sýndu einnig að tvær ríkjandi bakteríuskiptingar, aukið hlutfall phyla Firmicutes/Bacteroidetes, tengist offitu [28]. Minni gnægð þess fyrrnefnda og meiri gnægð hins síðarnefnda í LM hópnum benti til þess að LM gæti hjálpað til við að losa sig við kíló.

Af 72 fjölskyldum sem greindust voru taxa top10 einangruð og greind (mynd 5c, d). Lachnospiraceae og Ruminococcaceae eru tvær af algengustu fjölskyldunum sem finnast í þarma umhverfi spendýra og hafa verið tengdar viðhaldi þarmaheilbrigðis [29]. Í þessari rannsókn, fjölskyldur Bacteroidales_S24-7_hópur (39,11 ± 6,04 prósent, 36,88 ± 4,44 prósent, 28,37 ± 4,01 prósent, 35,81 ± 7,91 prósent), Prevotellaceae (± 0,5 64 prósent, 0,5 64 prósent, ± 1,5 prósent prósent, 19,65 ± 8,97 prósent, 21,05 ± 8,39 prósent), Lachnospiraceae (18,21 ± 5,20 prósent, 15,09 ± 3,29 prósent, 12,13 ± 7,14 prósent, 13,12 ± 6,82 prósent) og Ruminococaceae (9,64 ± 0,88 prósent, 10,44 ± 2,45 prósent, 11.2777777777 ± 4,70 prósent, 8,19 ± 1,72 prósent) voru allsráðandi í hverjum hópi. Tilkynnt hefur verið um S24-7 fjölskyldu sem innihélt gnægð af kolvetnisbrotandi ensímum [30]. Prevotellaceae sýndu hækkun og Lachnospiraceae sýndu minnkandi tilhneigingu í fjölsykrum hópnum samanborið við samanburðarhópinn [31]. Gert var ráð fyrir að engin samsvarandi cistanche fjölsykrur væru virk ensím í Bacteroidales_S24-7_hópnum og Lachnospiraceae eða kolvetnabindandi einingar baktería við fjölsykrur. Greint hefur verið frá Prevotella ættkvíslum í tengslum við fjölsykru nýtingarstað og kolvetnavirk ensím [32]. Til þess að finna tengsl baktería og SCFAs var Spearman fylgnigreining beitt. Sumar ættkvíslir eins og Bacteroides, Prevotella og Lactobacillus í örveru í þörmum gegna mikilvægu hlutverki við vatnsrof fjölsykra í SCFAs [33]. Niðurstöður okkar sýndu einnig að Bacteroidaceae höfðu jákvæða fylgni og ráðandi örverur framleiddu meira bútýrat [34], á meðan Prevotellaceae höfðu jákvæða fylgni og ráðandi örverur mynduðu meira asetat. Lactobacillaceae og Ruminococcaceae ríkjandi örverur framleiddu meira própíónat (mynd 6).

Beta fjölbreytileikagreining var notuð til að kanna byggingarbreytingar á örveru í þörmum yfir sýnin með UniFrac fjarlægðarmælingum. Mismunur á Unifrac fjarlægðum var greindur með Tukey og Wilcox prófinu (mynd 7). Með því að nota uniFrac óvigtaða greiningu komumst við að því að LM fæða mýs hópa í burtu frá öðrum hópum. Augljóst klasamynstur var greint fyrir viðmiðunarhópa, ZT, HM og LM hópa.

Gnægð þessara örvera var stillt á mismunandi hátt með fjölsykrumeðferðum. Til að bera kennsl á tiltekna bakteríuflokka í hverjum hópi var samsetning örveru úr viðmiðunar-, ZT-, HM- og LM hópunum borin saman með LEfSe-aðferðinni (linear discriminant analysis effect size). Línuleg mismununargreining (LDA) er notuð til að reikna út áhrifastærð hvers eiginleika sem er mjög ríkur. LDA stigaþröskuldur er hærri en 4 voru á listanum, sem gefur til kynna hærri hlutfallslega samfélagsgnægð í samsvarandi hópi en í öðrum hópum. Með þessari aðferð komumst við að því að 19 OTUs voru marktækt mismunandi í öllum hópum, nefnilega 6 OTUs í samanburðarhópnum voru hærri, aðeins 1 OTU í ZT hópnum var hærri, 10 OTUs í HM hópnum voru hærri og 2 OTUS í LM hópnum voru hærri en aðrir hópar (mynd 8). Magn g_Prevotellaceae_ UCG_001 í LM jókst verulega (8,47 ± 1,9 prósent í LM, 0.40 ± {{21 }}.09 prósent í eftirlitshópnum, pb 0.01). Niðurstaðan var í samræmi við skýrsluna um að Porphyra haitanensis og Ulva prolifera fjölsykrur gætu augljóslega stuðlað að fjölgun Prevotellaceae UGC-001 (pb 0,05) og Rikenellaceae RC9 (pb 0,01) [35].

4. Niðurstöður

Það er ljóst að það er tengsl á milli TCM efnaþátta, örveru í þörmum og ákveðinna umbrotsefna sem myndast af örverum í þörmum. Núverandi niðurstöður okkar veittu aðferð til að rannsaka samvirkni echinacoside efnaskipta með mismunandi tegundum fjölsykrna byggðar á örveru í þörmum. Örverur í þörmum geta umbrotið TCM og TCM getur haft áhrif á vöxt örveru í þörmum. Annars vegar, eftir inntöku fjölsykrna í þörmum, kóða margs konar örverur í þörmum efnaskiptaensím, sem gegna mikilvægu hlutverki í niðurbroti fjölsykrna og til að framleiða lífvirk umbrotsefni. Á hinn bóginn hefur framlag fjölsykra nokkur áhrif á jafnvægi í örumhverfi þarma í ferlinu. Með því að bera saman með eða án fjölsykrna komumst við að því að fjölsykrur, þó að hýsilinn hafi ekki melt þær beint, virkuðu hugsanlega sem prebiotics, sem leiddi til hagstæðra breytinga á örveru í þörmum með því að stuðla að vexti probiotics. Cistanche fjölsykrur stýrðu fjölbreytileika örvera í þörmum, auka gagnlegar bakteríur og sérstaklega lágsameindafjölsykrur efldu vöxt Prevotella spp. Ennfremur jók bætt örvera í þörmum síðan frásog echinacosides í Cistanche deserticola. En ástæðan er ekki alveg ljós, gæti verið afleiðing af samsettum göllum í þörmum örveru, SCFAs og ónæmi, og frekari rannsóknir eru nauðsynlegar fyrir sjúkdómslíkan. Það er erfitt að sanna áhrif prebiotics í heilbrigðum dýralíkönum þar sem örverusamfélagið er stöðugt og seigur. Cistanche deserticola fjölsykrur gætu verið þróaðar sem probiotic vörur til að stjórna örveru í þörmum og hægt er að beita þeim á samverkandi umbrot lítilla sameinda í framtíðinni. Þessi gögn munu hjálpa okkur að hanna inngrip til að koma í veg fyrir að viðkvæmir hópar fólks geti bætt heilsu sína.

Yfirlýsing um hagsmuni í samkeppni

Höfundar lýsa því yfir að ekki sé um hagsmunaárekstra að ræða varðandi útgáfu þessa blaðs.

Viðurkenningar

Höfundar eru þakklátir fyrir National Natural Science Foundation of China (styrk nr. 81830112 og 81904058)

Heimildir
[1] I. Khangwal, P. Shukla, Potential prebiotics and their transmission mechanisms: nýlegar aðferðir, J. Food Drug Anal. 27 (3) (2019) 649–656.
[2] XF Xu, PP Xu, CW Ma, J. Tang, XW Zhang, þarma örvera, hýsilheilsa og fjölsykrur, líftækni. Adv. 31 (2) (2013) 318–337.
[3] NT Porter, EC Martens, mikilvægu hlutverki fjölsykra í örveruvistfræði og lífeðlisfræði þarma, Annu. Séra Microbiol. 71 (2017) 349–369.
[4] QW Guo, QQ Ma, ZH Xue, XD Gao, HX Chen, Rannsóknir á bindingareiginleikum þriggja fjölsykra með mismunandi mólþunga og flavonoids úr maíssilki (Maydis stigma), Carbohyd. Polym. 198 (2018) 581–588.
[5] SS Zhou, J. Xu, H. Zhu, J. Wu, JD Xu, R. Yan, XY Li, HH Liu, SM Duan, Z. Wang, HB Chen, H. Shen, SL Li, örverur í þörmum -tekur þátt í að efla altæka útsetningu fyrir ginsenósíðum með samvistum fjölsykrum í ginseng decoction, Sci. Rep. 6 (2016), 22474.
[6] YP Jing, AP Li, ZR Liu, PR Yang, JS Wei, XJ Chen, T. Zhao, YR Bai, LJ Zha, CJ Zhang, Frásog Codonopsis pilosula saponins með samvistum fjölsykrum dregur úr örverusjúkdómi í þörmum með natríumsúlfati -framkallað ristilbólga í módelmúsum, Biomed. Res. Alþj. 2018 (2018), 1781036 (18 síður).
[7] CJ Chang, CS Lin, CC Lu, J. Martel, YF Ko, DM Ojcius, SF Tseng, TR Wu, YYM
Chen, JD Young, HC Lai, Ganoderma Lucidum dregur úr offitu í músum með því að breyta samsetningu örveru í þörmum, Nat. Commun. 6 (2015) 7489.
[8] JC Zhang, GM Yang, YZ Wen, SX Liu, CF Li, RL Yang, W. Li, Þarma örverur taka þátt í ónæmisbælandi starfsemi longan fjölsykru, Mol. Nutr. Food Res. 61 (11) (2017), 1700466.
[9] T. Wang, XY Zhang, WY Xie, Cistanche deserticola YC Ma, "Desert Ginseng": umsögn, Am. J. Chin. Med. 40 (6) (2012) 1123–1141.
[10] Y. Li, GS Zhou, SH Xing, PF Tu, XB Li, Auðkenning echinacoside umbrotsefna sem framleidd eru af þarmabakteríum manna með því að nota ultraperformance vökva
chromatography–quadrupole time-of-flight massagreiningu, J. Agr. Food Chem. 63 (30) (2015) 6764–6771.
[11] Y. Li, Y. Peng, MY Wang, PF Tu, XB Li, Umbrot í meltingarvegi manna af Cistanches Herba vatnsþykkni in vitro: skýring á efnaskiptasniði byggt á alhliða auðkenningu umbrotsefna í magasafa, þarmasafa, þarma manna bakteríur, og þörmum, J. Agric. Food Chem. 65 (34)
(2017) 7447–7456.
[12] M. Dubois, K. Gilles, JK Hamilton, PA Rebers, F. Smith, Colorimetric method for determination of sugars and related materials, Anal. Chem. 168 (4265) (1956) 167.
[13] NH Cho, SY Seong, KH Chun, YH Kim, IC Kwon, BY Ahn, SY Jeong, Ný slímhúð ónæmisaðgerð með fjölsykru-prótein samtengdum algínat örkúlum, J. Control. Útgáfa 53 (1–3) (1998) 215–224.
[14] XY Zhao, ZZ Jiang, F. Yang, Y. Wang, XM Gao, YF Wang, X. Chai, GX Pan, Y. Zhu, Næm og einfölduð uppgötvun sýklalyfjaáhrifa á kraftmikil og fjölhæfar breytingar á hægðum. -keðju fitusýrur, PLoS One 11 (12) (2016), e167032.
[15] SJ Li, QP Xiong, XP Lai, X. Li, MJ Wan, JN Zhang, YJ Yan, M. Cao, L. Lu, JM Guan, DY Zhang, Y. Lin, sameindabreyting á fjölsykrum og lífvirkni sem af því leiðir , Samgr. Séra Matur. Sci. F. 15 (2) (2016) 237–250.
[16] ZF Fu, X. Fan, XY Wang, XM Gao, Cistanches Herba: yfirlit yfir efnafræði, lyfjafræði og lyfjahvarfaeiginleika þess, J. Ethnopharmacol. 219 (2018) 233–247.
[17] W. Zhou, XB Tan, JJ Shan, T. Liu, BC Cai, LQ Di, Áhrif chitooligosaccharides á
frásog fenýletanóíð glýkósíða í þörmum í Fructus Forsythia þykkni, Phytomedicine 21 (12) (2014) 1549–1558.
[18] LL Sun, M. Wang, HJ Zhang, GJ You, YN Liu, XL Ren, YR Deng, Áhrif fjölsykra frá Ophiopogon japonicus á 2,3,5,4′-tetrahýdroxý -stilben-2- Z. Fu o.fl. / International Journal of Biological Macromolecules 149 (2020) 732–740 739 O- -d-glúkósíð um líflyfjafræðilega eiginleika in vitro og lyfjahvörf in vivo, Int. J. Biol. Makrómol. 119 (2018) 677–682.
[19] KN Lam, M. Alexander, PJ Turnbaugh, Precision medicine goes microscopic: engineering the microbiome to improve drug outcomes, Cell Host Microbe 26 (1) (2019) 22–34.
[20] I. Khangwal, P. Shukla, Prospecting prebiotics, innovative evaluation methods, and their health applications: a review, 3 Biotech. 9 (5) (2019) 187.
[21] GR Gibson, R. Hutkins, ME Sanders, SL Prescott, RA Reimer, SJ Salminen, K. Scott, C. Stanton, KS Swanson, PD Cani, K. Verbeke, G. Reid, The international scientific association for probiotics og prebiotics (ISAPP) samstöðuyfirlýsing um skilgreiningu og umfang prebiotics, Nat. Séra Gastro. Lifur. 14 (8) (2017) 491–502.
[22] JMW Wong, R. de Souza, CWC Kendall, A. Emam, DJA Jenkins, Ristilheilsa: gerjun og stuttar fitusýrur, J. Clin. Gastroenterol. 40 (3) (2006) 235–243.
[23] SI Cook, JH Sellin, Yfirlitsgrein: stuttar fitusýrur í heilsu og sjúkdómum, Aliment. Pharm. Þr. 12 (6) (1998) 499–507.
[24] H. Yamashita, K. Fujisawa, E. Ito, S. Idei, N. Kawaguchi, M. Kimoto, M. Hinamori, H. Tsuji, Umbætur á offitu og glúkósaþoli með asetati hjá sykursýki af tegund 2 Otsuka Long- Evans Tokushima Fatty (OLETF) rottur, Biosci. Líftækni. Biochem. 71 (5) (2007) 1236–1243.
[25] AL Ho, O. Kosik, A. Lovegrove, D. Charalampopoulos, RA Rastall, In vitro gerjun xylooligosaccharides og Xylo-polysaccharide brots með mismunandi mólmassa af saurbakteríum manna, Carbohyd. Polym. 179 (2018) 50–58.
[26] TT Chen, WM Long, CH Zhang, S. Liu, LP Zhao, BR Hamaker, Trefjanýtingargeta er mismunandi í Prevotella- á móti Bacteroides-ráðandi þarmaörveru, Sci. 7 (1) (2017) 2594.
[27] M. Sakamoto, M. Ohkuma, Bacteroides sartorii er eldra heterotypic samheiti Bacteroides chinchilla og hafa forgang, Int. J. Syst. Evol. Míkr. 62 (6) (2012) 1241–1244.
[28] PJ Turnbaugh, RE Ley, MA Mahowald, V. Magrini, ER Mardis, JI Gordon, offitutengd þörmum örveru með aukinni getu til orkuuppskeru, Nature 444 (7122) (2006) 1027-1131.
[29] LF Gomez-Arango, HL Barrett, HD McIntyre, LK Callaway, M. Morrison, NM Dekker, Tengsl milli örveru í þörmum og efnaskiptahormónum snemma á meðgöngu hjá of þungum og offitu konum, Sykursýki 65 (8) (2016) 2214 –2223.
[30] KL Ormerod, DL Wood, N. Lachner, SL Gellatly, JN Daly, JD Parsons, CG Dal Molin, RW Palfreyman, LK Nielsen, MA Cooper, M. Morrison, PM Hansbro, P. Hugenholtz, Genomic characterization of the óræktuð Bacteroidales fjölskylda S24-7 sem býr í þörmum heimahitadýra, Microbiome. 4 (1) (2016) 36.
[31] JD Zhang, LJ Song, YJ Wang, C. Liu, L. Zhang, SW Zhu, SJ Liu, LP Duan, Gagnleg áhrif bútýrats-framleiðandi Lachnospiraceae á streitu-völdum innyflum í rottum, J. Gastro. Lifur. 34 (8) (2019) 1368–1376.
[32] T. Accetto, G. Avguštin, Fjölbreytileg og umfangsmikil niðurbrotstæki plantna fjölsykru af vömb og hindgirni Prevotella tegundum: þáttur í alls staðar nálægð þeirra? Syst. Appl. Örverur. 42 (2) (2019) 107–116.
[33] KE Bach Knudsen, MS Hedemann, HN Lærke, Hlutverk kolvetna í þarmaheilbrigði svína, Anim. Fæða. Sci. Tækni. 173 (1–2) (2012) 41–53.
[34] SA Parker, A. Geirnaert, L. Berchtold, A. Greppi, L. Krych, RE Steinert, T. de Wouters, C. Lacroix, Skilningur á prebiotic möguleika mismunandi matartrefja með því að nota in vitro samfellt gerjunarlíkan fyrir fullorðna (PolyFermS), Sci. 8 (1) (2018) 4318.
[35] ZS Zhang, XM Wang, SW Han, CD Liu, F. Liu, Áhrif tveggja þangfjölsykra á örveru í þörmum í músum metin með Illumina PE250 raðgreiningu, Int. J. Biol. Makrómol. 112 (2018) 796–802.