Tegundarauðkenning og efnasamsetning greining á villtum Cistanche plöntum frá Kenýa

Ágrip:Þessi rannsókn beitti plöntuformgerð, vefjafræði og DNA strikamerkisaðferðum til að bera kennsl á villtu Cistanche tegundirnar í Kenýa. Innihald helstu virku innihaldsefnanna, þar á meðal fenýletanóíð glýkósíða, sykuralkóhóla og betaíns, í villtum Cistanche frá Kenýa var ákvarðað með HPLC aðferð. Á meðan fór fingrafaragreiningin fram. Niðurstöðurnar sýndu að villta Cistanche plantan sem safnað var frá Kenýa var auðkennd sem Cistanche senegalensis (Reut.) Beck. Innihald virkra efna eins ogechinacoside,cistanoside A, akteósíð, ísóakteósíð, og 2′-asetýlakteósíð í C. senegalensis frá Kenýa voru lægri en í innlendum C. tubulosa, en hærri en í innlendum C. deserticola. Innihald betaíns var svipað og í innlendum C. deserticola, en það inniheldur ekki glúkósa. Eiginleikar fingrafarsins eru líkari einkennum innlendra C. tubulosa. Þessi rannsókn gefur grundvöll fyrir auðlindavernd, ítarlegar rannsóknir og þróun Cistanche auðlindarinnar í Kenýa.

Lykilorð: Cistanches Herba; Cistanche senegalensis (Reut.) Beck; Kenýa; tegundagreining; DNA strikamerki; efnisákvörðun

 

 

 

Cistanche deserticolaYC Ma

 

Cistanche, verðlaunuð jurt í hefðbundinni kínverskri læknisfræði, vísar til þurrkaða, hreistraða, safaríka stilka eyðimerkurplantna eins ogCistanche deserticolaYC MaogCistanche tubulosa(Schenk) Wight, báðir meðlimir Orobanchaceae fjölskyldunnar. Cistanche er þekkt fyrir hæfileika sína til að styrkja nýrna-yang, næra kjarna og blóð og væta þörmum til að létta hægðatregðu, og hefur Cistanche verið fagnað í kínverskum jurtatextum um aldir. Elstu lyfjaskrá þess birtist í fornu klassíkinniShennong's Classic of Materia Medica, þar sem Cistanche er flokkuð sem "yfirstig" jurt. Í gegnum tíðina hafa fjölmargir hefðbundnir læknisfræðilegir textar skjalfest kraftmikla kosti Cistanche, sem hefur hlotið hið virta gælunafn "Ginseng eyðimerkurinnar."

Fjölbreytileg lyfjafræðileg áhrif Cistanche eru rakin til fjölda lífvirkra efnasambanda. Meðal þeirra eru fenýletanóíð glýkósíð aðal virku innihaldsefnin sem bera ábyrgð á nýrna- og merg-nærandi áhrifum Cistanche. Þessi efnasambönd - eins og echinacoside og acteoside - sýna taugavernd, gegn vitglöpum, öldrun og lifrarverndandi virkni. Sérstaklega eru echinacoside og acteoside tvö viðmiðunarefnasamböndin sem notuð eru til gæðaeftirlits á Cistanche eins og tilgreint er í 2020 útgáfu kínversku lyfjaskrárinnar. Að auki eru hægðalosandi áhrif Cistanche aðallega vegna fásykrunnar alkóhólþátta þess, þar á meðal betaín, mannitól, frúktósa, glúkósa og súkrósa. Þessir fimm þættir eru almennt viðurkenndir sem vísbendingar um getu Cistanche til að væta þörmum og stuðla að hægðum.

Cistanche tubulosa(Schenk) Wight

Í Kína eru helstu tegundir Cistanche maCistanche deserticolaYC Ma,Cistanche tubulosa(Schenk) R. Wight,Cistanche salsa(CA Mey.) G., ogCistanche sinensisG. Beck. Þessar tegundir eiga heima á svæðum eins og Innri Mongólíu, Ningxia, Gansu og Xinjiang. Handan norðvesturhluta Kína eru Cistanche tegundir einnig dreift um þurr og eyðimörk í Evrasíu og norður og austur Afríku, þar á meðal lönd eins og Íran, Afganistan, Kenýa, Pakistan og Mongólíu.

Kenýa, sem er staðsett í Austur-Afríku og þvert á miðbaug, er að mestu leyti samsett af hálendi í 1.500 metra meðalhæð, en norðursvæði þess eru eyðimörk eða hálfeyðimörk. Frumbyggjar Kenýa hafa langa sögu um að nota lækningajurtir til lækninga. Svæðið státar af mikilli lækningaflóru, til dæmis útdrætti úr berki og rótum tannburstatrésins (Salvadora persicaL.) eru þekktir fyrir bólgueyðandi og bakteríudrepandi eiginleika og eru oft notaðir til að meðhöndla tannpínu og sýkingar. gelta sandelviðartrésins (Osyris lanceolataHochst. & Steud.) er notað til að meðhöndla niðurgang, en decoctions af Maasai netlu (Urtica massaicaMildbr.) blöð eru notuð við magaverkjum. Þessi ríka hefð hefur ýtt undir lifandi lækningajurtamenningu, en samt sem áður vegna efnahagslegrar þróunaráskorana hefur notkun þessara lækningajurta ekki verið að fullu skjalfest eða kerfisbundið rannsökuð.

Athyglisvert er að Cistanche tegundir eru oft álitnar illgresi í Afríku og hafa ekki fengið mikla athygli eða rannsóknir. Reyndar eru nánast engar birtar rannsóknir á African Cistanche. Til að bregðast við boði frá svæðisþróunardeild fyrir þurra og hálfþurrða lönd Austur-Afríkusamfélagsins, framkvæmdi rannsóknarteymi okkar vettvangsrannsókn í Kenýa til að kanna staðbundnar Cistanche auðlindir. Við söfnuðum villtum Cistanche sýnum, gerðum grasafræðilega auðkenningu og greindum helstu lífvirku efnasamböndin þeirra. Markmiðið var að skilja tegundafjölbreytileika og þróunarmöguleika Cistanche í Kenýa, og leggja vísindalegan grunn fyrir frekari rannsóknir og nýtingu þessara dýrmætu eyðimerkurplantna.

Cistanche tubulosa þurrkuð heilrót Sala í Kína

Whatsapp okkur fyrir frekari upplýsingar

 

 

Efni og aðferðir

Plöntuefni

Villtum Cistanche sýnum frá Kenýa var safnað í ágúst 2023 af prófessorunum Pengfei Tu og Yong Jiang frá lyfjafræðideild Peking háskóla í Kajiado, Kenýa (01 gráða 50'01"S; 36 gráða 47'00"E). Tveimur villtum Cistanche plöntum var safnað og merkt K1 og K2 ásamt rótum hýsilplöntunnar þeirra (sjá mynd 1). Hýsilverksmiðjan var auðkennd af Kennedy Matheka, rannsóknaraðstoðarmanni við Austur-Afríku grasagarðinn, Þjóðminjasafn Kenýa, semSericocomopsis hildebrandtiiSchinz, sem tilheyrir Amaranthaceae fjölskyldunni. Sýnishorn afCistanche deserticolaogCistanche tubulosavar safnað frá Turpan City og Yutian sýslu í Xinjiang Uygur sjálfstjórnarsvæðinu, í sömu röð, og voru staðfest af prófessor Pengfei Tu sem ferskir safaríkar stilkar afCistanche deserticolaYC Ma ogCistanche tubulosa(Schrenk) Wight. Öll skírteinissýni eru varðveitt á rannsóknarstofu okkar.

Hljóðfæri

Waters Arc HPLC kerfi

Quintix125D-1CN rafeindavog (Sartorius, Peking)

Olympus BX-50 ljóssmásjá (Olympus, Japan)

NanoZoomer-SQ panorama skyggnuskanni (Hamamatsu Photonics, Japan)

KQ500DE stafræn úthljóðshreinsiefni (Kunshan Ultrasonic Instruments, Kína)

MM400 DNA útdráttar kvörn (Retsch, Þýskalandi)

PCR varma hringrás (Analytik Jena, Þýskalandi)

DYY-8C rafskautstæki og tankur (Liuyi hljóðfæraverksmiðja, Peking)

MINI Space 1000 hlaupmyndakerfi (Tanon, Shanghai)

Útungunarvél fyrir stöðugt hitastig (Yiheng, Shanghai)

Hvarfefni

Echinacoside (hluti: DST191008-038), acteoside (DSTDL006101), ísóacteoside (DST210601-060), D-mannitol (DSTDG006201) voru keypt frá Chengdu Desite Biotechnology Co., Ltd.; túbúlósíð A (MUST-15040115), 2'-asetýlakteósíð (MUST-15071504), betaín (MUST-23082505), vatnsfrí D-glúkósi (MUST-23030214), frúktósi (MUST-23031403) og súkrósi (MUST-23082505) voru fengin frá Chengdu Mansite Biotechnology Co., Ltd. OCEANPAK), maurasýru (HPLC einkunn, VOKA hvarfefni) voru öll af litskiljunarhreinleika. Erfðafræðilegt DNA útdráttarsett fyrir plöntur (DP305, Tiangen Biotech, Kína) og ofurhreint vatn var notað til sameindagreiningar.

Undirbúningur, litun og athugun á safaríkum stöngulhlutum

Með því að fylgja aðferðinni í tilvísun [10] voru ferskir Cistanche safaríkar stilkar skornir í viðeigandi stærðir og varðveittar í FAA festiefni (70% etanól: ísediksýra: formaldehýð=90:5:5). Eftir þvott með rennandi vatni til að fjarlægja leifar af festiefni, voru vefir mýktir með flúorsýru, litaðir með safraníni, þurrkaðir, settir inn í paraffín og sneiddir. Eftir uppsetningu voru glærurnar bakaðar, paraffín brætt og hlutar litaðir með 95% etanóli Fast Green lausn, síðan lokað með hlutlausu plastefni. Formgerð vefja var skoðuð í smásjá og vel mótaðir hlutar voru skannaðir með víðmyndaskanni til að fá myndir í hárri upplausn.

DNA útdráttur, PCR mögnun og raðgreining

Heildar DNA úr Cistanche sýnum og hýsilplönturótum var dregið út með því að nota erfðafræðilegt DNA útdráttarsett fyrir plöntur (Tiangen), samkvæmt samskiptareglum framleiðanda. DNA styrkur og OD260/OD280 hlutföll voru mæld með UV litrófsmæli til að meta gæði áður en haldið var áfram.

PCR mögnun miðar að innra umritaða spacer 2 (ITS2) svæði ríbósóma DNA og blaðgrænuplasti psbA-trnH gensins til sameinda auðkenningar [11]. Grunnraðir voru sem hér segir:

ITS2 fram: 5'-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3'

ITS2 bakhlið: 5'-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3'

psbA-trnH framherji: 5'-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3'

psbA-trnH bakhlið: 5'-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3'

PCR viðbrögð (25 μL) innihéldu 12,5 μL 2× Taq Master Mix, 1 μL hvor af fram- og afturvirkum grunni (2,5 μmól·L⁻¹), 2 μL DNA-sniðmát og 8,5 μL ddH₂O. ITS2 mögnun: 94 gráður 5 mín; síðan 35–40 lotur af 94 gráður 30 s, 56 gráður 30 s, 72 gráður 45 s; endanleg framlenging við 72 gráður 10 mín. psbA-trnH mögnun: 95 gráður 4 mín; 35 lotur af 94 gráður 30 s, 55 gráður 1 mín, 72 gráður 1 mín; endanleg framlenging við 72 gráður 10 mín. PCR afurðir voru greindar með hlaup rafdrætti og markbönd voru sett í Sanger tvíátta raðgreiningu. Raðskiljun voru greind með því að nota CodonCode Aligner (v3.7.1, CodonCode Co., USA) til að fá mark-DNA raðir, sem voru auðkenndar með kínverska Materia Medica DNA strikamerkjakerfinu og BLAST greiningu í GenBank gagnagrunninum. Sýkingartré voru smíðuð með MEGA X hugbúnaði til tegundagreiningar.

Magnbundin ákvörðun fimm fenýletanóíð glýkósíða

Innihald fimm fenýletanóíð glýkósíða var ákvarðað samkvæmt áður þekktum aðferðum [13]. Tilreiðsla viðmiðunarlausna: vigtið nákvæmlega echinacoside, tubuloside A, acteoside, isoacteoside og 2'-acetylacteoside og leyst upp í 50% metanóli til að búa til blandaða staðallausn með fyrirfram ákveðnum styrk. Litskiljunarskilyrði: Phenomenex Luna C18 súla (250 mm × 4,6 mm, 5 μm); hreyfanlegur fasi A: asetónítríl-metanól (6:1, v:v); hreyfanlegur fasi B: 0,1% maurasýrustuðpúði; halli skolun: 0–5 mín, 10%–18% A; 5–15 mín., 18%–24% A; 15–20 mín., 24%–26% A; 20–28 mín., 26%–30% A; 28–35 mín., 30%–35% A. Rennslishraði: 1,0 ml·mín⁻¹; súluhitastig: 30 gráður; uppgötvun bylgjulengd: 330 nm. Aðferð: Sprautaðu 10 μL hvorri af staðallausnum og sýnislausnum í HPLC til greiningar.

Magnbundin ákvörðun á betaíni, mannitóli, frúktósa, glúkósa og súkrósa

Þessir þættir voru magngreindir samkvæmt fyrri aðferðum [14]. Viðmiðunarlausnir: vegið betaín, mannitól, frúktósa, glúkósa og súkrósa nákvæmlega, leyst upp í vatni til að búa til blandaða staðallausn. Sýnalausnir: þynntu Cistanche sýnislausn (útbúin eins og að ofan) með 50% metanóli í 1/5 upprunalegs styrks, blandaðu vel saman og síaðu í gegnum 0,22 μm míkróporela himnu. Litskiljunarskilyrði: Shodex ASHAIPAK NH2P-50 4E dálkur (250 mm × 4,6 mm, 5 μm); hreyfanlegur fasi: asetónítríl-vatn (77:23); rennsli: 0,7 ml·mín⁻¹; súluhitastig: 25 gráður; uppgötvun með uppgufunarljósdreifingarskynjara (ELSD): svifrörshiti 100 gráður, burðargasflæði 3 L·mín⁻¹. Magngreining var framkvæmd með því að sprauta 5 μL og 10 μL af staðallausnum og 5 μL af sýnislausn og reikna innihaldið með ytri stöðluðu tveggja punkta lógaritmísku jöfnunni.

Fingrafaralíkindismat

Sýnislausnir voru útbúnar eins og lýst er hér að ofan og HPLC aðstæður og aðferðir voru þær sömu og fyrir fenýletanóíð glýkósíð magngreiningu. Litskiljunargögn voru flutt inn í „Hefðbundin kínversk læknisfræði litskiljun fingrafaralíkindamatskerfis (2012 útgáfa)“. Litskiljun sýnis K1 var notuð sem viðmiðun, með fimm fenýletanóíð glýkósíðtoppum merktum fyrir margpunkta leiðréttingu, myndaði yfirlags- og viðmiðunarskilju og reiknaði út fingrafaralíkindi.

 

 

Niðurstöður og greining

1. Formfræðileg auðkenning Cistanche

Villtu Cistanche sýnin sem safnað er í Kenýa sýna áberandi formfræðilega eiginleika. Blómblómið er odd, með einu bracte sem er lang-egglaga- lensulaga að lögun og tveimur litlum bracteoles, sem báðar hliðar eru glabrous. Bikarinn er pípulaga, með fimm sljóum flipum í toppnum. Krónan er pípulaga-húðlaga, 3–4 cm að lengd, um það bil 2,5 sinnum lengd bikarsins, með fimm blaðlax í toppnum og bognar brúnir. Królan er gul á litinn (Mynd 1A, B), verður brún þegar hún er þurrkuð. Þráðarnir eru um það bil 3 cm langir, með nokkur fín hár við botninn. Stíllinn er örlítið lengri en stamens og stimpillinn er næstum kúlulaga, sléttur og gljáandi. Stuðlurnar eru fjórar, með langlaga egglaga fræfla sem eru þétt þaktar löngum ullarhárum; botn fræva er skyndilega oddhvass. Þessi eiginleiki er í samræmi við lýsingar áCistanche deserticolaogCistanche salsaí "Flóru Kína"; á móti, fræfla stöð afCistanche tubulosaer bitur og ávöl, sem greinir hann greinilega frá öðrum tegundum í sömu ættkvísl [7].

Að auki, hýsilplantan,Sericocomopsis hildebrandtiiSchinz, er mikið greinóttur runni. Ungu greinarnar eru þéttar þaktar fölgulum eða hvítum ullarhárum. Blöðin eru víða spaðalaga-egglaga með þröngum botni (Mynd 1D, E). Blómblöðin eru þétt þyrpt meðfram stönginni, sem ásamt blómaásnum er þakinn gráhvítum eða fölgráum eða hvítum ullarhárum.

Safaríkur stilkur villtra Cistanche er flettur-sívalur, með fölgult eða brúnleitt yfirborð sem er þétt þakið nálarlíkum, holdugum hreisturum raðað í raðir. Áferðin er þétt en samt örlítið sveigjanleg (Mynd 2A). Þverskurður safaríka stilksins er fölgulur eða brúnleitur, með dreifðum fölbrúnum æðaknippum sem sjást með berum augum (Mynd 2B). Undir smásjánni virðast æðaknippurnar egglaga eða fusiformar, samsettar úr xylemi og floem, oft til staðar sem eintóm dreifður knippi eða flokkuð í pör eða tríó, með floem stillt í ýmsar áttir (Mynd 2C, D). Samkvæmt 2025 útgáfu af kínversku lyfjaskránni er þverskurður afCistanche deserticolaer brúnleitt, með fölbrúnum doppóttum æðaknippum sem raðað er í bylgjuhring, sem oft mynda innanbrotið hringlaga knippi; á móti,Cistanche tubulosasýnir dreifða punktalíka æðaknippa, sem er lykileinkenni til að bera kennsl á þessar tvær tegundir af Cistanche sneiðum [1]. Villti Cistanche frá Kenýa sýnir einnig dreifða punktalíka æðahnúta í þversniðinu, í samræmi við einkenniCistanche tubulosa.

 

 

Mynd 2 Útlit og þverskurðareiginleikar villtra Cistanche plöntu (K2) í Kenýa. A: Útlit stilksins; B: Þversnið holdugs stönguls; C: Parafín hluti af holdugum stilknum (safranín-hröð græn litun); D: Stækkuð sýn á æðabúnt í paraffínhlutanum