Cistanche Glycosides draga úr blöðruhálskirtli í góðkynja stækkun blöðruhálskirtils með því að stjórna MiRNA‑483‑3p

 

ÁSTANDUR

Markmið:Til að kanna batnandi áhrif cistanche glýkósíða á bandvefsmyndun í blöðruhálskirtli við góðkynja stækkun blöðruhálskirtils (BPH) og aðferð sem felur í sér stjórnun á microRNA (miRNA)-483-3p.

Aðferðir:Karlkyns músum var úthlutað af handahófi í fimm hópa: eðlilega stjórn, BPH líkanstýringu, fínasteríð, cistanche glýkósíð og cistanche glýkósíð + miRNA-483-3p mótlyf. BPH líkanið var komið á með tvíhliða orchiectomy fylgt eftir með daglegri inndælingu testósterónprópíónats undir húð. Eftir 30 daga var kollagenútfelling í blöðruhálskirtli metin með Masson's trichrome og Sirius Red litun og innihald hýdroxýprólíns (Hyp) var mælt. MRNA gildi umbreytandi vaxtarþáttar-1 (TGF-1), mítógenvirkjaðs próteinkínasa 2 (MK2) og mítógenvirkjaðs próteinkínasa kínasa 6 (MKK6), sem og miRNA-483-3p stigs, voru ákvarðað með magnbundinni rauntíma PCR (qPCR). Próteinmagn í blöðruhálskirtli TGF-1, MK2, fosfórýleraðs MK2 (p-MK2), MKK6 og fosfórýleraðs MKK6 (p-MKK6) var metið með Western blotting. Bein binding miRNA-483-3p við MK2 var skoðuð með því að nota luciferase reporter próf.

Niðurstöður:Miðað við venjulega samanburðarhópinn sýndi BPH líkanviðmiðunarhópurinn marktækt aukið kollagenútfellingu í blöðruhálskirtli; hækkuð mRNA gildi TGF-1, MK2 og MKK6; og hærra próteinmagn TGF-1, p-MK2 og p-MKK6 (allt P < 0,01), á meðan miRNA-483-3p gildi lækkuðu marktækt (P < 0,01). Í samanburði við BPH líkan viðmiðunarhópinn, stýrðu cistanche glýkósíð miRNA-483-3p, lækkuðu mRNA gildi TGF-1, MK2 og MKK6, lækkuðu próteinmagn TGF-1, p-MK2 og p-MKK6 og létta af kollagenútfellingu prostatic. Athyglisvert er að samhliða gjöf miRNA-483-3p antagomírsins og cistanche glýkósíða dró marktækt úr miRNA-483-3p, jók kollagenútfellingu og hækkaði mRNA gildi TGF-1, MK2 og MKK6 sem og próteinmagn TGF-2-p-M, pKKM, pKKM, pKKM, og pKKM. cistanche glýkósíð eingöngu (allt P < 0,01). Lúsiferasagreiningin sýndi að miRNA-483-3p beinist beint að MK2.

Ályktun: Cistanche glýkósíð draga úr bandvefsmyndun í blöðruhálskirtli í BPH með því að stjórna miRNA-483-3p og hindra MK2 boð.

Lykilorð: Cistanche glýkósíð; miRNA‑483‑3p; blöðruhálskirtli;bandvefssjúkdómur; góðkynja stækkun blöðruhálskirtils

 

 

 

Hágæða Cistanche Deserticola

Meiri þekkingu um jurt fyrir BPH meðferð

 

Stuðningsþjónusta Wecistanche - Stærsti útflytjandi cistanche í Kína:
Netfang:wallence.suen@wecistanche.com
 

 

Inngangur

Góðkynja stækkun blöðruhálskirtils (BPH)er algengt ástand hjá miðaldra og eldri körlum, þar sem algengi eykst með aldri. Skýrslur benda til þess að algengi BPH sé yfir 50% meðal karla yfir 50 ára. BPH og tengd einkenni frá neðri þvagfærum (LUTS) leggja verulegar byrðar á lífsgæði og langtíma heilbrigðiskostnað. Klínískt eru 5 -redúktasahemlar og adrenvirkir viðtakablokkar ráðlagðir lyfjameðferðir. Hins vegar draga ‑blokkar ekki úr rúmmáli blöðruhálskirtils og 25–30% sjúklinga sýna engan bata á LUTS með 5 -redúktasahemlum; þar að auki geta 5–7% jafnvel versnað. Þrátt fyrir að nýjungar í skurðaðgerðum eins og thulium laser blöðruhálskirtilsnám séu notaðar í auknum mæli samanborið við transurethral resection á blöðruhálskirtli, þá koma LUTS eftir aðgerð enn yfir 23%.

Núverandi vísbendingar benda til þriggja helstu meinafræðilegra ferla í BPH: kirtilstækkun, samdráttur sléttra vöðva og bandvefsmyndun í blöðruhálskirtli. Þessi ferli virka sjálfstætt eða með samverkandi áhrifum til að knýja fram klínískar framfarir. BPH er venjulega (þó ekki undantekningarlaust) samhliða LUTS; bandvefsmyndun, sem einkennist af of mikilli útfellingu utanfrumu fylkis, skerðir sveigjanleika þvagrásar í blöðruhálskirtli og stuðlar að þvagteppu. Samt eru meðferðarmöguleikar sem miða sérstaklega að líffæratrefjum takmarkaðir.

Cistanche (Cistanche spp.) er hefðbundin lækninga- og næringarjurt. Einkennandi fenýletanóíð glýkósíð þess (hér sameiginlega nefnd cistanche glýkósíð, svo sem echinacoside og acteoside) sýna víðtæka lífvirkni, þar á meðal örverueyðandi, blóðfitulækkandi, ofnæmislyf, hjartadrepandi, sykursýkislyf, æxlishemjandi, taugavörn, andoxunarefni og ónæmisbælandi áhrif. Uppsöfnuð sönnunargögn benda til trefjaeyðandi verkunar þessara glýkósíða í líffærum eins og nýrum, lungum, hjarta og lifur. Hins vegar hefur ekki verið greint frá áhrifum þeirra á bandvefsmyndun í blöðruhálskirtli. Þessi rannsókn skoðuð áhrif cistanche glýkósíða á bandvefsmyndun í blöðruhálskirtli og kannaði undirliggjandi aðferðirnar, með áherslu á miRNA-483-3p/MK2 ásinn sem skiptir máli fyrir endurgerð utanfrumufylkis.

Hágæða Cistanche Deserticola

 

Efni og aðferðir

Efni

 

miRNA-483-3p antagomír (efnafræðilega breytt): keypt frá Shanghai GenePharma Co., Ltd. (lotunúmer: 12953).

Testósterón própíónat innspýting: Tianjin Jinyao Pharmaceutical Co., Ltd. (lotunúmer: 150822).

Cistanche glýkósíð: Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd. (hreinleiki meiri en eða jafnt og 98%, lotunúmer: M14062). Athugasemd fyrir næringarefnaframleiðendur: efni samsvarar stöðluðu fenýletanóíð glýkósíðhluta; tryggja forskrift með HPLC innihaldi (td heildar PEGL, echinacoside/acteoside).

Finasteride töflur: MSD (Hangzhou) Pharmaceutical Co., Ltd. (lotunúmer: U011856; 5 mg/tafla).

Luciferase reporter prófunarsett (lotunúmer: E2920) og psiCHECK-2 vektor (lotunúmer: C8021): Promega (Bandaríkin).

qPCR greiningarsett: KAPA Biosystems (lotunr.: KM4101).

Hýdroxýprólín (Hyp) prófunarsett: Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (lotunúmer: 20190626).

Grunnur fyrir TGF-1, MK2 og MKK6 voru smíðaðir af Wuhan Tianyi Huiyuan Biotechnology Co., Ltd.

Hágæða Cistanche Deserticola

 

Dýr

Sjö vikna gamlar C57BL/6 karlkyns sýklalausar (SPF) karlkyns mýs (22–24 g) voru fengnar frá Huazhong Agricultural University (framleiðsluleyfisnr.: SCXK Hubei 2015-0019). Dýrin voru hýst við 23 ± 2 gráður, 50 ± 5% rakastig, undir 12 klst ljós/12 klst myrkri hringrás.

 

Búnaður

 

StepOnePlus rauntíma PCR kerfi (Applied Biosystems, Bandaríkjunum).

Luminoskan 5200110 örplötuljósamælir (Thermo Fisher Scientific, Bandaríkjunum).

Tilraunahönnun og BPH líkan
Eftir 1 viku af aðlögun var músum skipt af handahófi (slembitölutöflu) í fimm hópa (n=6 í hverjum hópi): eðlilegt samanburðarkerfi, BPH líkanstýring, fínasteríð, cistanche glýkósíð og cistanche glýkósíð + miRNA-483-3p antagómír. BPH líkanið var framkallað með skurðaðgerð ásamt daglegri inndælingu undir húð af testósterónprópíónati við 7,5 mg·kg⁻¹ í 30 daga. Fínasteríð hópurinn fékk fínasteríð til inntöku 1 mg·kg⁻¹ daglega (leyst upp í 0,5% CMC‑Na). Cistanche glýkósíð hópurinn fékk cistanche glýkósíð til inntöku 100 mg·kg⁻¹ daglega. Samsetti hópurinn fékk 100 mg·kg⁻¹ til inntöku 100 mg·kg⁻¹ daglega auk inndælingar í rósbláæð af miRNA‑483‑3p antagomír á 10 mg·kg⁻¹ á 5 daga fresti eftir leiðbeiningum framleiðanda. Venjuleg og BPH líkan samanburðarhópar fengu jafnt rúmmál af 0,5% CMC-Na til inntöku.

Eftir 30 daga voru mýs svæfðar með inndælingu natríumpentóbarbitals í kviðarhol (80 mg·kg⁻1) og aflífaðar með leghálsi. Blöðruhálskirtli var skorið út; Skammtar voru festir og felldir inn fyrir Masson's trichrome og Sirius Red litun, og ferskir vefir voru unnar fyrir qPCR, Western blotting og lífefnafræðilegar prófanir. Dýraaðferðir voru í samræmi við reglugerðir Hubei-héraðs um stjórnun tilraunadýra (Rekstrarhæfisnr.: TY20190784).

Hágæða Cistanche Deserticola

 

Mat á blöðruhálskirtli

Kollagenútfelling var metin með Sirius Red og Masson þríkróm litun. Hyp-innihald í blöðruhálskirtilsvef var magnmælt samkvæmt leiðbeiningum setts. Fyrir hverja glæru voru þrír slembireitir greindir með Image-Pro Plus 6.0 til að reikna út hlutfall jákvætt litaðs svæðis.

Mat á MK2 Pathway Activity

qPCR: MRNA-gildi MK2, TGF-1 og MKK6 í blöðruhálskirtli voru mæld. Grunnröð:

MK2 (264 bp) áfram 5'-GGAAGTGCCTGCTGAT-3', afturábak 5'-AGTTGTGACTGGTGGTTT-3';

TGF-1 (153 bp) áfram 5'-AGGAGACGGAATACAGGG-3', afturábak 5'-ATGAGGAGCAGGAAGGG-3';

MKK6 (146 bp) áfram 5'-CCTCAGACCAGTTCCAC-3', afturábak 5'-CGCATCTTCTCCACCA-3'.

Western blot: Próteinmagn TGF-1, MK2, p-MK2, MKK6 og p-MKK6 var ákvarðað í samræmi við áður staðfestar samskiptareglur.

Mæling á miRNA‑483‑3p
miRNA‑483‑3p grunnur: áfram 5'-GGGTCACTCCTCCCCT-3', afturábak 5'-AACTGGTGTCGTGGAGTCGGC-3'; RT grunnur 5'-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAAGACGGG-3'. qPCR var framkvæmt samkvæmt leiðbeiningum setts.

 

Luciferase Reporter Assay

MK2 3'UTR var klónað inn í psiCHECK-2 ferjuna til að búa til villigerð (WT) og stökkbreytt (MUT) skýrsluplasmíð. HEK‑293T frumur voru samsmitaðar með miRNA‑483‑3p og skýrsluplasmíðunum með Lipofectamine 3000; stjórnfrumur fengu tóman vektor. Eftir 24 klst. var virkni lúsiferasa mæld samkvæmt samskiptareglum settsins.

Tölfræðigreining
Gögnin voru greind með SPSS 17.0. Einhliða ANOVA var beitt eftir staðfestingu á eðlilegu og einsleitni dreifni. Niðurstöður eru gefnar upp sem meðaltal ± SD. LSD post hoc próf voru notuð fyrir margvíslegan samanburð. Mismunur var talinn tölfræðilega marktækur við P < 0,05.

 

Niðurstöður

Í samanburði við venjulega samanburðarhópinn sýndi BPH líkanviðmiðunarhópurinn áberandi aukningu á kollagenútfellingu í blöðruhálskirtli; hækkuð mRNA tjáning TGF-1, MK2 og MKK6; og hærra próteinmagn TGF-1, p-MK2 og p-MKK6 (allt P < 0,01). magn miRNA-483-3p var marktækt lækkað (P < 0,01).

Miðað við BPH líkanstýringu, stýrðu cistanche glýkósíð marktækt miRNA-483-3p, lækkuðu mRNA gildi TGF-1, MK2 og MKK6, lækkuðu próteinmagn TGF-1, p-MK2 og p-MKK6 og dró úr kollagenútfellingu í prostatic.

Samanborið við cistanche glýkósíð eitt sér, minnkaði samsetning cistanche glýkósíða með miRNA-483-3p mótefninu marktækt miRNA-483-3p og jók kollagenútfellingu, auk mRNA styrks af TGF-1, MK2 og MKK6 af TGF-1,-MK-2 og próteinum, sem og próteinum. p-MKK6 (allt P < 0,01).

Lúsiferasa blaðagreiningin staðfesti að miRNA-483-3p beinist beint að MK2.

 

Umræða (stutt, næringarfræðilega miðuð)

Þessi rannsókn gefur til kynna að cistanche glýkósíð dragi úr blöðruhálskirtli í vönun/testósteróns-völdum BPH líkani með því að hækka miRNA-483-3p og bæla MK2 ferlavirkni niðurstreymis TGF-merkja. Með hliðsjón af takmörkunum núverandi BPH lyfjameðferðar við að takast á við trefjabreytingar, geta cistanche glýkósíð táknað viðbótar næringarfræðilega stefnu sem miðar að utanfrumufylkijafnvægi.

Fyrir þróun fæðubótarefna eru eftirfarandi atriði:

Stöðlun: skilgreinið heildarfjölda fenýletanóíð glýkósíða og merkja efnasambönd (td echinacoside Stærra en eða jafnt og 20%, acteoside Stærra en eða jafnt og 10% með HPLC).

Skammtaþýðing: 100 mg·kg⁻¹ í músum er um það bil 8–12 mg·kg⁻¹ jafngildisskammtur fyrir mönnum (HED) með mælingu á líkamsyfirborði, u.þ.b. 500–800 mg/dag fyrir 60–70 kg fullorðinn; krafist er klínískrar staðfestingar.

Gæði og öryggi: tryggja auðkenni (grasauppspretta, aðskotaefni, þungmálmar, skordýraeitur) og meta hugsanlegar milliverkanir við blokka eða 5 redúktasahemla.

Fullyrðingar: fullyrðingar um uppbyggingu/virkni ættu að einbeita sér að því að „styðja þvagflæði og jafnvægi í blöðruhálskirtli“ og forðast sjúkdómsmeðferðarmál án klínískra sannana.

 

Ályktanir

Cistanche glýkósíðdraga úr bandvefsmyndun í blöðruhálskirtli í BPH með því að stjórna miRNA-483-3p og hindra MK2 boð. Þessar niðurstöður styðja frekari þýðingarrannsóknir á stöðluðum cistanche útdrætti sem viðbótarnæringarefni fyrir heilsu blöðruhálskirtils.

 

Viðurkenningar

Þetta verk var stutt af National Natural Science Foundation of China (Grant No. 81703594).

Upplýsingar um höfund
Yang Chuhao (1991–), kvenkyns, Wuhan, Hubei, klínískur lyfjafræðingur, MS; meginrannsóknarsvið: klínísk lyfjafræði. ORCID: 0000-0002-8921-5758; Sími: +86-27-82440854.