CaWRKY30 stjórnar jákvætt piparónæmi með því að miða CaWRKY40 gegn Ralstonia Solanacearum sáningu með mótandi varnartengdum genum. Part 2

2.5. CaWRKY30 Tímabundin yfirtjáning örvuð HR-eins frumudauða, framleiðsla á H2O2 og umritunaruppstýringu ónæmistengdra merkja gena

VIGS tilraunirnar gáfu til kynna að CaWRKY30 stjórnar ónæmi pipars gegn RSI á jákvæðan hátt. Tímabundnar oftjáningartilraunir voru gerðar með því að síast inn í GV3101 frumur sem bera 35S:00 (EV) eða 35S: CaWRKY30 inn í piparlauf til frekari sannprófunar á þessum vangaveltum. Við rannsökuðum hlutverk CaWRKY30 tímabundinnar oftjáningar á framkalli HR-líks frumudauða og H2O2 uppsöfnun í piparplöntum. Tjáning CaWRKY30 í piparplöntum var staðfest með vestrænum blotting tilraunum (Mynd 5A).

HR-líkur frumudauði og H2O2 uppsöfnun voru staðfest með trypan blue og DAB litun, í sömu röð. Niðurstöður leiddu í ljós að tímabundin oftjáning á CaWRKY30 olli HR-líkum frumudauða og H2O2 uppsöfnun í piparlaufum sem birtist með dökkri trypanbláu litun og dökkbrúnum DAB litun (Mynd 5B). Leiðni var gerð til að rannsaka styrk frumudeps af völdum tímabundinnar oftjáningar CaWRKY30 og niðurstöður gáfu til kynna að piparlauf sem yfirtjáðu CaWRKY30 tímabundið sýndu meiri jónaleka 24 og 48 klst. eftir Agro-íferð samanborið við piparlauf yfir- tjá tóman vektor (Mynd 5C). Hlutfallslegt umritunartjáningarstig varnartengdra merkja gena eins og ET-lífmyndunartengds CaPR1, SA-tengts CaNPR1, ABA-svarandi CaABR1 og HR-tengds merkisgena CaHIR1 greindist með qRT-PCR greiningu.

Niðurstöður okkar sýndu að tímabundin oftjáning CaWRKY30 í pipar skilur eftir magnaða umritunarsöfnun CaPR1, CaNPR1, CaDEF1, CaABR1 og CaHIR1 í pipar samanborið við tímabundið oftjáningu á tómum vektor piparplöntum við 48 dpi (mynd 5D). Þessar niðurstöður sýna að CaWRKY30 virkar sem jákvæður stjórnandi á HR-líkan frumudauða plantna, H2O2 framleiðslu og umritunaruppfærslu ónæmistengdra merkja gena.

Mynd 5. Tímabundin oftjáning á CaWRKY30 olli HR-líkum frumudauða, H2O2 uppsöfnun og tjáningu ónæmistengdra merkja gena í piparlaufum. Árangursrík oftjáning CaWRKY30-fánans var staðfest með Western blotting tilraun (A), HR-eins frumudauða af stað af tímabundinni oftjáningu á 35S: CaWRKY30, staðfest með svipgerðagreiningu, útsetningu undir UV ljósi og DAB og Trypan Blue litun við 48 hpi, í sömu röð; Kvarðastika=50 µm (B), Mæling á raflausnsleka (jónaleiðni) til að áætla frumudauðasvörun í piparblaðaskífum 24 og 48 klst. eftir agro-íferð, í sömu röð (C), qRT-PCR próf til athugaðu umritunartjáningarstig ónæmistengdra merkja gena, þar á meðal CaPR1, CaNPR1, CaDEF1, CaABR1 og CaHIR1 í 35S: CaWRKY30 tjáðu piparlauf við 48 dpi, í sömu röð (D). Hlutfallslegt tjáningarstig þekktra varnartengdra merkigena í piparlaufum sem oftjáðu tóma vektorinn tímabundið var stillt á „1“. Gögn sem tákna meðaltal ± SE frá fjórum líffræðilegum endurteknum. Villustikur eru staðlaðar villur á aðferðum. Mismunandi stafir fyrir ofan súlurnar gefa til kynna verulegan mun á meðaltalinu.

2.6. Innbyrðis tengsl CaWRKY30 og CaWRKY40

Það er greint frá því að mismunandi WRKY TFs mynda tengslanet saman og við höfum áður greint frá því að ýmsir meðlimir WRKY TFs, þ.e. CaWRKY6, CaWRKY22 og CaWRKY40, eru tjáningar- og virknitengdir hver öðrum. Þess vegna gerum við ráð fyrir því að CaWRKY30 gæti tengst öðrum meðlimum WRKY fjölskyldunnar, þar á meðal CaWRKY40, sem er jákvæður eftirlitsmaður á ónæmi pipar gegn RSI. qRT-PCR greiningin var gerð til frekari rannsókna á mögulegri endurgjöf stjórnun CaWRKY40 með CaWRKY30, og til að rannsaka hugsanlega mótun CaWRKY30 með CaWRKY40 skammvinnri yfirtjáningu prófi eða með því að þagga niður CaWRKY40 með VIGS.

CaWRKY40 er WRKY umritunarþáttur sem tekur þátt í viðbrögðum plantna við ýmsum líffræðilegum og abiotic streitu. Rannsóknir hafa sýnt að CaWRKY40 er framkallað í tómötum og getur aukið viðnám plantna við þurrka og lághitameðferðir. Að auki leiddi rannsóknin einnig í ljós að oftjáning CaWRKY40 getur bætt þurrkaþol tómata og dregið úr vaxtarhömlun af völdum saltstreitu, en þol gegn sýklum þarfnast frekari rannsókna. Þess vegna gegnir CaWRKY40 mikilvægu hlutverki í ónæmissvörun plantna og hefur ákveðna möguleika á aukningu á uppskeru í landbúnaði. Á sama tíma þurfum við líka að borga eftirtekt til friðhelgi okkar. Ónæmi líkama okkar er mjög mikilvægt. Cistanche hefur veruleg áhrif á að bæta ónæmi. Cistanche er ríkt af ýmsum andoxunarefnum eins og C-vítamín, C-vítamín, karótenóíð o.fl. Þessi innihaldsefni geta eytt sindurefnum, dregið úr oxunarálagi og bætt viðnám ónæmiskerfisins.

Smelltu cistanche deserticola viðbót

Niðurstöður okkar sýndu umritunarmagn CaWRKY30 í piparlaufum sem oftjáðu tímabundið CaWRKY40 jókst við 24 og 48 hp í samanburði við plöntur sem yfirtjáðu tóman vektor (EV) tímabundið (Mynd 6A), en umritunarmagn CaWRKY40 jókst tímabundið í þessum plöntum oftjáir CaWRKY30 samanborið við plöntur sem oftjáa EV tímabundið (Mynd 6B). Aftur á móti sýndu niðurstöður okkar að umritunaruppsöfnun CaWRKY40 var sérstaklega lækkuð í Ralstonia-sýktum CaWRKY30-þögguðum plöntum samanborið við óþagnaðar plöntur (Mynd 6C). Að auki var uppsöfnun þekktra ónæmistengdra merkja gena, td CaPR1, CaNPR1, CaDEF1, CaABR1 og CaHIR1 bæld að fullu eða að hluta í CaWRKY30 þögguðum plöntum sem voru ræst af CaWRK40 (mynd 6D).

Þessi gögn gefa til kynna umritunarstjórnun CaWRKY40 með CaWRKY30 og tilvist jákvæðrar stjórnunarlykkja sem felur í sér CaWRKY30 og CaWRKY40.

Mynd 6. Innbyrðis tengsl CaWRKY30 og CaWRKY40. Umritunartjáning lev. els af CaWRKY40 í laufum papriku sem yfirtjá CaWRKY30 tímabundið á 24 og 48 dpi (A), umritunartjáningu CaWRKY30 í laufblöðum pipar sem oftjáir CaWRKY40 tímabundið á 24 og 48 dpi (B) tímabili, gRT-PCR greining á CaWRKY40 umritunartjáningarstigum íCaWRKY30-þögguðum og óþagnuðum piparplöntum við 48 dpi (C)gRT-PCR prófun á umritunarstigum varnartengdra merkja gena í CaWRKY30-þaggaður og óþagnaðar piparplöntur sem oftjáa tímabundið 35S: CaWRKY40-HA og 35S:00við 48 hpi (D). Gögnin meðaltal plús SE frá fjórum líffræðilegum endurteknum. Villustikur eru staðlaðar villur á aðferðum. Mismunandi stafir fyrir ofan súlurnar sýna verulegan mun milli meðaltala.

2.7. Innbyrðis tengsl CaWRY30 og CaWRKY6, CaWRKY22 og CaWRKY27

Í fyrri rannsóknum okkar var greint frá því að CaWRKY40 tengdist tjáningu og virkni mismunandi WRKY TFs, eins og CaWRKY6 og CaWRKY22. Tengsl CaWRKY30 og CaWRKY40 benda til þess að CaWRKY30 sé hugsanlega tengt mismunandi WRKY TFs sem taka þátt í ónæmi pipar gegn RSI. Til að staðfesta þessa forsendu var gerð QRT-PCR greining til að rannsaka tengsl CaWRKY30 og mismunandi WRKY TFs sem áður hefur verið greint frá að taki þátt í ónæmi pipar gegn RSI, þar á meðal CaWRKY6, CaWRKY22 og CaWRKY27. Niðurstöður okkar gáfu til kynna að umritunarsöfnun CaWRKY30 var magnuð upp í CaWRKY6, CaWRKY22 og CaWRKY27 sem yfirtjáðu piparplöntur tímabundið við 48 dpi (Mynd 7A), en umritunarsöfnun CaWRKY6, CaWRKY22 og CaWRKY22 jókst einnig í yfirtjáningu CaWRKY2 og CaWRKY27 jókst einnig í yfirtjáningu. CaWRKY30 við 48 dpi (Mynd 7B). Niðurstöður okkar af qRT-PCR prófun gefa til kynna að CaWRKY30 og CaWRKY6, CaWRKY22 og CaWRKY27 séu tjáningarlega og virknilega tengdir innbyrðis.

3. Umræður

WRKY próteinið er ein stærsta fjölskylda plantna umritunarþátta (TF). Hópur fjölskyldumeðlima WRKY TFs, sem greint er frá frá Arabidopsis thaliana og Oryza sativa, er þekktur fyrir að taka þátt og gegna mikilvægu hlutverki í ónæmisstjórnun plantna. Greint hefur verið frá töluverðum virknibreytingum meðal náinna samsvörunarsamhverfa WRKYs [17,48], og virkni WRKY TFs í ónæmi plantna sem ekki eru fyrirmyndir, svo sem pipar, eru ófullnægjandi rannsökuð.

CaWRKY30, sem er Ill WRKY gen í hópi, hefur verið virkni einkennt í þessari rannsókn. Niðurstöður bentu til þess að CaWRKY30 stjórnar ónæmi pipar gegn RSl á jákvæðan hátt og það er mikilvægur hluti af WRKY vefnum sem samanstendur af CaWRKY6, CaWRKY22CaWRKY27 og CaWRKY40. Flækja CaWRKY30 í friðhelgi pipars er studd af sýklasvörunum cis-þáttum, þar á meðal TGA frumefni, TGACG-mótifIATC-box, TATA-box og W-box sem eru til staðar á frumkvöðlasvæði CaWRKY30. Þessi forsenda var í samræmi við uppstjórnun á umritunargildum CaWRKY30 eftir og eftir utanaðkomandi ETH, ABA og SA [49,50].

Þar sem oft hefur verið vitað að gen sem koma af stað vegna útsetningar fyrir ákveðnum streituþætti taka þátt í að bregðast við þeirri streitu [51], gátum við að CaWRKY30 gæti stjórnað ónæmi pipar gegn RSI á jákvæðan hátt. Þessar vangaveltur voru studdar af gögnum um þöggun á CaWRKY30 af VIGS, og með CaWRKY30 skammvinnri yfirtjáningargreiningu. Þessu skerta ónæmi vegna taps á virkni CaWRKY30 fylgdi aukinn vöxtur RSI og niðurstjórnun ónæmistengdra merkigena eins og SA-háð CaPR1 (52CaNPR1 [53], JA-tengt CaDEF1 (54), ABA-tengt CaABR1 [55] ], og HR-tengt CaHIR1 (561. Á hinn bóginn, HR-líkur frumudauði og HO, seyting var kveikt af tímabundinni oftjáningu á CaWRKY30 ásamt umritunaruppfærslu á ónæmistengdum merkigenum eins og CaPR1, CaNPR1, CaDEF1, CaABR1, ogCaHIR1. Þetta bendir til hlutverks CaWRKY30 sem jákvæðs eftirlitsaðila á HR-líkum frumudauða og ónæmis pipar gegn RSI. Sömuleiðis hefur komið fram í fyrri rannsóknum að AtWRKY30, samsvörun CaWRKY30 í Arabidopsis, stjórnar jákvætt virkni plantna -munitv gegn líffræðilegum og abiotic streitu 157. 581. Þetta má benda til þess að CaWRKY30 sé uppstýrt við Ralstonia sýkingu, sem leiðir til minnkaðrar viðkvæmni pipars fyrir bakteríusýkingu.

Fýtóhormón eins og ET, ABA og SA eru nauðsynlegar boðsameindir sem taka þátt í viðbrögðum plantna við árásum sýkla og streitu við háan hita. Þetta taka einnig þátt í víxlræðu milli viðbragða plantna við líffræðilegum og ólífrænum streitu [59]. SA hvetur til ónæmis gegn líffræðilegum sýkingum, en ET gegnir mikilvægu hlutverki í ónæmi plantna gegn drepsýklum [60]. Almennt er myndun SA, ET og JA tengd við PAMP-kveikt ónæmi (PTI) eða áhrifavirkjað-ónæmi (ETI). Þessi jurtahormón geta gegnt hlutverki sínu bæði á samverkandi og mótvægi byggt á styrk þeirra við varnarboð [61]. Samvirkt samband milli þessara þriggja merkjaþátta hefur greinst í PTI, en uppbótarsamband hefur greinst í ETI [62]. CaWRKY30 var stöðugt framkallað af utanaðkomandi plöntuhormónum. Þekkt SA, ET og ABA háð ónæmistengd merki gen eins og CaPR1, CaNPR1, CaDEF1 og CaABR1 var stjórnað niður með þöggun á CaWRK30; Hins vegar var þeim stjórnað af tímabundinni oftjáningu á CaWRKY30 í piparplöntum, sem sýnir að CaWRKY30 tekur þátt í samverkandi miðluðum varnarmerkjum SA, ET og ABA, sem leiðir til PTI.

Greining á erfðamengi sýndi þátttöku nokkurra WRKY TFs í ónæmi plantna [63-65]. Með rannsóknum á hagnýtri erfðafræði, WRKY1 [66], -11 [67], -17 [67], -18 [68], -22 [69], {{13} } [70], -28 [71], -33 [72], -38 [73], -40 [68], -45 [74], -46 [75], -53 [76], -54 [75], -60 [68], -62 [77], -70 [75] og -75 [78] hafa verið einkennist af ónæmi Arabidopsis, sem stjórnar ónæmi jákvætt eða neikvætt. Þessum WRKY TF hefur verið stungið upp á að raða sér inn í WRKY umritunarvef, sem samanstendur af plús ve og -ve endurgjöf lykkja og framsendingareiningum [12]. Hins vegar er uppsetning þessara WRKY netkerfa enn illa skilin.

Í fyrri rannsóknum komumst við að því að CaWRKY6, CaWRKY22, CaWRKY27 og CaWRKY40 eru jákvæðir eftirlitsaðilar fyrir ónæmi pipars gegn RSI [9,44,45], á meðan CaWRKY58 er neikvæður eftirlitsaðili [46]. Núverandi rannsókn leiðir til þess að CaWRKY30 virkar sem jákvæður eftirlitsaðili í HR-líkum frumudauða pipars og svörun pipars við R. solanacearum sýkingu. Umritunartjáning CaWRKY30 var uppstillt við tímabundna oftjáningu á CaWRKY6, CaWRKY22, CaWRKY27 og CaWRKY40. Aftur á móti stýrði CaWRKY30 tímabundin oftjáning uppsöfnun CaWRKY6, CaWRKY22, CaWRKY27 og CaWRKY40, sem bendir til tilvistar WRKY TF netkerfa og auk ve endurgjöfarlykkja meðal CaWRKY6, CaWRKY22, CaWRKY27 og CaWRKY27,. Jafnt plús ve endurgjöfarlykkjur eiga að taka þátt í ónæmi plantna [47]. Sams konar plús og endurgjöf hefur verið til staðar meðal CaWRKY40 og CaWRKY6, CaWRKY40 og CabZIP63, CaWRKY40 og CaCDPK15. Í fyrri rannsóknum hefur einnig fundist CaWRKY6 [44] og CabZIP63 [16] taka þátt beint og umritað í stjórnun CaWRKY40 tjáningar gegn RSI. Með hliðsjón af þessum niðurstöðum má benda á að CaWRKY40 gæti verið samræmd af ýmsum TF. Að lokum er CaWRKY40 tjáning stjórnað af CaWRKY6, CaWRKY22, CaWRKY30 og CabZIP63 við RSI, og CaWRKY40 tjáning er stjórnað af CaWRKY6 og CabZIP63, en ekki af CaWRKY30 í pipar eftir útsetningu fyrir háum hita.

4. Efni og aðferðir

4.1. Plöntuefni og vaxtarskilyrði

Fræ af pipartegundinni 'Mexi' og Nicotiana benthamiana voru fengin frá Ayub Agriculture Research Institute, Faisalabad, Pakistan. Pepper og N. benthamiana fræ voru gróðursett í plastpotta með jarðvegi blöndu [mó og perlít; 2/1 (v/v)] og haldið í vaxtarherbergi við stýrðar aðstæður, þ.e. 25 ◦C hitastig, 60–70 µmól ljóseindir m−2 s −1 ljósstyrkur og 70 prósent hlutfallslegur raki við 16 klst. ljós/8 h dökkt ljósatímabil.

4.2. Myndun vektora

Gátt-klónunartæknin var notuð til að búa til vektora. Til að smíða gervihnattaferjur var CaWRKY30 ORF í fullri lengd (með endakódon eða án endakódons) klónað inn í inngönguferju pDONR207 með því að nota BP hvarf. Síðan var þessi smíði flutt yfir í áfangaferjur pMDC83, CD3687 (HA-merki), CD3688 (Flag-tag) og Pk7WG2 með því að framkvæma LR viðbrögð til að búa til vektora fyrir staðsetningar undir frumu og oftjáningu, í sömu röð.

Til að smíða vektora fyrir VIGS var 364 bps brot í 30 -óþýtt svæði (UTR) af CaWRKY30 valið og sérhæfingin var staðfest með BLAST gegn erfðamengisröð í gagnagrunni CM334 (http://peppergenome.snu. ac.kr/ (sótt 29. október 2021)) og Zunla-1 (http://peppersequence.genomics.cn/page/species/blast. jsp (sótt 29. október 2021)). Næst var BP hvarfið framkvæmt til að klóna þetta brot inn í pDONR207/201, eftir að þessi smíði var flutt inn í vektor PYL279 með því að framkvæma LR hvarf.

4.3. Vöxtur sýkla og sáningaraðferðir

Við einangruðum samhæfðan illvígan stofn af R. solanacearum úr piparplöntum sem smitast af Ralstonia frá Dera Ghazi Khan, Pakistan. Tetrazolium klóríð aðferðin var notuð til að hreinsa ofanjarðar æðavefshluta útflæðis af sýklasýktum plöntum [9,45]. Einangraða R. solanacearum var ræktað í SPA miðli í hitastýringarhristara (200 g kartöflur, 20 g súkrósa, 3 g nautakjötsþykkni, 5 g tryptón og 1 L af tvíeimuðu H2O) við 200 snúninga á mínútu og 28 ◦C fyrir yfir nótt. Næst var ræktaði R. solanacearum stofninn skilinn í skilvindu við 6500 pm og 28 ◦C í 10 mín. Fljótandi floti eftir skilvindu var hellt út og kögglum í botni skilvindurörsins var þynnt í dauðhreinsaða 10 mM MgCl2 lausn. Þéttleiki bakteríufrumna var stilltur á 108 cfu ml−1 (OD600=0.8).

Til að rannsaka áhrif RSI á umritunargildi CaWRKY30 og á viðnám piparplantna gegn R. solanacearum árás, var efsta þriðja blaðið af piparplöntum síast inn með 10 µL af R. solanacearum lausn með sprautu án nálar. Sýklameðhöndluð laufsýni voru tekin á ákveðnum tímapunktum fyrir vefjaefnafræðilegar litunartilraunir (td DAB litun eða trypan blá litun), rafleiðni, cfu og RNA útdrátt fyrir fleiri tilraunir. Fyrir svipgerðatilraunina á CaWRKY30-þögguðum og óþagnuðum plöntum voru rætur skaddar með því að nota glerstöng og síast inn í samhæft meindýrt R. solanacearum. Plöntur voru geymdar í vaxtarklefa við stjórnaðstæður við 28 ± 2 ◦C hitastig, 60–70 µmól ljóseindir m−2 s −1 ljósstyrkur, 70 prósent rakastig og undir 16-ljósum/{{12 }}h dökkt ljóstímabil eftir R. solanacearum sáningu. Myndir af svipgerðinni voru teknar eftir RSI með ákveðnu millibili.

4.4. Foliar Notkun phytohormóna

Til að rannsaka áhrif plöntuhormóna voru heilbrigðar piparplöntur úðaðar með 100 µM ETH, 100 µM ABA og 1 mM SA á fjórum blaðastigum. Spottaðar (viðmiðunar)plöntur voru meðhöndlaðar með dauðhreinsuðu ddH2O. Sýnum sem voru meðhöndluð með plöntuhormónum var safnað á æskilegum tímapunktum fyrir RNA útdrátt og frekari rannsóknir.

4.5. Athugun á CaWRKY30 undirfrumustaðsetningu

Agrobacterium frumur með 35S: CaWRKY30-GFP eða 35S: GFP (viðmið) voru ræktaðar yfir nótt í LB miðli með samsvarandi sýklalyfjum. Ræktaður miðill var skilinn í skilvindu við 6500 rpm, fljótandi floti var hellt út og kögglan í botninum var þynnt í örvunarmiðli (10 mM MES, 10 mM MgCl2, pH 5,7 og 150 µM asetósýringón) og stillt á OD{{ 10}}.8. Agrobacterium sem innihélt 35S: CaWRKY30-GFP og 35S: GFP var sprautað í lauf N. benthamiana með því að nota sprautu án nálar. Aðferðin sem áður var lýst var notuð til að gera 4,6-diamidino-2-fenýlindól litun (DAPI) [9]. Við 48 hpt sáust GFP og DAPI flúrljómunarmerki og myndir voru teknar með leysiskönnun confocal smásjá (TCS SP8, Leica, Solms, Þýskalandi), með örvunarbylgjulengd 488 nm og 505–530 nm band-pass losun sía.

4.6. Vefjaefnafræðileg litun

Vefefnafræðileg litun (Trypan blue og 3, 30 -diaminobenzidine) var framkvæmd eins og áður hefur verið lýst [9,11,79]. Til að framkvæma trypan blátt litunarprófið voru lauf af pipar soðin í trypan blári lausn (10 ml mjólkursýru, 10 ml glýseról, 10 ml fenól, 40 ml etanól, 10 ml ddH2O og 1 ml af trypan bláu) í 30 mín. Síðan voru laufin geymd við stofuhita í 8 klst, sökkt í lausn af klóralhýdrati (2,5 g af klóralhýdrati leyst upp í 1 ml af eimuðu vatni) og aflituð með því að sjóða í 30 mín. Klórhýdratlausninni var breytt mörgum sinnum til að minnka bakgrunninn og síðan voru sýni sett í 70 prósent glýseról. Laufblöð voru sett í 1 mg/ml af DAB lausn yfir nótt fyrir DAB litunarpróf. DAB-lituðu blöðin voru soðin í mjólkursýru:glýseróli: algeru etanóli [1:1:3 (v/v/v)] og síðan aflituð í algeru etanóli yfir nótt [80]. Myndirnar af trypanbláum og DAB-lituðum laufum voru teknar með myndavél og með ljóssmásjá (Leica, Wetzlar, Þýskalandi).

4.7. Þöggun á CaWRKY30 með vírusvöldum genaþögn (VIGS)

Áður lýst Tóbaks Rattle Virus (TRV) byggt veiru-induced gene silencing kerfi (VIGS) var framkvæmt fyrir CaWRKY30 þöggun í piparplöntum [47,81,82]. Agrobacterium GV3101 sem innihélt PYL192, PYL279-CaWRKY30, PYL279 og PYL279-PDS (OD600=0.8) smíði var blandað í 1:1 hlutfalli. Þessari blöndu var síast inn í 2-vikugamla piparplöntur með sprautu án nálar. Plönturnar sem síast inn voru ræktaðar í vaxtarklefa í 56 klst. undir myrkri við 16 ◦C hitastig og 45 prósent rakastig, og síðan færðar inn í vaxtarherbergi við stýrðar aðstæður við 25 ± 2 ◦C, 60–70 µmól ljóseindir m−2 s -1, og hlutfallslegur raki 70 prósent undir ljósatímabili sem er 16 klst. ljós/8 klst. dimmt.

4.8. CaWRKY30 Tímabundin yfirtjáning í piparlaufum

Agrobacterium frumur GV3101 sem innihalda CaWRKY30-Flag og EV voru ræktaðar í LB miðli í hitastýringarhristara, með samsvarandi sýklalyfjum yfir nótt og OD600=1.0. Síðan voru þessi Agrobacterium GV3101 skilgreind við 6000 pm og 28 ◦C í 10 mín. Eftir skilvindu var fljótandi flotið fjarlægt og föstu kögglan í botninum þynnt í OD600=0.8 í innleiðslumiðli (10 mM MES, pH5.4, 10 mM MgCl2, 200 µM asetósýringón). Þessari blöndu var síast inn í laufblöð með sprautu án nálar. Þessi tímabundið oftjáð laufblöð sáust fyrir HR-líkum frumudauða, eða sýnum var safnað til að framkvæma DAB og trypan blátt litunartilraunir, og fyrir RNA einangrun fyrir fleiri tilraunir.

4.9. RNA útdráttur og magn rauntíma RT-PCR

TRIzol hvarfefnisaðferðin (Invitrogen) var notuð til að draga heildar-RNA úr laufsýnum af meðhöndluðum piparplöntum og úr sýndarplöntum. Síðan var Prime Script RT-PCR setti (TaKaRa, Dalian, Kína) notað til að snúa við umritun útdrættrar RNA. Rauntíma qRT-PCR greining var framkvæmd til að rannsaka hlutfallslegt umritunarmagn markvissa gena. Gagnavinnsla var gerð samkvæmt áður lýstum aðferðum [45,82], með sérstökum grunnum (viðbótartöflu S3), með því að nota leiðbeiningar framleiðanda fyrir Bio-Rad rauntíma PCR kerfi (Bio-Rad, Foster City, CA, USA) og SYBR forblanda Ex Taq II kerfi (TaKaRa Perfect Real Time).

4.10. Mat á rafleiðni

Rafleiðni (jónaleki) var reiknuð út með því að nota aðferðina sem lýst var áður með litlum breytingum [44,83]. Sex laufskífur (4 mm á breidd) voru fengnar með því að nota gata. Skífurnar voru þvegnar þrisvar sinnum með dauðhreinsuðu ddH2O og ræktaðar samstundis í 10 ml ddH2O. Eftir það voru þessar laufskífur geymdar í hristara sem var hrist varlega (60 snúninga á mínútu) við stofuhita í 1 klst. Leiðnimælir (Mettler Toledo 326 Mettler, Zurich, Sviss) var notaður til að skrá gögn um rafleiðni.

4.11. Immuno Blotting

Áður lýst aðferð við próteinútdráttarjafna var notuð til að vinna prótein úr piparlaufum [3]. Útdregna próteinið var ræktað yfir nótt með antiHA agarósa við 4 ◦C (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Bandaríkjunum). Segulsprunga var notuð til að safna perlum og þvegin þrisvar sinnum með Tris buffer saltvatni (TBS) og tween 20 (0,05 prósent). Skoðað prótein sást með því að nota ónæmisblettingu og and-HA-peroxidasa (Abcam, Cambridge, Bretlandi).

5. Ályktanir

Að lokum erum við þeirrar skoðunar að CaWRKY30 virkjar ónæmi pipars gegn RSI umritunarlega. Þöggun á CaWRKY30 með VIGS skerti ónæmi piparplantna fyrir sýkingu af völdum bakteríusýkinga, en tímabundin oftjáning á CaWRKY30 olli ónæmi gegn R. solanacearum. Sameiginlega er myndun jákvæðrar endurgjafarlykkja og virkni hennar samhliða öðrum TFs næg sönnun fyrir virkjun hennar undir líffræðilegu álagi. Að auki leggjum við til myndun CaWRKY30 stöðugra erfðabreyttra piparplantna og CaWRKY30 markprótein til að útskýra ítarlega hlutverk þessa gena gegn bakteríusýkingum og einnig í ýmsum efnaskiptaferlum.

Framlög höfunda:

Hugmyndafræði, AH, MIK, MA, BSA, ZL og ATKZ; Gagnavörslu, AH, MIK og AME-S.; Formleg greining, ZL og SF; Fjármögnunaröflun, AH, MIK, MAAA, MA, BSA, AME-S. og ATKZ; Verkefnastjórn, AH og MIK; Auðlindir, AH; Löggilding, SM; Visualization, SM og SF; Ritun—frumuppkast, AH og MIK; Ritun—endurskoðun og klipping, IRN, MAAA, MA, BSA, AME-S., ZL, SF og ATKZ Allir höfundar hafa lesið og samþykkt útgefna útgáfu handritsins.

Fjármögnun:

Aðalhöfundur er mjög skuldbundinn til háskólanefndar Pakistans um fjárhagsaðstoð til að framkvæma þessa rannsókn samkvæmt SRGP styrk nr. 21-2651/SRGP/HRD/HEC/2020. Núverandi vinna var styrkt af Taif University Researchers Supporting Project number (TURSP2020/245), Taif University, Taif, Saudi Arabia. Rannsóknin var einnig studd af þróunarsjóðsverkefni Fujian landbúnaðar- og skógræktarháskólans (CXZX2018114, CXZX2020008A og CXZX2019024G).

Yfirlýsing endurskoðunarnefndar stofnana: Á ekki við.

Yfirlýsing um upplýst samþykki: Á ekki við.

Yfirlýsing um framboð gagna: Öll gögn eru í handritinu og viðbótarskrám þess.4

Hagsmunaárekstrar: Höfundar lýsa ekki yfir hagsmunaárekstrum.

Heimildir

1. Arif, M.; Atta, S.; Bashir, MA; Khan, MI; Hussain, A.; Shahjahan, M.; Alwahibi, MS; Elshikh, MS Áhrif tímasetningar FosetylAluminium beitingar á Karnal bunt bælingu og efnahagslega ávöxtun brauðhveiti (Triticum aestivum L.). PLoS ONE 2021, 16, e0244931.

2. Khalofah, A.; Khan, MI; Arif, M.; Hussain, A.; Ullah, R.; Irfan, M.; Mahpara, S.; Shah, HR; Ansari, MJ; Kintl, A. Djúp staðsetning köfnunarefnisáburðar bætir ávöxtun, skilvirkni köfnunarefnisnotkunar og hagkvæman ávöxtun ígrædds fíns hrísgrjóna. PLoS ONE 2021, 16, e0247529. [CrossRef] [PubMed]

3. Noman, A.; Hussain, A.; Adnan, M.; Khan, MI; Ashraf, MF; Zainab, M.; Khan, KA; Ghramh, HA; Hann, S. Nýr MYB umritunarþáttur CaPHL8 veitir vísbendingar um þróun piparónæmis gegn jarðvegsbornum sýkla. Örvera. Pathog. 2019, 137, 103758. [CrossRef] [PubMed]

4. Hussain, A.; Noman, A.; Khan, MI; Zaynab, M.; Aqeel, M.; Anwar, M.; Ashraf, MF; Liu, Z.; Raza, A.; Mahpara, S. Sameindastjórnun á meðfæddu friðhelgi pipar og streituþol: Yfirlit yfir WRKY TFs. Örvera. Pathog. 2019, 135, 103610. [CrossRef] [PubMed]

5. Reboledo, G.; Agorio, Ad; Vignale, L.; Batista-García, RA; de León, IP Umritunarsnið sýnir varðveitt og tegundasértæk plöntuvarnarviðbrögð við samspil Physcomitrium patens við Botrytis cinerea. Plant Mol. Biol. 2021, 1–21. [Krossvísun]

6. Aerts, N.; Mendes, þingmaður; van Wees, SC Margvísleg víxlmæling í hormónetum sem stjórna vörn plantna. Plant J. 2021, 105, 489-504. [CrossRef] [PubMed]

7. Liu, Z.; Shi, L.; Weng, Y.; Zou, H.; Li, X.; Yang, S.; Qiu, S.; Huang, X.; Huang, J.; Hussain, A. ChiIV3 virkar sem nýtt markmið WRKY40 til að miðla piparónæmi gegn Ralstonia solanacearum sýkingu. Mol. Samspil plantna og örvera. 2019, 32, 1121–1133. [CrossRef] [PubMed]

8. ul Haq, MI; Maqbool, MM; Ali, A.; Farooq, S.; Khan, S.; Saddiq, MS; Khan, KA; Ali, S.; Khan, MI; Hussain, A. Hagræðing gróðursetningu rúmfræði fyrir bygg-egypska smára intercropping kerfi í hálf-þurrt sub-suðrænum loftslagi. PLoS ONE 2020, 15, e0233171.

9. Hussain, A.; Li, X.; Weng, Y.; Liu, Z.; Ashraf, MF; Noman, A.; Yang, S.; Ifnan, M.; Qiu, S.; Yang, Y. CaWRKY22 virkar sem jákvæður eftirlitsaðili í piparsvörun við Ralstonia solanacearum með því að mynda net með CaWRKY6, CaWRKY27, CaWRKY40 og CaWRKY58. Alþj. J. Mol. Sci. 2018, 19, 1426. [CrossRef] [PubMed]

10. Mukhtar, MS; Liu, X.; Somssich, IE Útskýrir hlutverk WRKY27 í ófrjósemi karla í Arabidopsis. Plöntumerki. Hegðu þig. 2018, 13, e1363945. [CrossRef] [PubMed]

11. Khan, MI; Zhang, Y.; Liu, Z.; Hu, J.; Liu, C.; Yang, S.; Hussain, A.; Ashraf, MF; Noman, A.; Shen, L. CaWRKY40b í pipar virkar sem neikvæður eftirlitsaðili til að bregðast við Ralstonia solanacearum með því að stýra varnargenum beint, þar á meðal CaWRKY40. Alþj. J. Mol. Sci. 2018, 19, 1403. [CrossRef] [PubMed]

12. Eulgem, T.; Somssich, IE Netkerfi WRKY umritunarþátta í varnarmerkjum. Curr. Opin. Plant Biol. 2007, 10, 366–371. [CrossRef] [PubMed]

13. Bakshi, M.; Oelmüller, R. WRKY umritunarþættir: Jack of many trades in plants. Plöntumerki. Hegðu þig. 2014, 9, e27700. [CrossRef] [PubMed]

14. Xu, Y.-P.; Xu, H.; Wang, B.; Su, X.-D. Kristalbyggingar N-enda WRKY umritunarþátta og DNA fléttur. Próteinfruma 2020, 11, 208–213. [CrossRef] [PubMed]

15. Chen, X.; Li, C.; Wang, H.; Guo, Z. WRKY umritunarþættir: Þróun, binding og virkni. Fýtópatól. Res. 2019, 1, 13. [Krossvísun]

16. Shen, L.; Liu, Z.; Yang, S.; Yang, T.; Liang, J.; Wen, J.; Liu, Y.; Li, J.; Shi, L.; Tang, Q. Pepper CabZIP63 virkar sem jákvæður eftirlitsbúnaður við Ralstonia solanacearum eða háhita-háan raka áskorun í jákvæðri endurgjöf með CaWRKY40. J. Exp. Bot. 2016, 67, 2439–2451. [CrossRef] [PubMed]

17. Schluttenhofer, C.; Yuan, L. Reglugerð um sérhæfða efnaskipti með WRKY umritunarþáttum. Plant Physiol. 2015, 167, 295–306. [CrossRef] [PubMed]

18. Jiang, J.; Ma, S.; Já, N.; Jiang, M.; Cao, J.; Zhang, J. WRKY umritunarþættir í viðbrögðum plantna við streitu. J. Samþ. Plant Biol. 2017, 59, 86–101. [Krossvísun]

19. Yu, K.; Pieterse, CM; Bakker, PA; Berendsen, RL Gagnlegar örverur fara neðanjarðar af rótarónæmi. Plöntufrumuumhverfi. 2019, 42, 2860–2870. [Krossvísun]

20. Noman, A.; Liu, Z.; Yang, S.; Shen, L.; Hussain, A.; Ashraf, MF; Khan, MI; He, S. Tjáning og hagnýtur mat á CaZNF830 við piparsvörun við Ralstonia solanacearum eða háum hita og raka. Örvera. Pathog. 2018, 118, 336–346. [CrossRef] [PubMed]

21. Noman, A.; Hussain, A.; Ashraf, MF; Khan, MI; Liu, Z.; Hann, S. CabZIP53 er skotmark CaWRKY40 og virkar sem jákvæður eftirlitsaðili í piparvörn gegn Ralstonia solanacearum og hitaþoli. Umhverfi. Exp. Bot. 2019, 159, 138–148. [Krossvísun]

22. Ashraf, MF; Yang, S.; Wu, R.; Wang, Y.; Hussain, A.; Noman, A.; Khan, MI; Liu, Z.; Qiu, A.; Guan, D.; o.fl. Capsicum annuum HsfB2a stjórnar á jákvæðan hátt svörun við Ralstonia solanacearum sýkingu eða háan hita og háan raka myndar umritunarfall með CaWRKY6 og CaWRKY40. Plant Cell Physiol. 2018, 59, 2608–2623. [CrossRef] [PubMed]

23. Wang, L.; Dossa, K.; Þú, J.; Zhang, Y.; Li, D.; Zhou, R.; Yu, J.; Wei, X.; Zhu, X.; Jiang, S.; o.fl. Háupplausn tímabundinna transcriptome raðgreiningar afhjúpar ERF og WRKY sem meistaraleikara í eftirlitsnetunum sem liggja að baki sesamviðbrögðum við vatnslosun og bata. Erfðafræði 2021, 113, 276–290. [Krossvísun]

24. Yang, X.; Zhou, Z.; Fu, M.; Han, M.; Liu, Z.; Zhu, C.; Wang, L.; Zheng, J.; Liao, Y.; Zhang, W.; o.fl. Auðkenning alls umrits á WRKY fjölskyldugenum og tjáningarsniði þeirra í átt að salisýlsýru í Camellia japonica. Plöntumerki. Hegðu þig. 2021, 16, 1844508. [CrossRef] [PubMed]

25. Pervez, M.; Babar, M.; Iqbal, J.; Hasnain, M.; Abbas, S.; Shah, S.; Ashraf, M. Í Silico Structural and Functional Analysis of Wrky1 and Wrky3 gen in The Selected Cereal Crops. J. Anim. Plant Sci.-JAPS 2021, 31, 322–341.

26. Liu, Z.-Q.; Liu, Y.-Y.; Shi, L.-P.; Yang, S.; Shen, L.; Yu, H.-X.; Wang, R.-Z.; Wen, J.-Y.; Tang, Q.; Hussain, A.; o.fl. SGT1 er krafist í PcINF1/SRC2-1-völdum piparvarnarsvörun með því að hafa samskipti við SRC2-1. Sci. Rep. 2016, 6, 21651. [CrossRef] [PubMed]

27. Srinivasan, K. Líffræðileg starfsemi rauð papriku (Capsicum annuum) og sterk meginregla þess Capsaicin: A Review. Crit. Séra Food Sci. Nutr. 2016, 56, 1488–1500. [CrossRef] [PubMed]

28. Liu, Z.; Shi, L.; Yang, S.; Lin, Y.; Weng, Y.; Li, X.; Hussain, A.; Noman, A.; Hann, S. Hagnýtur og frumkvöðullgreining á ChiIV3, kítínasa úr piparplöntu, sem svar við Phytophthora capsici sýkingu. Alþj. J. Mol. Sci. 2017, 18, 1661. [CrossRef] [PubMed]

29. Ali, M.; Luo, D.-X.; Khan, A.; Haq, SU; Gai, W.-X.; Zhang, H.-X.; Cheng, G.-X.; Múhameð, I.; Gong, Z.-H. Flokkun og erfðafræðileg greining á kítínbindandi próteinum Genfjölskyldu í pipar (Capsicum annuum L.) og umritunarreglugerð til Phytophthora capsici, ólífrænna streitu og hormónanotkunar. Alþj. J. Mol. Sci. 2018, 19, 2216. [CrossRef] [PubMed]

30. Noman, A.; Liu, Z.; Aqeel, M.; Zainab, M.; Khan, MI; Hussain, A.; Ashraf, MF; Li, X.; Weng, Y.; He, S. Basic leucine zipper domain trascription factors: The framvarðasveitir í plöntuónæmi. Líftækni. Lett. 2017, 39, 1779–1791. [CrossRef] [PubMed]

For more information:1950477648nn@gmail.com