Aryl kolvetnisviðtakaháðar og óháðar leiðir miðla curcumin öldrunaráhrifum Part 2

Vinsamlegast hafðu sambandoscar.xiao@wecistanche.comfyrir meiri upplýsingar

2.2.6. Ræktun á aðalmennsku EC

Aðal EC manna (Lonza, Köln, Þýskalandi) var ræktað í fullkomnum æðaþelsgrunnmiðli (EBM) (Lonza, Köln, Þýskalandi) bætt við 1 ug/mL hýdrókortisóni, 12 ug/mL nautgripaheilaþykkni, 50 ug/ ml gentamísín, 10ng/ml húðþekjuvaxtarþáttur manna og 10 prósent (o/v) kálfssermi við 37 gráður og 5 prósent CO, þar til í þriðju leið. Eftir losun með 0,05 prósent (o/o) Trypsin/EDTA (Thermo Scientific, Schwerte, Þýskalandi), voru frumur ræktaðar í 6 cm ræktunarskálum eða 6 brunna ræktunarplötum í að minnsta kosti 18 klst. fyrir transfektion eða meðferð.

Vinsamlegast smelltu hér til að vita meira

2.2.7. Tímabundin breyting á EC

Frumur voru umbreyttar eins og áður hefur verið lýst [65]. Í stuttu máli, EC var transfected með því að nota SuperFectTransfection Reagent (Qiagen, Hilden, Þýskalandi) samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. Oftjáning eða niðurfelling á AhR náðist eftir 24 eða 48 klst., í sömu röð. Transfection skilvirkni við oftjáningu var um það bil 40 prósent.

2.2.8. Scratch Wound Assay of EC

Til að rannsaka flutningsgetu EC voru rispusárspróf gerðar eins og áður hefur verið lýst [66]. Í smáatriðum voru sár sett í frumueinlag með frumusköfu eftir snefilínu. Eftir meiðslin voru ófestar frumur fjarlægðar með varlega þvotti.cistanche salsa þykkniCurcumin meðferðin var framkvæmd beint eftir að sárið var sett. Cur-cumin var leyst upp í DMSO og notað í lokastyrknum 7,5 uM. EC flutningur var magngreindur með því að lita frumurnar með 5 ug/mL 4',6-diamidino-2-fenýlindól (DAPI) (Carl Roth, Karlsruhe, Þýskalandi) í PBS í 5 mínútur eftir að frumurnar höfðu verið festar með 4 prósent (v/v) paraformaldehýði í 15 mínútur við stofuhita. Myndir voru teknar með Zeiss AxioVision Observer D1 flúrsmásjá (Carl Zeiss, Oberkochen, Þýskalandi)) með 200-stækkun. Frumur sem fluttu inn í sárið frá snefillínunni voru sjálfkrafa taldar með því að nota agnagreiningaraðgerðina á mynd]1.52a]67I eftir að skarast kjarnar voru aðskildir.

Cistanche getur gegn öldrun

2.2.9. Ónæmislitun á EC

EC var fest með 4 prósent (o/v) paraformaldehýði í 15 mínútur við stofuhita. Eftir gegndræpi og lokun í 0.3 prósent (o/o)Triton-X 100 og 3 prósent (o/u) eðlilegt geitasermi í PBS, voru frumur ræktaðar með kanínumótefni gegn AhR(1:100, Abcam, Cambridge, Bretlandi) eða Nrf2 (klón D1Z9C, 1:100, Cell Signaling Technology, Frankfurt, Þýskalandi) þynnt í 1 prósent (o/v) venjulegt geitasermi í PBS yfir nótt við 4 C. Síðan voru frumur þvegnar með PBS og ræktað með Alexa 594-tengdu geita-anti-kanínu IgG (1:500, Invitrogen, Darmstadt, Þýskalandi) í 1 klst við stofuhita.cistanche stilkurFyrir aktínlitun voru frumur ræktaðar með Alexa FluorTM 488 Phalloidin (1:70, Invitrogen, Darmstadt, Þýskalandi) í 20 mínútur við stofuhita. Kjarnar voru mótlitaðir með 0,5 ug/mL DAPI í PBS í 5 mínútur við stofuhita og frumur voru settar upp með ProLong'MDiamond Antifade Mountant (Invitrogen, Darmstadt, Þýskalandi). Flúrljósmyndir voru teknar með Zeiss AxioVision Observer D1 flúrsmásjá, með 400× eða 200× stækkun.

2.2.10. qPCR í frumum

Heildar frumu-RNA var einangrað með því að sameina lýsu í TRIzolTM með niðurstreymisvinnslu með því að nota RNeasy Mini Kit(Qiagen(Hilden, Þýskaland)) samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. cDNA nýmyndun var framkvæmd með því að nota QuantiTect9 öfugt umritunarsett （Qiagen （Hilden, Þýskalandi）） með 1 ug RNA samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. Hlutfallslegt magn afrita var ákvarðað með PCR með því að nota 2x SYBR③ Green qPCR Master Mix og Rotor-Gene Q varma hringrás (Qiagen (Hilden, Þýskaland)). Afritið fyrir ríbósómal próteinið L32 (rpl32) var notað til viðmiðunar og hlutfallsleg tjáning var reiknuð út með AC aðferðinni [68]. Eftirfarandi Intron-spennandi grunnpör voru notuð: höfuðborg (genaaðgangsnúmer NM_000499.5):5'-TCGCTACCTACCCAACCCTT-3',5'-TGTGTCAAACCCAGCTCCAA-3';ahr(gen aðgangsnúmer NM_001621.5):5'-CGTGGGTCAGATGCAGTACA-3',5'ACCAGGGT-CAAAATTGGGCT3';sod2(genaðildarnúmer NM_000636.4):5'-GCCCTGGAACCTCAC ATCAA -3';5'-AGCAACTCCCCTTTGGGTTC-3';rpl32(genaðildarnúmer NM_000994.4):5'-GTGAAGCCCAAGATCGTCAA-3',5'-TTGTTGCACATCAGCAGCAC{{ 41}}'.

2.3.Mýs

2.3.1.Músalínur og ræktun

Kvenkyns 8-12-vikugömul ("ung") og 18-mánaðargömul ("gömul") AHR-skortur B6.129-AHRtmlBra/J (Schmidt o.fl., 1996; vísað til hingað sem AHR-KO) mýs voru ræktaðar sem heterozy-gotes í dýraaðstöðu IUF. Villitegundar ruslfélagar voru notaðir til að stjórna. Mýs voru ræktaðar og hafðar undir sérstökum sjúkdómsvaldandi skilyrðum á 12/12 klst ljós-myrkri lotu og fengu staðlaða chow(ssniff"MZ, SSNIFF, Soest, Þýskaland) eftir frjálsum vilja. 2.3.2.qPCR í músum

Heildar-RNA var einangrað úr líffæravef þriggja WT og þriggja AHR-skorts músa með TriZol[. Síðan voru 400 ng af RNA öfugumrituð með því að nota bakrita M-MLV (Promega, Madison, WI, USA) og handahófskennda hexamer primers. Genatjáning var mæld í tvíriti fyrir hvern músavef á Rotor-Gene Q (Qiagen, Hilden, Þýskalandi), í 15 μL lokarúmmáli, sem innihélt 7,5 μL Rotor Gene SybrGreenTM (Biorad, Feldkirchen, Þýskalandi), 1 uM af hverjum grunni ,1,5 μL cDNA og RNase frítt vatn. Nýtni grunns var á bilinu 90 prósent til 146 prósent. Sjá töflu S2 fyrir grunnraðir og skilvirkni. Tjáningarmagn var kvarðað að tjáningu RPS6 sem heimilisgena í sama sýninu með því að nota {{ 14}}CT aðferð [69].

2.4.Í Silico greiningum

Homology líkan af CeAhR LBD

Byggingarlíkan C. elegans AhR LBD (leifar 267-372) var myndað með samlíkalíkönum. Röntgenuppbygging PASB léna einsleitra bHLH-PAS fjölskyldumeðlima sem deila hæstu raðeinkennum (um 20 prósent) með CeAhR PASB voru notuð sem sniðmát: dægurhreyfingarhringurinn kaput (CLOCK, PDB: 4F3L), taugafrumu PAS léns prótein 3(NPAS3, PDB:5SY7), þættir 20 (HIF2o, PDB:3H82,4ZP4,3F1N) og lo(HIFlo, PDB:4H6J). Líkanið var fengið með MODELLER[70-72].cistanche tubulosa kostir og aukaverkanirBesta líkanið var valið úr hópi þeirra 10 sem mynduðust, byggt á besta DOPE SCORE [73]. Gæði líkananna voru metin með því að nota PROCHECK [74]. Auka mannvirki voru eignuð af DSSPcont [75]. Bindishólfið innan fyrirmyndaðra LBDs var einkennt með því að nota CASTp netþjóninn [76]. Sýning á líkönunum var framkvæmd með því að nota PYMOL[77].

2.5.Tölfræðigreining

Nema annað sé tekið fram voru tölfræðilegar greiningar gerðar í GraphPad Prism (útgáfa 6.01) (GraphPad Software, Inc. San Diego, CA, Bandaríkjunum). Fyrir mælingar á lífs-/heilsutíma var tölfræðileg greining gerð með OASIS[53]. Tölfræðileg greining á örfylkisgögnum var gerð í R (R Foundation (Vín, Austurríki)). Boxplots voru búnar til í GraphPad Prism (útgáfa 6.01) (GraphPad Software, Inc. San Diego, CA, USA) og sýna miðgildi (lína),25-75th percentile (box) og 10-90th percentile (hönd).

3. Úrslit

3.1. Curcumin stuðlar að heilsufari á AhR-háðan og óháðan hátt

Tap á ahr-1 stuðlar að heilsu og líftíma C.elegans við grunnskilyrði[14] og það hefur neikvæð áhrif á aldurstengda eiginleika sem svar við AhR mótara spendýra, eins og bensó[a]pýren (BaP), UVB ljós og örvera [25]. Pólýfenól í fæðu, eins og cur-cumin, mynda mikilvægan hóp spendýra AhR mótara með langlífisáhrif í C. elegans [78,79] og við rannsökuðum því líflengjandi áhrif curcumins fyrir ahr þess-1 ósjálfstæði. Curcumin lengti líf- og heilsutíma C. elegans á æxlunarhæfan og marktækan hátt á ahr-1-háðan hátt (Mynd 1A,B). Áður höfum við sýnt fram á að tap á ahr-1 lengir einnig líftímann í líkönum Huntingtons-sjúkdóms og Parkinsons-sjúkdóms, með vöðvaoftjáningu á fjölglútamíni (polyQ40) og -synúkleíni (-syn), sem hefur tilhneigingu til að safnast saman, í sömu röð, en kl. á sama tíma að auka innihald þeirra af próteinsamsetningum [25]. Athyglisvert er að curcumin meðferð jók fjölda polyQ40 og -syn samanlagða í sama mæli og ahr-7 tap á virkni (Mynd 1C). Curcumin stuðlaði einnig að líftíma og hreyfigetu í þessum sjúkdómslíkönum (Mynd 1DE), en áhrifin af ahr-1 tapi og curcumin viðbót voru aukefni í PolyQbackground (Mynd 1D), sem leiddi í ljós AHR-1-óháða verndarvirkni af curcumin að minnsta kosti í þessum hættulega bakgrunni.

Mynd 1. Curcumin stuðlar að heilsu á AHR-1-háðan og óháðan hátt. Líftíma (A) og heilsutíma (B) ferlar DMSO- eða curcuminmeðhöndlaðra wt og ahr-1 þráðorma. Lifunarferlar sýna samanlögð gögn um 290-300 orma/ástand í 5 tilraunum. Tölfræðipróf: log-rank próf, # marktekt vs. DMSO,* marktekt vs.wt, Bonferronip-gildi<0.05.(c) quantification="" of="" aggregates="" in="" 10-day-old="" polyq;wt="" and="" poly="" air-1="" (left="" panel)="" or="" 7-day-old="" async;wt="" and="" an;ahr-1="" (right="" panel).="" boxplots="" show="" pooled="" data="" from="" 59-111="" worms/conditions="" in="" 3="" experiments.="" statistical="" test:1-way="" anova="" with="" tukey's="" multiple="" comparisons=""><0.05><0.05 vs.dmso.(d,e)life/health="" span="" of="" polyq;wt="" and="" polyq;ahr-1.survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 180="" worms/conditions="" in="" 3="" experiments.="" statistical="" test:="" log-rank="" test,significance="" vs.="" dmso,="" *="" significance="" vs.="" wt,="" bonferroni="" p-value=""><>

3.2.ugt-45 Miðlar öldrunaráhrifum curcumins og ahr-1 eyðingar

Í leit að mögulegum áhrifaþáttum curcumins á eftir-1-straums, tókum við markvissar og óhlutdrægar aðferðir. Við skoðuðum tjáningu klassískra spendýra AhR markgena og lögðum áherslu á Cyp genin þar sem curcumin breytir CyplA1 og CyplB1 tjáningu í spendýrafrumum [80,81]. Hins vegar leiddi magngreining á 47 mismunandi cyps í C.elegans með hálfmagnandi rauntíma PCR (qPCR) í ljós að aðeins cyp-13B1 var marktækt uppstýrt annaðhvort með ahr-1 tæmingu eða curcumin á ahr-1-háðan hátt (Mynd S1A-B), en hinir þrír cyps (þ.e. cyp-13A5, cyp-13A8 og cyp-42A1) voru aukið með curcumini aðeins ef ekki er ahr-1(Mynd S1). Þessi gögn, ásamt öðrum verkum [25,82], benda til þess að cyps séu líklega ekki aðal skotmörk CeAhR. Þetta er einnig stutt af umritunargreiningu okkar á villigerð og ahr-1 stökkbreyttum. Reyndar, í samræmi við hlutverk AHR-1 við ákvörðun taugafrumna [37,38,40,41], sýndu breytingar á genatjáningu milli villigerðar og ahr-1 stökkbreyttra auðgun í ferlum sem tengdust taugaþroska og aðgreining og engar meiriháttar breytingar á klassískum afeitrunargenum (Mynd 2A).qPCR greining á sumum upp- og niðurstýrðu genum milli ahr-1(jul45) og villigerðar (atf-2 , K04H4.2, egl-46, T20F5.4, ptr-4, dyf-7,clec-209, C01B4.6, C01B4.7, F56A4.3)aðallega staðfest ahr-1-háð þeirra við grunnskilyrði (Mynd 2B) en hvorki UVB [25] né curcumin (Mynd 2C) höfðu marktæk áhrif á tjáningu þessara gena. Við veltum því fyrir okkur hvort tjáningarbreytingar í þessum genum séu varðveittar í þróun og metum tjáningu þeirra í mismunandi vefjum (þ.e. heila, lifur, þörmum og blóði) af 8- og 18-mánaðargömlum villigerð og AhR KO mýs. Sum gen sýndu tilhneigingu til aukinnar tjáningar í ungum(atf-2 homolog) eða gömlum(lpr{-4/5 homologs) músum á vefsértækan hátt, en hvorki augljóst mynstur né varðveittar breytingar voru fram (Mynd S2). Þessar niðurstöður endurspegla mögulegan tegundasértækan mun eða vefjaháða AhR umritunarvirkni í spendýrum sem gleymst hefur með umritunargreiningu heildýra í C. elegans. Ítarleg athugun á genum sem tjáðu mest mismun á C. elegans villigerðinni og ahr-1(júl45) leiddi í ljós að tjáning margra þessara gena hefur áhrif á C.elegans við öldrun og af AhR-stýrum spendýra í mataræði ( td quercetin og resveratrol)[25], sem bendir þannig til hlutverks fyrir AHR-1 í fjölfenólstýrðri genatjáningu. Í samræmi við þessa atburðarás sýndu örfylkisgögnin að flest genin sem tjáð voru á mismunandi hátt við curcumin meðferð voru örugglega stjórnað á ahr-1-háðan hátt (Mynd 2D; Tafla 1).cistanche tubulosa þykkniAf 47 genum sem breytt var af curcumini í villigerðinni (43 upp- og 4 niðurstýrð), voru aðeins 5 einnig framkölluð af curcumini í ahr-1(ju145). Meðal gena sem stjórnað var af curcumin á AHR-1-háðan hátt voru fasa Il ensím og athyglisvert var að sum þeirra (ugt-9 og ugt-29) voru stjórnað í sömu átt með curcumin orby tap á ahr-1 (tafla 1). Þannig athuguðum við tjáningu þeirra og annarra ugts(ugt-45 og ugt-57) sem voru gefin á mismunandi hátt þegar minna takmarkandi tölfræðigreining var notuð sem ekki var leiðrétt fyrir margvíslegan samanburð. Af genunum sem skoðuð var jókst ugt-45 í ahr-1(ijul45) og með curcuminmeðferð (Mynd 3A,B). Við sáum einnig breytingar á tjáningu sumra afeitrunargena milli villigerðar og AhR KO mýs á vefjaháðan hátt. Mismunatjáning þessara gena var hæst í heilanum, þar sem Ugt2a3 (ugt-9 og ugt-29 í C.elegans) var niður- og Hpgds (gst-4 í C. elegans) var uppstillt (Mynd S3A). Engin breyting varð á tjáningu neins prófaðra gena í lifrarsýnum músa (Mynd S3B). Í samræmi við C,elegans gögnin sýndi ugt-45 mússamkynhneigð Ugt3a2 tilhneigingu til oftjáningar í þörmum Ahr KO músa (Mynd S3C). Athyglisvert er að ugt-45 RNAi kom í veg fyrir jákvæð áhrif á líf- og heilsulengd sem ýtt var undir curcumin (Mynd 3C,D) eða ahr-1 eyðingu (Mynd 3E,F) sem gefur til kynna að aðgerðirnar tvær gætu reitt sig á sameiginlega mótaðar niðurstreymis merki til að kalla fram öldrunarvirkni þeirra.

Mynd 2. Gen sem eru mismunandi stjórnað af curcumini er fyrst og fremst stjórnað á ahr-1-háðan hátt.(A)Genaverufræði(GO)auðgun fyrir líffræðilega ferla eftir GO hugtakasamruna í ahr-1 vs. (B, C) Tjáning sterkustu niður- og uppstýrðu genanna milli wt og ahr-1 [25]var metin með qPCR í wt vs.ahr-1(B) og DMSO-vs. . curcumin-meðhöndlaðir þráðormar (C). Boxplots sýna gögn úr 3 tilraunum. Tjáningin er sýnd miðað við DMSO-meðhöndlaða wt (stikulína). Tölfræðipróf:1-leið ANOVA með Tukey's margfeldissamanburðarprófi,*p-gildi<0.05 vs.wt.="" (d)venn="" diagram="" of="" differentially="" expressed="" genes="" on="" the="" microarray.="" the="" number="" of="" genes="" that="" were="" differentially="" up-or="" down-regulated="" between="" the="" indicated="" conditions="" is="" shown="" in="" red="" and="" blue,="" respectively.="" the="" numbers="" in="" the="" interchanges="" refer="" to="" the="" genes="" that="" occurred="" in="" both="" comparisons.="" the="" values="" in="" the="" lower="" right="" corner="" show="" the="" number="" of="" genes="" on="" the="" array="" that="" were="" not="" differentially="">

Mynd 3.ugt-45 er nauðsynleg til að lengja líftíma curcumins og ahr-1 stökkbrigði. (A, B) Genatjáning var metin með qPCR í wt vs.ahr-1(A) og DMSO- vs curcumin-meðhöndluðum wt þráðormum (B). Boxplots sýna gögn úr 3 tilraunum. Tjáningin er sýnd miðað við DMSO-meðhöndlaða wt (gefin til kynna sem strikuð lína). Tölfræðipróf: 2-Hæg ANOVA með margfeldissamanburðarprófi Sidak, *p-gildi<0.05vs.wt,><0.05 vs.="" dmso.="" (c,d)effect="" of="" ugt-45="" rnai="" on="" the="" curcumin-mediated="" life/health="" span="" extension="" in="" the="" wt.="" survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 120="" worms/condition="" in="" 2="" replicates.="" statistical="" test:="" log-rank="" test,="" "significance="" vs.="" dmso,*="" significance="" vs.control="" rnai,="" bonferroni=""><0.05.(e,f)effect of="" ugt-45="" rnai="" on="" ahr-1-mediated="" life/healthspan="" extension.="" survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 120="" worms/condition="" in="" 2="" replicates.="" statistical="" test:="" log-rank="" test,#="" significance="" vs.="" wt,*="" significance="" vs.="" control="" rnai,="" bonferroni=""><>

3.3. AHR-1 og curcumin vernda sjálfstætt gegn oxunarálagi

Gagnlegir eiginleikar pólýfenóla eru oft raknir til getu þeirra til að vernda gegn hvarfgefnum súrefnistegundum (ROS)|83,84]. Þar sem AhR tekur þátt í oxunarálagsmiðluðum ferlum [85-87], veltum við því fyrir okkur hvort curcumin gæti haft áhrif á lífeðlisfræði dýra með AhR-stýrðum andoxunarsvörun. Við sáum að ahr-1 stökkbrigði framleiða meira hvatbera(mt)ROS og hafa minni hvatberahimnugetu (Mynd 4A,B), tvær breytur sem tengjast langlífi [88,89]. Þó að það sé í samræmi við mítóhormesis hugmyndafræðina ahr-1(jul45) framleiði aðeins meira mtROS og lifði lengur, voru þessi dýr næmari fyrir oxunarálagi en villigerðin. Nánar tiltekið voru skaðleg áhrif af völdum juglone og H2O2 á stökk dýrin, hreyfigetu og lifun marktækt sterkari í ahr-1(jul45) samanborið við villigerðina (Mynd 4C-F). Þessi gögn benda til þess að AHR-1 eyðing hafi jákvæð hreyfiáhrif við grunnskilyrði, á meðan nærvera þess er nauðsynleg til að vernda oxunarálag, þannig að tveir breytur sem oft tengjast aldurstengdum breytum, þ.e. líftíma og streituþol. Þess í stað bætti curcumin verulega H,O og juglone viðnám í bæði villigerð og ahr-1 stökkbreyttum (Mynd 4E,F), sem bendir til þess að curcumin veki fram ahr-1-óháð andoxunarsvörun. Í samræmi við ótengda stjórnun á líftíma og oxunarálagsþol, hafði ugt-45 þögn ekki áhrif á næmi fyrir oxunarálagi hvorki fyrir ahr-1 stökkbrigði eða curcumin-meðhöndluð dýr (Mynd 4G).cistanche tubulosa umsagnirÞannig hefur curcumin langlífisáhrif í gegnum ahr-1 og ugt-45, en verndar gegn oxunarálagi með ahr-1-óháðum aðferðum.

3.4. Nrf2/SKN-1 miðlar AhR-óháðum áhrifum curcumins

Til að meta frekar AhR-curcumin víxltölu í viðbótar aldurstengdum eiginleikum, mældum við flutningsgetu í aðal EC manna - aðalsmerki fyrir virkni skipa, sem minnkar með aldri [90] og minnkar með AhR virkjun [14]. Í samræmi við öldrunarvirkni ahr-1 bælingar og curcumins, var AhR oftjáning verulega hindruð, en curcumin jókst, flutningsgetu aðal EC manna (Mynd 5A). Athygli vekur að framkalla flutningsgetu með curcumini var sambærileg í tómum vektor- eða AhR tjáningarferju-transfected frumum (Mynd 5A). Hins vegar minnkaði flutningur curcumin-meðhöndlaðra frumna marktækt vegna AhR oftjáningar: curcumin framkallar í tómum vektor-transfected frumum allt að 60 fluttar frumur á hvert aflsviði, en í AhR oftjáandi frumum aðeins allt að 25 frumum á hvert stóraflssvið (Mynd 5A). Þessar upplýsingar benda til þess að hreyfingaráhrif curcumins sé mótuð af AhR-óháðum aðferðum en hugsanlega einnig með minnkun á AhR virkni. Næst ákváðum við AhR dreifingu innan frumu og tjáningu cVplal í curcumin-meðhöndlaðri EC, Curcumin hafði ekki áhrif á AhR-kjarnaflutning (Mynd 5B) eða cyplal tjáningu (Mynd 5C). Í leit að leiðum sem mótaðar eru af curcumini á AhR-óháðan hátt, snerum við okkur aftur að umritunarsniðum þráðorma til að finna umritunarþætti sem stjórna genum sem stýrast verulega af tapi á ahr-1 eða með curcuminmeðferð í villtum dýrum (tafla 1) ). Þetta í kísilleit leiddi í ljós redox umritunarþáttinn SKN-1, réttstöðufræði nrf2 manna (kjarnastuðli rauðkorna 2-tengdur þáttur 2), en oft er greint frá því að virkjun hans með curcumini [91] sé mögulegur miðlari andoxunarvirkni þess [92,93]. Í samræmi við það er frumgerð C.elegans Nrf2/SKN-1-háð gen, gst-4, oftjáð í alhr-1 stökkbrigðinu [25] og framkallað af curcumin í villigerð og jafnvel fleiru í ahr-1 stökkbreyttum (Mynd 5D). Þar að auki jók curcumin stöðugleika og kjarnaflutning á Nrf2 í frumum EC (Mynd 5E) og framkallaði tjáningu mangansúperoxíð dismutasa (Sod2) - klassískt Nrf2 markgen - í frumunum sem voru umbreyttar með tómri vektor eða í frumum þar sem AhR er þaggað niður af shRNA (Mynd 5F). Skortur á Sod2 örvun með AhR shRNA í EC gæti verið vegna minnkunar að hluta (50 prósent) á tjáningu (Mynd S3D), sem gæti ekki verið nægileg til að koma af stað virkjun Nrf2 eða viðbótar umritunarþáttar (TF), sem , í C.elegans, gæti fallist á framköllun gst-4 [94]við algjöra AhR-tæmingu. Athyglisvert er að Hpgds, homolog C.elegans gst-4, jókst marktækt í heila AhR KO músa (Mynd S3A) en það er ekki skotmark Nrf2. Frekari vísbendingar um mögulega Nrf2/SKN-1 óháða merkjasendingu virkjuð með ahr-1 eyðingu eru að virkjun gst-4 með curcumini er algjörlega bæld af húð-7 RNAi í C.elegans villigerð, en ahr-1 stökkbrigði framkalla enn gst-4 þrátt fyrir húð-1 eyðingu (Mynd 5G, H). Hins vegar minnkaði húð-1 RNAi oxunarálagsþol bæði í villigerð og ahr-1(ju145)(Mynd 5I). Óvænt hafði þögn í húð-1 ekki áhrif á júglónþol dýra sem fengu curcumin (Mynd 5I). Gögnin okkar sýna flókna atburðarás þar sem curcumin stuðlar að mismunandi öldrunareiginleikum sem treysta annað hvort á AhR-háð eða AhR-óháð en Nrf2/SKN-1-háð (og viðbótar) merkjagjöf.

Mynd 4. AHR-1 og curcumin vernda sjálfstætt gegn oxunarálagi. (A) Fulltrúarmyndir (vinstri) og DSRed styrkleiki (hægri) í MitoSOX-lituðum wt eða ahr-1 þráðormum. Boxplots sýna samanlögð gögn frá 129-135 ormum/aðstæðum í 3 tilraunum. (B) Möguleiki hvatberahimnu var metinn með TRME litun í þráðormum á tilgreindum aldri. Sýndar myndir (til vinstri) og magngreiningu á TMRE flúrljómun (hægri) eru sýndar. Boxplots sýna samanlögð gögn úr 3 tilraunum.(C,D) Kokdæluvirkni(C) og hreyfanleiki(D) wt og ahr-1 stökkbreyttra eftir H2O2 meðferð. Boxplots sýna samanlögð gögn frá 39-54(C)eða 35-36 ormum/ástandi (D) í 3-4tilraunum.*p-gildi<0.05 vs.wt,$=""><0.05 vs.control="" treatment,="" statistical="" test:="" 1-way="" anova="" with="" tukey's="" multiple="" comparisons="" test.="" (e)pharyngeal="" pumping="" of="" curcumin-treated="" nematodes="" after="" h,="" o,="" treatment.="" boxplots="" show="" pooled="" data="" from="" 32="" worms/conditions="" in="" 2experiments.="" *=""><0.05><0.05cur vs.="" dmso="" treatment,="" $=""><0.05 h2o2="" vs.="" control="" statistical="" test:2-way="" anova="" with="" tukey's="" multiple="" comparisons="" test.(f)influence="" of="" curcumin="" on="" juglone-induced="" toxicity.="" survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 500="" worms/condition="" in="" 20="" experiments.="" *significance="" alhr-1="" vs.wt,#significance="" curcumin="" vs.dmso,="" bonferroni=""><0.05.(g) effect="" of="" ugt-45="" rnai="" in="" curcumin-fed="" wt="" and="" ahr-1="" worms.="" survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 150="" worms/condition="" in="" 6experiments.="" statistical="" test:="" log-rank="" test,="" *="" significance="" ahr-1="" vs.="" wt,#significance="" curcumin="" vs.dmso,="" bonferroni=""><0.05. no="" statistical="" significance="" was="" observed="" in="" ugt-45="" vs.="" control="" rnai-treated="">

Mynd 5. Curcumin virkjar Nrf2/SKN-1 óháð AhR.(A) Klórsársprófun í curcumin (cur)- eða DMSO-meðhöndluðum aðal-EC úr mönnum sem er transsýkt með tómri vektor (EV) eða tjáningarferju fyrir mannlegur AhR. Efri spjaldið: dæmigerðar myndir; strikalínan táknar upphaf flutnings. Mælikvarði: 100 um. Neðri spjaldið: magngreining; kassarit sýna gögn um 4-6tilraunir. Tölfræðipróf:1-leið ANOVA,*p<0.05><0.05 ys.dmso.(b,c)human="" primary="" ec="" were="" treated="" with="" cur="" or="" dmso.="" (b)representative="" immunostainings:="" ahr="" is="" stained="" in="" red,="" nuclei="" were="" visualized="" with="" dapi="" (blue),="" the="" cytoskeleton="" is="" counterstained="" with="" phalloidin="" (green),="" merge="" shows="" an="" overlay="" of="" all="" fluorescence="" channels.="" in="" the="" negative="" control="" (-con),="" the="" first="" antibody="" was="" omitted,="" and="" cells="" were="" stained="" with="" alexa="" 488-coupled="" phalloidin="" and="" dapi.scale="" bar:50="" um.(c)="" relative="" capital="" expression="" was="" assessed="" by="" qpcr.="" mean="" expression="" in="" the="" dmso-treated="" controls="" was="" set="" to="" 1.="" boxplots="" show="" data="" from="" 7="" experiments.="" (d)pgst-4:gfp="" expression="" in="" dmso-and="" curcumin-treated="" (cur)wt="" and="" alr-1="" worms.="" boxplots="" show="" pooled="" data="" of="" 118-138="" worms/conditions="" in4=""><0.05><0.05 vs.="" dmso="" treatment,="" statistical="" test:1-way="" anova.(e)representative="" immunostaining="" images="" of="" human="" primary="" ec="" treated="" with="" cur="" or="" dmso:="" nrf2="" is="" stained="" in="" red,="" nuclei="" were="" visualized="" with="" dapi="" (blue),="" the="" cytoskeleton="" is="" counterstained="" with="" phalloidin(green),="" merge="" shows="" an="" overlay="" of="" all="" fluorescence="" channels.="" in="" the="" negative="" control(-="" con)="" the="" first="" antibody="" was="" omitted,="" and="" cells="" were="" stained="" with="" alexa="" 488-coupled="" phalloidin="" and="" dapi.="" scale="" bar:="" 50="" um.(f)="" human="" primary="" ec="" was="" transfected="" with="" an="" empty="" vector(ev)or="" an="" expression="" vector="" for="" an="" shrna="" targeting="" the="" human="" ahr="" transcript="" (shahr).="" relative="" sod2="" expression="" was="" assessed="" by="" qpcr,="" and="" mean="" expression="" in="" the="" ev="" transfected="" cells="" was="" set="" to="" 1.="" boxplots="" show="" data="" of="" 7experiments.=""><0.05 vs.="" respective="" control.="" (g,h)="" post-4:gfp="" expression="" in="" dmso-or="" cur-treated="" wt="" and="" ahr-1="" nematodes="" subjected="" to="" control="" or="" skin-1="" rnai.="" representative="" images(g)="" and="" gst-4-driven="" gfp="" quantification(h)="" are="" shown.="" boxplots="" show="" pooled="" data="" of="" 103-189="" worms/conditions="" in="" 4="" experiments.="" (i)="" juglone="" stress="" survival="" in="" curcumin-="" or="" dmso-treated="" wt="" and="" alhr-1="" nematodes="" subjected="" to="" control="" or="" skn-1="" rnai.="" kaplan="" meier="" survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 100="" worms/condition="" in="" 4="" experiments.="" statistical="" test:="" log-rank="" test,="" *="" significance="" ahr-1="" vs.="" wt,="" #significance="" curcumin="" vs.="" dmso,="" $="" significance="" skn-1="" vs.="" con="" rnai,="" bonferroni="" p-value=""><>

3.5. Curcumin og Pro-oxidants sýna gagnstæð áhrif á AHR-1 virkni

Í samræmi við öldrunaráhrif minnkaðrar AhRexpression/virkni benda gögn okkar til þess að curcumin geti lengt líftíma C.elegans með því að bæla AHR-1-stýrðar leiðir með því að draga úr AHR-1 tjáningu/virkni eða virkni á algengum merkjaleiðum neðanstreymis. Þess vegna reyndum við að mæla AHR-1 virkni í C.elegans, en fjölmargar tilraunir til að meta AHR-1 tjáningu og undirfrumustaðsetningu með því að nota mótefni (gegn spendýra AhR eða sérsniðnum mótefnum gegn CeAhR) eða flúrljómandi merkingu fréttamenn (OP562, UL1709, ZG93) gáfu ekki marktækar sannanir. Í ljósi þess að AHR-1 binst XRE in vitro [35], töldum við nota XRE-drifna genatjáningu sem útlestur fyrir AHR-1 virkni. Þannig snerum við okkur að Cos7 frumum sem eru fengnar úr apa, sem tjá ekki innræna AhR og sýna því enga innræna AhR virkni [95,96] og hægt er að nýta þær til að fylgjast með XRE-drifinni lúsíferasa örvun sem útlestur fyrir AHR-1 starfsemi (Larigot o.fl.; lögð fram ásamt þessari rannsókn). Þegar Cos7 frumur voru samsmitaðar með vektorum sem tjá C.elegans AhR/alr-1, ARNT/aha-1 og lúsiferasa-tengdan XRE-hvata CYPIA1 gensins [64] AHR{ {27}} sýndi litla virkni við grunnskilyrði (meðhöndluð í farartæki). Athygli vekur að meðferð með curcumini eða öðrum næringarefnum sem stuðla að heilbrigðri öldrun hjá C.elegans, eins og lútín [97] og resveratrol [98,99], bældu verulega AHR-1 virkni (Mynd 6A-C). Þess í stað höfðu BaP og leflúnómíð, þekktir AhR virkjar í spendýrum, ekki áhrif á AHR-1 virkni (Mynd 6A,B) við þann styrk sem við notuðum. Sérstaklega var AHR-1 virkni afnumin í Cos7 frumum sem voru færðar með vektor sem tjáir ahr-1(jul45) samsætuna í stað villigerðarsamsætunnar (Mynd 6A-C), sem bendir til þess að jul45 sé satt samsætu með tapi á virkni og að mældur lúsiferasastyrkur stafar af virkni AHR-1.

Við leituðumst síðan að kanna hvort curcumin dragi úr virkni AHR-1 með beinni bindingu eða óbeinni mótun. Hingað til hafa engir bindlar af C.elegans AHR-1 verið auðkenndir og þar sem engar tiltækar upplýsingar eru til um LBD þess gerðum við kísilgreiningu til að einkenna það. AHR-1 ísóformin tvö, la og 1b, voru samræmd og þó mismunandi að lengd er PASB lénsröð þeirra eins. Þessi röð var síðan samræmd við PASB lén Drosophila melanogaster, og við þau af tveimur AhR frá hryggdýrum sem áður voru mynduð byggingarlíkön fyrir, nefnilega mús (Mus musculus)[100], og sebrafiskur (Danio rerio)[101](Mynd 6D). Jöfnunin sýndi skýran mun á milli tegunda þar sem það helsta sérkenni hryggleysingjanna sem sýndu úrfellingar á röð á breytilegasta svæðinu í PAS léninu, sem samsvarar sveigjanlega svæðinu, þ. þessir þættir (Mynd 6D,E). Þessar útfellingar gætu dregið úr tiltæku plássi í bindingarholi þessara AhRs. Við bjuggum síðan til þrívíddarlíkan af AHR-1 PASB með homology líkani. Þetta líkan sýnir dæmigerða PAS-fellingu, en með styttri Do helix samanborið við aðrar AhRs. Hins vegar hefur innra holrúmið nokkra sérkenni; það inniheldur fleiri vatnsfælin leifar og er stytt í tvennt af einhverjum innri hliðarkeðjum. Sérstaklega eru H365 og H274 andlit og gætu myndað vetnistengi í miðju holrýminu; þar að auki gætu Y332, L363 og L302 hliðarkeðjurnar hindrað holrúmið og minnkað innra rýmið sem er tiltækt fyrir bindla (Mynd 6E). Þetta litla og stytta hol leyfir líklega ekki bindingu stórra bindla (td TCDDor curcumin). Líkt og AHR-1 burðarlíkanið sýndi líkan af sebrafiskinum zfAhRla að LBD hola er stytt samanborið við TCDD-bindandi hliðstæðurnar zfAhR1b og zfAhR2 [101]. Litlir og sveigjanlegir bindlar, eins og leflúnómíð, bindast og virkja zfAhRla, en styrkur leflúnómíðs sem við prófuðum virkjaði ekki AHR-1 í Cos7 frumukerfinu okkar (mynd 6B). Við veltum því fyrir okkur hvort stökkbreytingar í amínósýrum sem bera ábyrgð á litlu holi LBD gætu gert klassískum bindlum kleift að virkja CeAhR. CeAhR L363 leifin (Mynd 6D) samsvarar A375 í mAhRb-I og V375 í Madríd, og þessi leifar hefur mikil áhrif á bindilbindingu [102]. Á sama hátt stuðlar T386 af zfAhRla (Mynd 6D), sem passar við A375 í mAhRb-1 og A386 í zfAhR1b og zfAhR2, til skorts á TCDD bindingu zfAhRla og, þegar stökkbreytt er í alanín, endurheimtir næmið einnig þegar YTC29 kynnt [101]. Amínósýran Y296 er þegar histidín í C.elegans(H274). Þannig stökkbreyttum við aðeins leusíninu í stöðu L363 í CeAhR vektornum í alanín (L363A) (Mynd 6D,E auðkennd með ör). Ennfremur stökkbreyttum við nærliggjandi histidíni í stöðu H365 í glútamín (H365Q), sem er Q377 í músum (Mynd 6D, E auðkennd með ör) þar sem það myndar líklega vetnistengi við H274 og gæti stuðlað að litlu holi AHR{ {49}} (Mynd 6E). Við prófuðum síðan hvort spendýra AhR bindlar hafa áhrif á AHR-1 virkni þegar L363 og H365 eru stökkbreytt. Hins vegar, þessar breytingar, í stað þess að endurheimta svörun við útlendingabundnum bindlum eins og í sebrafiskum [101], afnámu jafnvel grunnvirkni AHR-1, svipað og ju145 samsætunni (Mynd 6F). Þessar niðurstöður sýna skýran mun á LBDs C.elegans og sebrafiska en sýna að LBD er grundvallaratriði fyrir basal AHR-1 virkni. Ásamt fyrri rannsóknum [35,38,82] benda niðurstöður okkar til þess að ólíklegt sé að AHR-1 eigi þátt í klassískri útlendingafræðilegri umvirkjunarsvörun, sem gæti því ekki átt við um ahr-1-stjórnun lífeðlisfræðileg öldrun. Þess í stað gætu plöntuafleidd efnasambönd haft varðveitt áhrif að minnsta kosti að hluta með bælingu AHR-1-mótaðra ferla. 3D líkanið okkar bendir til þess að curcumin breyti ekki AHR-1 virkni með því að binda LBD þess. Þannig gæti bæling á AHR-1 virkni með curcumin verið vegna andoxunaráhrifa þess. Í samræmi við þennan möguleika og aukið næmni C.elegans ahr-1 stökkbreyttra fyrir oxunarálag, komumst við að því að AHR-1 virkni er örugglega aukin með ROS-örvandi efnum. Nefnilega, Cos7 frumur sem voru meðhöndlaðar með foroxunarefninu rótenóni sýndu aukna AhR virkni þegar þær voru transsmitaðar með annaðhvort C.elegans eða músa AhR en ekki þegar þær voru umbreyttar með jul45 samsætunni eða samsætunni með LBD stökkbreytingum (Mynd 6G,H).

Á heildina litið, á meðan CeAhR virkjun verndar gegn oxunarálagi snemma á ævinni, vinnur minnkuð tjáning þess gegn öldrun og miðlar jákvæðum öldrunaráhrifum curcumins (Mynd 7). Curcumin getur þannig hjálpað til við að koma jafnvægi á redox TF virkjun á samhengis- og tímaháðan hátt og stuðlað að AhR bælingu beint með andoxunaráhrifum þess og/eða með virkjun Nrf2/SKN-1 (eða annars TF), sem getur samtímis miðla öldrunarvirkni curcumins.

Mynd 6. Curcumin og pro-oxunarefni hafa gagnstæð áhrif á AHR-1 virkni. (AC) Mat á AHR-1 virkni eftir meðferð með tilgreindum efnasamböndum í Cos7 frumum sem eru transsmitaðar með annað hvort wt AHR-1(wt) eða AHR-1 sem bera ju145 punkta stökkbreytinguna (ju145) og AHA-1 auk XRE-framkallanlegs lúsiferasa. Boxplots sýna gögn um 3-5tilraunir.* p-gildi<0.05><0.05 vs.="" dmso/etoh,="" statistical="" test:="" 2-way="" anova="" and="" tukey's="" multiple="" comparisons="" test.="" (d)="" alignment="" of="" the="" lbds="" from="" c.elegans,="" drosophila,="" and="" zebrafish="" ahrs.="" the="" color="" scheme="" for="" residues:="" red,="" acidic;="" blue,="" basic;="" purple,="" polar;="" yellow,="" cys;="" brown,="" aromatic;="" green,="" hydrophobic;="" orange,="" ser,="" thr;="" gray,="" pro;="" white,="" gly.="" (e)="" secondary="" structures="" attributed="" by="" dsspcont="" to="" the="" ceahr="" pasb="" are="" indicated="" on="" top(light="" gray="" bars="" for="" helices="" and="" dark="" gray="" bars="" for="" β-strands)="" and="" labeled="" according="" to="" the="" pas="" domain="" nomenclature.="" asterisks="" mark="" the="" amino="" acids="" likely="" contributing="" to="" the="" inability="" of="" ceahr="" to="" bind="" big="" ligands.="" amino="" acids="" highlighted="" by="" an="" arrow="" were="" mutated="" for="" the="" investigation="" of="" the="" lbd="" function="" (panels="" f,="" h).i3dmodels="" of="" the="" ceahr="" (left)="" and="" the="" mahr="" (right)="" pasb="" domains="" were="" obtained="" by="" homology="" modeling,="" shown="" in="" a="" cartoon="" representation.="" secondary="" structures="" attributed="" by="" dsspcont="" are="" labeled="" according="" to="" the="" pas="" domain="" nomenclature.="" the="" colored="" internal="" area="" (blue="" for="" ceahr="" and="" yellow="" for="" mahr)defines="" the="" molecular="" surface="" of="" the="" binding="" cavity="" identified="" by="" castp.="" in="" the="" car="" model,="" the="" amino="" acids="" protruding="" into="" the="" binding="" cavity="" (asterisks="" in="" panel="" d)="" are="" labeled="" and="" shown="" as="" blue="" sticks.="" the="" mahr="" amino="" acids="" corresponding="" to="" those="" displayed="" in="" the="" ceahr="" model,="" are="" labeled="" and="" shown="" as="" yellow="" sticks.="" amino="" acids="" highlighted="" by="" an="" arrow="" were="" mutated="" for="" studying="" the="" lbd="" function="" (panels="" f,="" h).="" (f)="" ahr="" activity="" in="" bap-or="" mnf-treated="" cos7="" cells="" transfected="" with="" either="" ahr-1,="" an="" ahr-1="" with="" l363a="" and="" h365o="" mutations="" (lbd="" mutant),="" or="" mouse="" ahr(mahr),="" as="" well="" as="" aha-1="" and="" an="" xre-driven="" luciferase.="" boxplots="" show="" data="" from="" 3experiments.="" statistical="" analysis:2-way="" anova="" and="" tukey's="" multiple="" comparisons=""><0.05 vs.wt,"=""><0.05 vs.dmso.(g)effect="" of="" rotenone="" on="" ahr="" activity="" in="" cos7="" cells="" transfected="" with="" ahr-1(either="" wt="" or="" ju145)="" as="" well="" as="" aha-1="" and="" an="" xre-driven="" luciferase.="" boxplots="" show="" data="" from="" 3="" experiments.="" statistical="" analysis:2-way="" anova="" and="" tukey's="" multiple="" comparisons="" test.*=""><0.05vs.wt, #=""><0.05 vs.="" dmso.(h)effect="" of="" rotenone="" on="" ahr="" activity="" in="" cos7="" cells="" transfected="" with="" either="" ahr-1,="" ahr-1="" with="" l363a="" and="" h365q="" mutations(lbd="" mutant),="" or="" mouse="" ahr(mahr).boxplots="" show="" data="" from="" 3="" experiments.="" statistical="" analysis:2-way="" anova="" with="" tukey's="" multiple="" comparisons=""><0.05 vs.wt/ahr-1,="" #="" p-value=""><0.05 vs.="">

Mynd 7. Fyrirhugað líkan af AHR-1 merkjaleiðinni í svörun C.elegan við andoxunarefnum og andoxunarefnum. Við "eðlilegar" aðstæður (miðborð) er AHR-1 virkjað af innanfrumu ROS. Þetta leiðir til losunar fylgjenda frá umfrymi AHR-1 og síðari kjarnaflutnings AHR-1. Í kjarnanum myndar AHR-1 heterodimer með AHR kjarnaflutningstækinu (AHA{ {7}}) og binst XRE markgena, sem aftur leiðir til lækkunar á innanfrumu ROS stigum. Við þessar aðstæður leiðir tap á ahr-1 virkni til lengri líftíma. Í nærveru andoxunarefna (vinstra spjaldið) er innanfrumu ROS styrkur lágur sem leiðir til þess að AHR-1 er í umfrymi, bundið af meðþáttum þess. Hömlun á grunnvirkni AHR-1 leiðir til lengri líftíma. Í nærveru foroxunarefna (hægra spjald) er AHR-1 virkjuð með of mikilli ROS, sem leiðir til kjarnaflutnings þess, AHR-1-AHA-1 heterodimer myndun, og upphaf markgena umritun. Í ahr-1 KO leiðir minni afeitrun ROS í gegnum AHR-1-framkallað markgen til uppsöfnunar á ROS og gerir ahr-1 KO næmt.

4. Umræður

AhR var upphaflega uppgötvað í spendýrum vegna útlendingafræðilegrar viðbragðsvirkni þess sem framkallað er við bindingu umhverfis eiturefna eða innrænna bindla, en mótunartæki sem ekki treysta á bindilbindingu eru einnig til en eru mun minna rannsökuð. C.elegans táknar einstaka líkan lífveru til að rannsaka AhR starfsemi óháð klassískum útlendingaviðbrögðum þar sem CeAhR binst ekki frumgerð AhR bindla [35,39]. Með því að nota þetta líkan greindum við þróunarlega varðveitt hlutverk fyrir AhR í öldrunarferlinu [14] og sýndum að sumir af AhR mótum spendýra (þ.e. bakteríur, Bal og UVB) hafa áhrif á öldrunarbreytur í gegnum AHR-1 í samhengisháður háttur [25]. Hér fylgdum við eftir fyrri niðurstöðum okkar með vélrænni rannsókn á AhR-stýrðum öldrunareiginleikum milli tegunda með pólýfenóli curcumin í fæðunni. Samanlögð in vivo, in vitro og kísilgreining okkar leiddi í ljós nýja og flókna atburðarás: á meðan curcumin ýtir undir öldrunareiginleika í þráðormum og aðal EC manna að minnsta kosti að hluta á AhR-háðan hátt, byggjast andoxunaráhrif þess í báðum tegundum á. á AhR-óháðum en fyrst og fremst Nrf2/SKN-1 háðum aðferðum.

Við sýndum í fyrsta skipti að curcumin seinkaði lífeðlisfræðilegri öldrun C.elegans á AHR-1-háðan hátt. Í leit að mögulegum áhrifaþáttum curcumins sem eru háðir niðurstreymi-1-, notuðum við markvissar og óhlutdrægar aðferðir og komumst að því að meirihluti mismunandi gena við curcumin meðferð er stjórnað á AHR-1-háðan hátt. Þar að auki sýndu mörg þessara gena svipað tjáningarmynstur í AHR-1-þurrt og curcumin-meðhöndluðum dýrum, sem bendir til þess að curcumin stuðli að líftímalengingu með bælingu AHR-1 virkni. Það kemur á óvart að hvorki markvissa né umritagreiningin benti til mikilvægs hlutverks fyrir klassískar AhR markhópar eins og bollar, sem í staðinn reyndust að mestu leyti vera vantjáðar í taugafrumum (Larigot o.fl.; lögð fram ásamt þessari rannsókn). Athyglisvert er að þessar niðurstöður gætu bent til þess að umritanir á heilum dýrum geti dulið taugasértæk áhrif AhR, í þessu sérstaka tilviki í gegnum cps gen. Við komumst að því að meðal gena sem tjáð eru á mismunandi hátt tilheyra mörg fasa-II afeitrunarensímum, eins og þörmum-45, sem jókst bæði vegna ahr-1 eyðingar (og í heila AhR KO músa) og curcumin meðferð til að miðla líftíma þeirra. Þess í stað jók curcumin meðferð og ahr-1 eyðing tjáningu annars fasa-II-afeitrunarensíms, GST-4, með mismunandi aðferðum: hið fyrra byggir á, en hið síðarnefnda er aðallega óháð, Nrf2/ SKN-1, klassískt redox TF sem veldur GST-4 við oxunarálag í C.elegans [103]. Þar að auki, þó að curcumin framkalli Nrf2/SKN-1-háð svörun í C.elegans (GST-4 tjáningu) og aðal EC (Sod2 tjáningu og flutningsgetu) verndar það C.eleans gegn oxunarálagi í SKN-1-óháðan hátt. Í C.elegans getur curcumin ekki lengt líftíma í mjög veikri húð-1(zu67) stökkbreyttum [104], á meðan GST-4 er hægt að framkalla á SKN-1-óháðan hátt með EGF merkjum [94] og greint var frá víxlun milli EGF ferilsins og AhR í spendýrum [105].

Athyglisvert er, og öfugt við villigerða stofninn, sáum við AHR-1-óháð áhrif curcumins á heilsufar í þráðormalíkönum fyrir Huntingtons og Parkinsonsveiki, í sömu röð. Í þessum stofnum jók meðferð með curcumin fjölda próteinasafna að sama marki og AHR-1 skortur, sem gefur til kynna annað hvort verndandi áhrif próteinsamrunans sjálfrar og/eða curcumin virkjun ferla sem vernda gegn próteinsamruni óháð a/ hr-1 eyðing. Áhrif curcumins á próteinsamruna eru umdeild: sýnt hefur verið fram á að það hamlar myndun fibril en einnig að binda pre-fibrillar / oligomeric tegundir amyloidogenic próteina, þar með flýta fyrir samsöfnun þeirra og draga úr heildar taugaeiturhrifum [106]. Athyglisvert er að koffín, sem einnig verndar gegn einkennum öldrunar hjarta- og æðakerfis [66.107], kemur einnig í veg fyrir A-framkallaða lömun án þess að minnka A-samstæður en með því að virkja verndandi Nrf2/SKN-1-háða feril [108]. Mikilvægt verður að meta hvort verndaráhrifin af völdum curcumins eða allrar-1 eyðingar í C.elegans sjúkdómslíkönunum sé miðlað af aðferðum sem stuðla að því að fá óligómerískar/for-fibrillar tegundir séu fjarlægðar í minna eitrað efni og/eða með virkjun annarra aðferða, eins og Nrf2/SKN-1, sem gæti samhliða verndað gegn eiturverkunum á prótein. Athygli vekur að afeitrunarensím geta innihaldið bæði XRE og ARE (andoxunarefni sem bregðast við) og samspili milli Nrf2/ARE og AhR/XRE stýrðra merkja hefur verið lýst [109]. Það verður því áhugavert að skýra hvernig curcumin stuðlar að mismunandi jákvæðum áhrifum gegn öldrun í gegnum jafnvægið milli Nrf2 og AhR-stýrðra merkja.

Samsettar aðferðir okkar sýndu að curcumin hamlar AHR-1 virkni. Hjá spendýrum var lagt til að AhR hamlandi áhrif curcumins sé miðlað af beinni LBD bindingu [110] eða hömlun á prótein kínasa C sem fosfórar AhR [79]. Önnur rannsókn gaf til kynna að umritunarvirkni AhR er háð afoxunarstöðu frumna og litningabyggingu, sem bæði eru undir áhrifum af curcumin [111]. Þó að AHR-1 bindist ekki TCDD, binst það XRE in vitro[36] en kerfisbundnar rannsóknir, sem fjalla um möguleika fjölarómatískra kolvetna, eða annarra spendýra AhR bindla til að móta AHR-1, vantar fyrst og fremst vegna skortur á viðeigandi verkfærum til að meta það. Rannsóknir okkar reyna að fylla þetta skarð og nýta Cos7 frumur sem tjá AHR-1 ásamt lúsiferasaprófum (Larigot o.fl.; lögð fram ásamt þessari rannsókn) og í kísillíkönum af C. elegans LBD, leiddi í ljós að curcumin bælir AHR -1 virkni, en líklega ekki með beinni LBD-bindingu. In vitro prófið sem notað var í rannsókn okkar staðfesti að CeAhR er ekki virkjað með klassískum útlendingaboðum. Samt myndi það ekki sýna starfsemi vegna AhR bindingar við DNA raðir aðrar en "klassíska" XRE sem finnast í CYP1A1 eins og polyphenol (quercetin)-svarandi XRE sem finnast í PON1 [112,113]. Ónæmislitun í aðal EC manna heldur einnig því fram að curcumin veldur AhR kjarnaflutningi, sem, ásamt hvetjandi áhrifum flutningsgetu í AhR oftjáandi frumum, gæti einnig bent til þess að curcumin bæli AhR virkni.

Við leggjum til að hamlandi áhrif curcumins, frekar en að treysta á AhR-bindingu, feli í sér andoxunargetu þess, sem gæti örugglega tengst, eða jafnvel háð, virkjun Nrf2/SKN-1. Spendýra AhR er virkjað af ROS með LBD-óháðri oxunarbreytingu [85], en gögn okkar sýna að framköllun AHR-1 virkni með foroxunarefninu rótenóni krefst LBD. Óbeinn fyrirkomulag ROS-miðlaðrar AhR virkjunar er myndun öfluga AhR bindilsins FICZ [114]. Samt er FICZ stór plan sameind sem, samkvæmt in silico líkaninu okkar, myndi ekki passa við AHR-1 LBD. Þó að enn eigi eftir að staðfesta nákvæmlega hvernig AHR-1 virkni er ýtt undir af ROS og hindrað af curcumin (annaðhvort með beinni ROS quenching eða óbeint með virkjun Nrf2 eða annarra andoxunargena) er þetta mjög stutt af okkar niðurstöður: AHR-1 er virkjað af rótenóni og ahr-1 stökkbrigði sýna meira mtROS, minnkaða hvatberahimnugetu og eru næmari fyrir H, O og juglone sem og UVB og BaP [25] , sem bæði framleiða ROS[115,116]. Í þessu samhengi er áhugavert að hafa í huga að ahr-1 stökkbrigði sýna væga breytingu á starfsemi hvatbera, sem líkjast virkni hvatbera [117. Þetta bendir til þess að öll-1 eyðing (og möguleg kúrkúmín með því að hindra AHR-1) geti stuðlað að heilsufari með vægri hvatbera streitu, sem vitað er að lengja líftíma C.elegan með afeitrunargenum sem breytast á svipaðan hátt í hinum{ {20}} stökkbrigði [118,119]. Þar að auki, hvort Nrf2/SKN-1 og hvatberar gegni hlutverki við að móta AHR-1 virkni við curcumin meðferð er áhugaverður möguleiki sem enn á eftir að sannreyna.

Þegar á heildina er litið, með því að nýta þá fjölmörgu eiginleika sem þráðormurinn C.elegans býður upp á fyrir in vivo rannsóknir, leggjum við til að forfeðrastarfsemi AhR gæti verið í stjórnun fasa-ll-ensíma sem tengjast andoxunarefnum frekar en útlendingafræðilegum viðbrögðum. Öfugt við skaðleg áhrif af völdum hátt magns af ROS, geta jákvæðu áhrifin sem AhR-skortur stuðlað að verið miðlað af vægu streitu hvatbera og/eða vægri ROS framleiðslu (mitohormesis), sem einnig treysta á Nrf2/SKN-1. Við gefum einnig sterkar vísbendingar um samspil curcumins og AhR. Curcumin hömlun á AhR merkjasendingum er þróunarlega varðveitt og er líklega ekki miðlað með bindingu við AhR LBD, heldur frekar með ROS-hreinsandi eiginleikum curcumins eða virkjun Nrf2/SKN-1. Nrf2 merkjaleiðin er örugglega hægt að virkja með curcumin á mismunandi vegu [91]. Að lokum sýndu gögnin okkar að curcumin stuðlar að öldrun gegn öldrun, einnig á óháðan hátt í bæði C.elegans (aukin GST-4 tjáning og oxunarálagsþol) og aðal EC manna (aukin Sod2 tjáning og flæðigeta ), sem gæti einnig útskýrt viðbótaráhrif curcumins og tap á AHR-1 virkni á heilsufarssvið dýra sem tjá fjölQQ.

5. Ályktanir

Að lokum, með upprunalegri blöndu af in silico, vitro og in vivo aðferðum, sýndum við að á meðan CeAhR virkjun verndar gegn oxunarálagi snemma á lífsleiðinni vinnur minnkuð tjáning þess gegn öldrun og miðlar jákvæðum öldrunaráhrifum curcumins (Mynd 7) . Curcumin getur þannig hjálpað til við að koma jafnvægi á virkni mismunandi umritunarþátta sem taka þátt í afeitrun/andoxunarviðbrögðum (bæla AhR og virkja Nrf2) við aðstæður þar sem þeim er breytt (auka AhR og minnka Nrf2/SKN-1), eins og öldrun eða aldurstengdar raskanir. Starf okkar bætir enn frekar flóknu stigi við hina þegar víðtæku fjölvirku og samhengissértæku starfsemi AhR, með mikilvægum áhrifum á heilsu lífvera og líftíma. Þar að auki opnar það dyrnar að viðbótarrannsóknum, þar sem þráðormakerfið er notað til að uppgötva og rannsaka forfeðrahlutverk AhR, sem ólíklegri er til að bera kennsl á í spendýrum.

Þessi grein er unnin úr Andoxunarefnum 2022, 11, 613. https://doi.org/10.3390/antiox11040613 https://www.mdpi.com/journal/antioxidants