Aristolochic sýra veldur bandvefsmyndun í nýrum og öldrun í músum
Mar 23, 2022
Ágrip:Nýrað er eitt af næmustu líffærunum fyrir aldurstengdri skerðingu. Almennt fylgir öldrun nýrna fifibrosis í nýrum, sem er síðasta algenga leið langvinnrarnýrnasjúkdóma. Aristolochic sýra (AA), sem er eiturverkun á nýru, veldur AA nýrnakvilla (AAN), sem einkennist af versnandi fifibrosis í nýrum og hnignun í starfsemi. Þó að fifibrosis í nýrum tengist öldrun nýrna, er enn óljóst hvort AA veldur nýrnaöldrun. Markmið þessarar rannsóknar er að kanna hugsanlega notkun AAN sem fyrirmynd að öldrun nýrna. Hér skoðuðum við öldrunartengda þætti í AAN módelum með því að gefa AA langvarandi til C57BL/6 músa. Í samanburði við viðmiðunarhópinn sýndi AA hópurinn öldrunnýrusvipgerðir, svo sem nýrnarýrnun, skerðing á nýrnastarfsemi og tubulointerstitial fifibrosis. Að auki stuðlaði AA að frumuöldrun sérstaklega ínýruog aukin nýrna p16 mRNA tjáning og öldrunartengd -galaktósíðasavirkni. Ennfremur sýndu AA-meðhöndlaðar mýs afbrigði í hvatbera í nálægum píplum, sem og uppsöfnun súrefnistegunda. Klotho, gen sem er gegn öldrun, minnkaði einnig verulega ínýruaf AA-meðhöndluðum músum. Samanlagt benda niðurstöður þessarar rannsóknar til þess að AA breyti öldrunartengdum þáttum og að fifibrosis í nýrum sé nátengd öldrun nýrna.
Leitarorð:langvarandi nýrnasjúkdómur; fifibrosis í nýrum; aristólókínsýra; öldrun; frumuöldrun
CISTANCHE mun bæta nýrna-/nýrnasjúkdóm
KynningMeð stöðugt vaxandi líftíma hjá mönnum þjást fleiri einstaklingar af aldurstengdri skerðingu.Nýrueru venjulega fyrir áhrifum af aldurstengdum vefskemmdum og tíðni langvinnranýrnasjúkdómureykst með aldrinum [1]. Öldrun nýrna flýtir fyrir heildaröldrun, sem leiðir til styttri líftíma. Þess vegna eru rannsóknir á öldrun nýrna nauðsynlegar, þótt viðeigandi dýralíkön hafi ekki verið að fullu þróuð. Nýrnaöldrun fylgja ýmsar meinafræðilegar breytingar, þar á meðal nýrnarýrnun, glomerulosclerosis og tubulointerstitial fifibrosis [2]. Millivefsfíbrósa í nýrum er síðasti algengi ferillinn í flestum tegundum versnandi nýrnasjúkdóma, sem bendir til þess að nýrnablóðsýking sé nátengd öldruðumnýru. Í öldrunarrannsóknum eru mýs áreiðanlegt verkfæri vegna erfðafræðilegrar nálægðar þeirra við menn, getu til að meðhöndla erfðamengi þeirra og þeirrar staðreyndar að þær sýna svipaðar öldrunartengdar svipgerðir og mönnum á lífsleiðinni [3]. Langtímaathuganir með innræktuðum músum eru tilvalin sem fyrirmynd að öldrun, þó það sé tímafrekt að fylgjast með músum allan líftíma þeirra. Að auki eru til nokkur erfðabreytt músalíkön af öldrun. Klotho-skortsmúsin er líkan af ótímabærri öldrun sem er notuð í öldrunarrannsóknum. Hins vegar, í þessu líkani, er nýrnastarfsemi óbreytt og nokkur líffæri önnur en nýrun eru skert [4]. Þannig gæti þetta músarlíkan verið óviðeigandi fyrir rannsóknir á öldrun nýrna.Gjöf Aristolochic sýru (AA) veldur sérstakri tegund nýrnaskaða sem kallast AA nýrnakvilli (AAN), sem einkennist af víðtækri millivefstrefjun [5,6]. AA er eitrað fyrir nýrnapípluþekju vegna þess að það stuðlar að myndun DNA-adducts í nýrnavef [7]. Ólíklegt er að AA hafi áhrif á önnur líffæri en þvagkerfið og getur verið gagnlegt við mat ánýru-sértækar breytingar. Þess vegna er AA almennt notað til að koma á líkönum af fifibrosis í nýrum í músum [8,9]. Hins vegar er enn óljóst hvort breytingar af völdum AA tengist öldrun ínýru. Í þessari rannsókn skoðuðum við aldurstengdar svipgerðir og sameindaþætti í AAN í músum
Niðurstöður 2.1. AA gjöf olli verulegu þyngdartapi, nýrnarýrnun og skerðingu á nýrnastarfsemiLíkamsþyngd (BW) og slagbilsþrýstingur (BP) voru eins í samanburðarhópnum og AA hópnum. BW í samanburðarhópnum jókst stöðugt á 8 vikum. Hins vegar var þyngdaraukning hamlað með AA gjöf og AA hópurinn hafði marktækt lægri BW 4 og 8 vikum eftir að AA gjöf hófst (Mynd 1A). Enginn marktækur munur var á slagbilsþrýstingi eða hjartsláttartíðni milli burðarviðmiðunarhópsins og AA hópsins (Mynd 1B,C). Hjartaþyngd/BW hlutfall sýndi engan mun á hópunum 8 vikum eftir að AA gjöf hófst (mynd 1D), ennýruþyngd/BW hlutfall var marktækt lægra í AA hópnum 8 vikum eftir að AA gjöf hófst (Mynd 1E). Næst skoðuðum við nýrnastarfsemi í burðarþols- og AA hópnum. Styrkur kreatíníns og þvagefnis köfnunarefnis í plasma (UN) var marktækt hærri í AA hópnum en samanburðarhópnum burðarefni 8 vikum eftir að AA gjöf hófst. Að auki dró AA meðferð marktækt úr kreatínínúthreinsun samanborið við burðarþolshópinn 8 vikum eftir að AA gjöf hófst (Mynd 1F–H).
2.2. AA gjöf olli augljósri millivefsvefjabólgu og marktækri uppstjórnun á trefjatengdri genatjáningu í nýrumVefjafræðileg athugun með því að nota periodic acid-Schiff (PAS) litun leiddi í ljós að gauklasvæðið var marktækt minnkað í AA hópnum samanborið við samanburðarhópinn fyrir burðarefni (Mynd 2A). Umfangsmikil tubulointerstitial fifibrosis, metin með Masson's trichrome (MT) litun, sást í AA hópnum (Mynd 2B), sem og með uppstjórnun á mRNA gildum nýrnafifibrosis tengdra gena, kollageni I og III, og umbreytandi vaxtarþáttum ( TGF)- (Mynd 2C–E).
2.3.AA Gjöf Hröðun frumuöldrunar, truflun á starfsemi hvatbera og uppsöfnun viðbragðssúrefnis/gentegunda (ROS) í nýrumTil að meta frumuöldrun skoðuðum við mRNA tjáningu í nýrum á p53, p21, p16 og glútamínasa (GLS), AA hópurinn sýndi marktækt hærra mRNA gildi þessara öldrunartengdu gena ínýru(Mynd 3A-D). Ennfremur, öldrunartengd -galactosidase(SA- -gal) litunarstyrkur ínýruvar aukin í AA hópnum og nánast fjarverandi í samanburðarhópnum fyrir burðarefni (Mynd 3E). Í AA hópnum leiddi rafeindasmásjárskoðun í ljós hvarf hvatbera kristalla, sundrun hvatbera, umfrymisvakuolization og sjálfhverfa í nálægum píplufrumum, samhliða niðurstjórnun á BCL2/adenovirus E1B 19-kDa víxlverkandi próteini 3(Bnip3), sem er hvatberatengd gen (Mynd 3FG). Nýrna mRNA tjáning Nox2. hluti af nikótínamíði adeníndínúkleótíðfosfat (NADPH) oxidasa, jókst marktækt í AA hópnum samanborið við burðarviðmiðunarhópinn (Mynd 3H). Ennfremur leiddi Western blot greining í ljós að 4-hýdroxý-2-nafngildi (4-HNE) í nýrum var marktækt aukið í AA hópnum (Mynd 3I). Þessar niðurstöður gáfu til kynna að gjöf AA olli frumuöldrun, truflun á starfsemi hvatbera og uppsöfnun ROS ínýru.
2.4. AA Minnkuð nýrnaklotho próteintjáningVið skoðuðum nýrnatjáningu próteina gegn öldrun í burðarþols- og AA hópunum. Klotho tjáning minnkaði marktækt í AA hópnum samanborið við burðarviðmiðunarhópinn (Mynd 4A), en nýrnatjáning nikótínamíð fosfóríbósýltransferasa (NAMPT) og sirtuin1 (SIRT1) var svipuð milli hópanna (Mynd 4B, C).
3. UmræðurAð því er við vitum er þessi rannsókn sú fyrsta sem einbeitir sér að mati á nýrnaöldrunartengdum breytingum á AAN með því að nota öldrunarmerki eins og p16 og SA- -gal virkni. AA meðferð ýtti undir nýrnarýrnun, millivefsvefja í tubulointerstitial fibrosis og nýrnastarfsemi, sem fylgdi uppstjórnun á nýrna p16 mRNA og SA- -gal-jákvæðri litun. Ennfremur sýndi AA hópurinn eiginleika öldrunartengdra nýrnaferla eins og afbrigðileika í hvatberum, aukið oxunarálag og niðurstjórnun á geninu gegn öldrun, Klotho. Samanlagt benda athuganir okkar til þess að langvarandi AA gjöf líki að hluta til eftir öldrun nýrna.
Frumuöldrun er varanleg stöðvun frumufjölgunar til að bregðast við ýmsum streituþáttum, svo sem DNA skemmdum, og stuðlar að öldrun og öldrunartengdum sjúkdómum. Tjáning p16, sýklínháðs kínasahemils, er í tengslum við öldrun í ýmsum líffærum, þar á meðal nýrum. Kaloríutakmörkun eykur líftíma með því að hindra pl6 tjáningu [10]. Að auki veldur brotthvarf p16-tjáandi öldrunarfrumna í INK-ATTAC músum með inndælingu á AP20187, FK506-bindandi próteindímerizer [11], deyfingu á svipgerðum öldrunar nýrna, svo sem glomerular sclerosis og nýrna. hnignun í starfi. Þess vegna er p16 einn mikilvægasti öldrunartengdi þátturinn. Hægt er að greina öldrunarfrumur með því að nota SA- -gal litun, sem sýnir aukna virkni -galaktósíðasa við pH 6,0 [12], og er mikið notað lífmerki öldrunar og aldraðra fruma. MRNA tjáning pl16 í nýrum eykst hjá eldri rottumnýruog fylgir aukinni SA- -galvirkni í nýrnaþekju [13I. Í þessari rannsókn sýndum við fram á aukna p16 mRNA tjáningu í nýrum og SA- -gal-litun, sem gefur til kynna að AA valdi nýrnaöldrun. Nýlega var greint frá því að GLS væri nauðsynlegt fyrir lifun öldrunarfrumna með aukinni glútamínólýsu og innanfrumu pH hlutleysingu [14]. Sýnt var fram á að hömlun á GLS-háðri glútamínólýsu í öldruðum músum útrýma öldrunarfrumum og bæta aldurstengda truflun á líffærum. Í þessari rannsókn benti uppstýring á nýrna-GLS mRNA til nýrnasöfnunar öldrunarfrumna í hópnum. Þannig olli langvarandi AA gjöf frumuöldrun í nýrum.
CISTANCHE MUN BÆTA NÝRA/NÝRAVERK
Til viðbótar við frumuöldrun er truflun á starfsemi hvatbera nauðsynlegur búnaður sem liggur að baki aldurstengdum vefskemmdum og fylgir ROS uppsöfnun [15,16. Truflun á starfsemi hvatbera knýr og viðheldur frumuöldrun [17] en frumuöldrun stuðlar beint að truflun á starfsemi hvatbera [18]. Bnip3, sem staðsett er fyrst og fremst í ytri hvatberahimnu, getur gegnt hlutverki í stjórnun hvatvefs í ræktuðum nærpíplufrumum í nýrum sem svar við oxunarálagi og súrefnisskorti. Hjá eldri músum eykur kaloríutakmörkun sjálfsát í pípulaga frumum, með uppstjórnun á Bnip3, og bætir hrörnun nýrnastarfsemi af völdum aldurs [19]. Í þessari rannsókn leiddi rafeindasmásjárskoðun í ljós eiginleika afbrigðilegra hvatbera sem geta orðið fyrir áhrifum af minni Bnip3 tjáningu í nýrum eða frumuöldrun. Hvatberar eru aðal innanfrumuuppspretta ROS. Til að meta áhrif afbrigðilegra hvatbera á nýrna-ROS, skoðuðum við nýrnasöfnun 4-HINE og sýndum AA-framkallaða ROS-uppsöfnun ínýru.NADPH oxidasar eru aðal uppspretta ROS. Í bráða fasa AAN í músum var mRNA tjáning Nox2 í nýrum hækkað og aðgengi nituroxíðs minnkað, sem leiddi til viðvarandi súrefnisskorts og blóðþurrðar [20. Hjá eldri rottumnýru, uppsöfnun ROS fylgir aukinni tjáningu Nox2 [21]. Þessar niðurstöður benda til þess að AA geti framkallað aldurstengdar svipgerðargerðir með ROS uppsöfnun af völdum truflunar á starfsemi hvatbera og uppstjórnun NADPH oxidasa.
Renal Klotho genatjáning var minnkuð í AA hópnum, en tjáning NAMPT og SIRTl var svipuð hjá hópunum. Klotho er gen gegn öldrun sem kóðar einhliða transhimnuprótein sem virkar sem öldrunarbælandi. Öldrunarferlið í Klotho-skortum músum líktist því hjá mönnum, þar á meðal styttri líftíma, ófrjósemi, æðakölkun, húðrýrnun, beinþynningu og lungnaþembu [22]. Hypomorphic stökkbreytt Klotho mýs sýndu einnig svipgerð hraðari öldrun, sem var endurreist með p16 brottnám [23]. Þar sem Klotho er mikilvægur þáttur í öldrun hafa Klotho genabreyttar mýs verið mikið notaðar í rannsóknum á öldrun. Hins vegar geta Klotho genabreyttar mýs verið óviðeigandi fyrir rannsóknir á öldrun nýrna vegna kerfisbundinnar öldrunartengdrar skerðingar þessara músa og þeirrar staðreyndar að nýrnastarfsemi er óstaðfest (þ.e. kreatínínmagn). Aftur á móti er hægt að nota AAN músarlíkanið sem lyfjaframkallað líkan af öldrun nýrna í rannsóknarskyni, þar sem það hefur nokkra kosti, svo sem tiltölulega auðvelda útfærslu og getu til að meta áhrif inngripa á skerðingu á nýrnastarfsemi. .
Þessi rannsókn hafði nokkrar takmarkanir. Við metum öldrun nýrna, með áherslu aðallega á frumuöldrun, formgerð hvatbera og öldrunartengda genatjáningu. Hins vegar eru leiðir öldrunar flóknar og enn illa skilnar. Að auki, þó að Klotho genatjáning hafi minnkað sem svar við AA, gátum við ekki sýnt fram á orsakatengsl við meinafræðilegar breytingar á AAN. Frekari rannsóknir eru nauðsynlegar til að ákvarða hlutverk hinna ýmsu sameinda sem taka þátt í þróun AAN. Engu að síður veitir þessi rannsókn nýja innsýn í notkun Avan sem fyrirmynd um öldrun nýrna. Það er mikilvægt að hafa í huga að svipgerðarbreytingar ánýrueru sterklega tengd líftíma. Þó aðnýruer auðveldlega fyrir áhrifum af öldrunartengdum breytingum, hömlun á öldrun nýrna getur lengt heildarlíftímann. Þess vegna geta frekari rannsóknir á öldrun nýrna með líkönum af AAN leitt til aukinnar langlífis í framtíðinni.
4. Efni og aðferðir4.1. DýrÞessi rannsókn var gerð í samræmi við leiðbeiningar Heilbrigðisstofnunar um notkun tilraunadýra. Allar dýratilraunir voru samþykktar af dýrarannsóknanefnd Yokohama borgarháskóla (samþykkisnúmer: FA20-027) og voru framkvæmdar í samræmi við leiðbeiningar ARRIVE. Leitast var við að lágmarka fjölda dýra sem notuð eru og þjáningar þeirra. Mýsnar voru geymdar í stýrðu umhverfi undir 12-klst ljós/12-klst. myrkri hringrás við 25 gráðu hita. Mýsnar höfðu frjálsan aðgang að mat og vatni.
CISTANCHE MUN BÆTA NÝRA/NYRA SÝKNING
Átta vikna gamlar karlkyns C57BL/6 mýs voru keyptar frá Charles River Laboratories (Wilmington, MA, Bandaríkjunum) og skipt í burðarþols- eða AA hópa eftir 1 viku af aðlögun, mýs voru gefnar í kviðarhol með burðarefni eða AA (Sigma) -Aldrich, St.Louis, MO, Bandaríkjunum), sem var leyst upp í litlu magni af dímetýlsúlfoxíði. Fyrir þessa rannsókn gerðum við forrannsókn með nokkrum samskiptareglum. Fyrsta aðferðin fól í sér gjöf AA (3 mg/kg) til C57BL/6 músa í kviðarhol tvisvar í viku í 4 vikur án endurgerðartíma; í þessari samskiptareglu olli AA augljósum bráðum nýrnaskemmdum, svo sem víkkuðum nærpíplum með tapi á burstakanti (viðbótarmynd S1). Í annarri samskiptareglunni var C57BL/6 músum gefið AA (2,5 mg/kg) í kviðarhol einu sinni í viku í 4 vikur og síðan endurgerð í 4 vikur; plasma kreatínín í þessum músum var 0,19 ± {{20}}.080 mg/dL á móti 0,18 ± 0,010 mg/dL (stjórnandi ökutækis á móti AA, í sömu röð; meðaltal ± staðalvilla meðaltals (SEM), p=0.86, óparað t-próf nemenda, n=4 á hóp) og plasma UN var 31,3 ± 5,95 mg/dL á móti 30,4 ± 3,87 mg/dL (ökutækisstjórnun á móti AA, í sömu röð; meðaltal ± SEM, p=0.90, óparað t-próf nemenda, n=4 á hóp). Þess vegna komumst við að þeirri niðurstöðu að þessi samskiptaregla hentaði ekki fyrir nýrnaskaðalíkan vegna þess að AA olli ekki marktækri skerðingu á nýrnastarfsemi. Í þriðju samskiptareglunni var C57BL/6 músum gefið AA (3 mg/kg) í kviðarhol tvisvar í viku í 10 vikur án endurgerðartíma; í þessum músum var dánartíðni í AA hópnum 83 prósent (n=6), en engin af músunum í samanburðarhópnum sem burðarefni dó (n=4). Í þessari samskiptareglu gátum við ekki tölfræðilega metið nýrnasvipgerðina af völdum AA vegna mikillar dánartíðni. Í fjórðu samskiptareglunni var C57BL/6 músum gefið AA (3 mg/kg) í kviðarhol tvisvar í viku í 4 vikur og síðan endurgerð í 4 vikur; langvarandi nýrnaskemmdir, svo sem tubulointerstitial fifibrosis, og skert nýrnastarfsemi kom fram hjá þessum músum [9]. Þess vegna, byggt á niðurstöðum þessara bráðabirgðarannsókna, samþykktum við fjórðu siðareglur til að framkvæma tilraunirnar í þessari rannsókn.
4.2.BP MælingSlagbilsþrýstingur og hjartsláttartíðni voru mæld með því að nota áður lýst tail-cuff aðferð (BP-Monitor MK-2000; Muromachi Kikai Co., Tokyo, Japan)[24,25]. Allar mælingar voru gerðar á milli 9:00 og 14:00. Að minnsta kosti 10 mælingar voru gerðar í hverri mús og meðalgildið notað við greiningu.
4.3. Rauntíma magngreiningar PCR greining með öfugum umritun Heildar-RNA var dregið úr nýrnavef með því að nota ISOGEN (Nippon Gene, Tókýó, Japan), og viðbótar-DNA (cDNA) var búið til með SuperScript IⅢ First-Strand System (Invitrogen, Waltham, MA, Bandaríkjunum). Rauntíma megindleg PCR greining var framkvæmd með því að nota CFX96 Touch rauntíma PCR uppgötvunarkerfið (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, Bandaríkjunum), og öfug umritunarafurðirnar voru ræktaðar með TaqMan PCR Master Mix og sérsniðinni TaqMan rannsaka (Applied Biosystems, Waltham, MA, Bandaríkjunum), eins og áður hefur verið lýst [26]. TaqMan rannsakar gegn eftirfarandi genum voru notaðir: kollagen I(Mm00801666_g1), kollagen II (Mm01254476_m1), TGF- (Mm01178819 m1),p53(Mm00441964 g1),p21( Mm04205640 g1).p16(Mm00494449 m1)GLS (Mm01257297_m1), Bnip3 (Mm01275600_g1), og Nox2 (Mm00627011_m1). 18S ríbósóma RNA.
4.4. Western Blot greining Próteintjáning var greind með western blot greiningu á einsleitum vefjum með því að nota áður lýst aðferð [27,28]. Heildar próteinútdrættir voru útbúnir úr vefjum með því að nota natríumdódecýl súlfat sýnislausn. Próteinstyrkur hvers sýnis var mældur með því að nota þvottaefnissamhæfða próteingreiningarsettið (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) og NanoDrop One (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Bandaríkjunum), með albúmíni í sermi nautgripa sem staðall. Jafnt magn af próteinþykkni úr vefjasýnunum var skipt á 5-20 prósent pólýakrýlamíð gel (ATTO Corp., Tókýó, Japan). Aðskilin prótein voru síðan flutt yfir á pólývínýlídendíflúoríð himnur með því að nota hálfþurrt flutningskerfið (ATTO Corp., Tókýó, Japan). Himnur voru stíflaðar í 1 klst við stofuhita með fosfat-jafnaðri saltlausn sem innihélt 5 prósent undanrennuduft. Himnur voru ræktaðar með frummótefnum gegn Klotho (ab181373 1:1000; Abcam, Cambridge, Bretlandi), NAMPT(sc-67020 1:5000; Abcam), SIRT1(07-131 1:1000, MilliporeSigma , Burlington, MA, Bandaríkin), 4-HINE(MHN-100P 1:1000; JaICA, Fukuroi, Japan), og glýseraldehýð-3-fosfat dehýdrógenasa (GAPDH) (2118, 1:2000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, Bandaríkjunum). Himnur voru þvegnar og ræktaðar með aukamótefnum í 60 mínútur við stofuhita. Staðir fyrir mótefna-mótefnavaka viðbrögð voru sýnd með því að nota aukið efnaljómunar hvarfefni (Merck, Kenilworth, NJ, USA). GAPDH var notað sem hleðsluviðmið. Myndir voru greindar magnbundið með því að nota ChemiDoc Touch (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, Bandaríkjunum).
4.5. Vefjafræðileg greining var framkvæmd eins og áður hefur verið lýst [29]. Nýrnavefur úr músum var festur með 4 prósent paraformaldehýði og síðan felldur inn í paraffín. Hlutar (4 um þykkir) voru litaðir með PAS og MT litum. Til að meta gauklasvæðið voru 50 glomeruli á mús mæld og meðaltal. Allar myndir voru teknar með BZ-9000 smásjá (Keyence Corp., Osaka, Japan).
CISTANCHE MUN BÆTA NÝRA/NÝRASKILUN
4.6. SA- -al litun Nýrnavefur úr músum var hratt frystur og settur í Optimal Cutting Temperature efnasamband (Sakura FinetekJapan, Co., Ltd., Tókýó, Japan). Hlutar (4 μm þykkir) voru útbúnir með því að nota kryostat (HM550-VPD; Thermo Fisher Scientific) og fest á glerrennibrautir. SA- -galvirkni var mæld með því að nota öldrunarskynjunarbúnað (Bio Vision Inc., Milpitas, CA, USA) samkvæmt samskiptareglum framleiðanda. Sýni voru skoðuð undir björtu sviði með ×100 stækkun með BZ-9000 smásjá (Keyence Corp.. 4.7.Electron MicroscopyRafeindasmásjárgreining var framkvæmd eins og áður hefur verið lýst [30]. Mýsnar voru svæfðar með ísóflúrani og gegndreyptar í gegnum hægri ósæðarbogann með heparínuðu (5 U/mL) lífeðlisfræðilegu saltvatni og 2,5 prósent glútaraldehýði í 0,1 mól/L fosfatbuffi við pH 7,4. Sýnum fyrir rafeindasmásjárskoðun var sökkt í 1 prósent osmíumtetroxíð í 2 klst, raðþurrkað í etanóli og fellt inn í Epon blöndu. UlItrathin hlutar voru litaðir með úranýlasetati og blýsítrati og skoðaðir með Hitachi H-7500 rafeindasmásjá sem var notuð við 80 kV (Hitachi, Ltd., Tókýó, Japan). Sneiðar voru skoðaðir í ×5000 stækkun og myndaðir með hleðslutengdri myndavél.
4.8.Lífefnafræðileg greiningBlóðsýnum var safnað með hjartastungu í matarástandi. Heilblóðsýni voru skilin í skilvindu við 3000 snúninga á mínútu (MR-150; Tomy Seiko Co., Ltd., Tókýó, Japan) í 10 mínútur við 4 gráður til að aðskilja plasma. Plasmasýnin sem fengust voru geymd við -80 gráðu. Kreatínín í plasma, UN og kreatínín í þvagi voru mæld með Hitachi 7180 sjálfvirka greiningartækinu (Hitachi, Ltd., Tókýó, Japan).
4.9. Tölfræðigreining Tölfræðilegar greiningar voru gerðar með GraphPad Prism hugbúnaði (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, Bandaríkjunum). Gögn eru sett fram sem meðaltal ± SEM. F-próf nemandans sem er óparað var notað til að bera saman muninn á ökutækisstjórn og AA hópnum.p<0.05 was="" considered="" statistically="">
5. ÁlyktanirAA stjórnun veldurnýruöldrun, ásamt millivefstrefjun í tubulointerstitial og nýrnarýrnun. Niðurstöðurnar benda til þess að bandvefsbólga í nýrum sé nátengd öldrun nýrna og að AAN geti verið gagnlegt sem anýru-sérstakt öldrunarlíkan.