Apoptosis viðnám öldrunarfrumna er innri hindrun fyrir senolysis af völdum hjartaglýkósíða

Vinsamlegast hafðu sambandoscar.xiao@wecistanche.comfyrir meiri upplýsingar

ÁgripMarkviss brotthvarf öldrunarfrumna, greining, er ein af meginstefnunum í meðferð gegn öldrun. Nýlega reyndust hjartaglýkósíð vera breiðvirkt senolytics. Hér prófuðum við senolytic eiginleika hjartaglýkósíða í átt að mesenchymal stofnfrumum manna (hMSCs). Hjartaglýkósíð höfðu enga senolytic getu gagnvart öldruðum hMSCs af ýmsum uppruna. Með því að nota líffræðilegar og lífupplýsingaaðferðir berum við saman öldrunarþróun í 'hjarta glýkósíð-næmum'A549 og '-ónæmum'hMSCs. Skortur á greiningu reyndist vera miðlað af áhrifaríkum kalíuminnflutningi og auknu frumudauðaþoli hjá öldruðum hMSCs. Veiking "antiapoptotic vörn" gerir hMSCs tilhneigingu til greiningar. Við komumst að því að frumufrumuþol, sem áður var viðurkennt sem algengt einkenni öldrunar, er í raun ekki almennt einkenni öldrunarfrumna. Þar að auki eru aðeins apoptosis-prólín öldrunarfrumur viðkvæmar fyrir hjartaglýkósíð-völdum greiningu. Þannig getum við velt því fyrir okkur að skilvirkni greiningar gæti verið háð því hvort öldrunarfrumur verði örugglega ónæmar fyrir frumudauða samanborið við hliðstæða þeirra sem fjölga sér.

LeitarorðStofnfrumur. Senolysis·Senescence·Apoptosis·Streituþol

Vinsamlegast smelltu hér til að vita meira

Kynning

Í dag er frumuöldrun talin algeng viðbrögð næstum allra tegunda fjölgandi frumna, þar á meðal krabbameins og stofnfrumna, sem og sumra frumna eftir mítósu við margs konar streituvaldandi áreiti [1-3]. Hægt er að greina á milli eftirfarandi tegunda frumuöldrunar í samræmi við uppruna örvandi þáttar: endurtekningar (vegna DNA skemmda á styttri telómerenda), af völdum krabbameinsgena (sem svar við afbrigðilegri virkjun krabbameinsvaldandi merkja), streituvöldum ( miðlað af DNA skemmdum af völdum oxunarálags, hitalosts, UV og y geislunar o.s.frv.) og krabbameinslyfjameðferðar (virkjað í krabbameinsfrumum sem svar við krabbameinslyfjum)[4-7]. Það er misleitni í merkjum sem tjáð eru af öldrunarfrumum eftir bæði frumugerð og móðgun sem notuð er til að framkalla öldrun. Hins vegar eru nokkrir algengir eiginleikar sem eru dæmigerðir fyrir flestar tegundir öldrunarfrumna. Nauðsynleg einkenni öldrunar fyrir hvers kyns frumur sem skiptast er óafturkræft útbreiðslutap [8].cistanche tubulosa þykkniÓafturkræfni frumuhringsstoppsins er stjórnað af cyclin-dependent kinasa (CDK) hemlum pl6 og p21 og er oft stjórnað af æxlisbælandi próteini p53 [8,9]. Aðrir mikilvægir eiginleikar öldrunarfrumna eru virkjun viðvarandi DNA skemmdaviðbragðs; ofstækkun frumna, sem oft kemur fram vegna skertrar lífmyndunar ríbósóma og nýmyndun próteina; truflun á niðurbroti leysis og truflun á niðurbrotskerfum hvíldar; aukin virkni sértæka lysosomalensímsins öldrunartengda- -galaktósíðasa; ýmsar hvatberabreytingar; öflun öldrunartengdrar seytingarsvipgerðar (SASP), sem samanstendur af bólgueyðandi þáttum, fylki-niðurbrjótandi ensímum, hvarfgefnum súrefnistegundum o.s.frv.; epigenetic og chromatin landslagsbreytingar, þar á meðal myndun öldrunartengdra gagnlita brennisteina og öldrunartengdrar útþenslu gervitungla [8-10]. Með öðrum orðum, öldrunarfrumur varðveita efnaskiptavirkni og lífskraft, en virkni þeirra er verulega breytt miðað við upprunafrumurnar.

Cistanche getur gegn öldrun

Nú er ljóst að öldrunarfrumur geta breytt nærliggjandi örumhverfi sem hefur áhrif á bæði nærliggjandi frumur og frumusvið, sem getur leitt til vefjabilunar og getur því tengst framgangi öldrunar og aldurstengdra sjúkdóma [11,12]. Með það í huga beinist meiri athygli í dag að aðferðum til markviss „dráps“ á öldruðum frumum[13-15]. Í þessu skyni er nýr flokkur lyfja sem kallast senolytics í virkri þróun. Senolytics miða að boðleiðum sem stuðla að viðnám öldrunarfrumna gegn frumudauða og valda þannig frumudauða helst í öldrunarfrumum [16]. Listinn yfir senolytics er stöðugt að bæta við nýjum lyfjum. Þekktustu efnasamböndin með tilgreinda senolytic virkni eru navitoclax (Bcl-2 fjölskylduhemill), blanda af dasatinib (hemli margra tyrosínkínasa) og quercetin (náttúrulegt flavonól), Hsp90 hemlar, MDM2 hemlar, FOXO{ {8}}p53 truflandi peptíð, BET fjölskyldu prótein niðurbrotsefni, uPAR-sérhæft CAR-T, galaktó-tengd navitoclax og ýmis senolytic náttúruleg efnasambönd[16-24]. Nýlega hafa tveir óháðir rannsóknarhópar greint hjartaglýkósíð, sérstaklega ouabain, digoxin og búfalin, sem breiðvirkt senolytics með því að nota háhraða lyfjaskimun [25,26].cistanche tubulosa umsagnirÞess má geta að næstum öll tilgreind senolytics hafa takmarkanir, svo sem óæskilegar aukaverkanir eða óvirkni gagnvart sumum frumugerðum. Mesenchymal stofnfrumur (MSCs), sem finnast nánast í öllum líffærum/vefjum eftir fæðingu, einkennast af getu til að endurnýja sig sjálf (samhverfar skiptingar) og aðgreina sig og stuðla þannig að viðhaldi og endurnýjun vefjarins sem býr [27]. Vegna þessara einstöku eiginleika, ásamt öflugum bólgueyðandi og ónæmisbælandi virkni, eru MSCs víða beitt í frumuuppbótarmeðferð til meðferðar á ýmsum sjúkdómum, þar á meðal sykursýki, MS, hjartadrep, og svo framvegis [28]. Hins vegar, svipað og aðgreindar afkvæmi þeirra og aðrar einhæfar frumur, geta MSC-frumur annað hvort æxlað eða ótímabært til að bregðast við virkjun krabbameinsgena og streituvaldandi áreiti [29, 30]. Æðrun MSCs hefur nóg af óæskilegum eftirköstum, þar á meðal þreyta stofnfrumusafnsins, skert viðhald og endurnýjun vefja, skert aðgreiningargeta, SASP-miðluð öldrunardreifing, skertir æðavaldandi eiginleikar, breyting á stofnfrumusviði [29,31-33]. Að teknu tilliti til líffræðilegrar þýðingar þess að rétta MSCs virki, gætu öldrunar MSCs talist mikilvægt markmið fyrir greiningu. Í samræmi við þessa tillögu hefur fjöldi umsagna sem varpa ljósi á mögulegar hagstæðar niðurstöður fjarlægingar á öldruðum MSCs verið birtar á síðasta ári [29, 31,34,35]. Engu að síður eru aðeins örfá tilraunagögn varðandi þetta mál [36-40].

Í þessari rannsókn sýnum við í fyrsta sinn fram á að hjartaglýkósíð, þ.e. ouabain og búfalín, sýna ekki blóðlýsuvirkni gagnvart MSCs (hMSCs) úr mönnum sem fengnar eru úr legslímu (END-MSCs), fituvef (AD-MSCs), tannkvoða (DP-MSCs) og Warton hlaup (WJ-MSCs). Að auki staðfestum við að bæði hjartaglýkósíð geta framkallað frumuddrun helst í senes-cent A549 og SK-HEP-1, eins og áður var lýst í tilraunarannsóknum [25,26]. Með því að meta breytingar á jónajafnvægi af völdum Nat/K plús -ATPasa blokkunar og tjáningarstigs tengdra gena komum við í ljós að skortur á ouabain-völdum greiningu gæti verið miðlað af aukinni virkni jöfnunar K plús innflutnings í öldrunar END- MSCs samanborið við senescent A549. Ennfremur, með því að nota háþróaða lífupplýsingafræði, sýnum við að öldrun END-MSCs, sem eru ónæm fyrir ouabain-völdum greiningu, fylgir öflun apoptosis-ónæmra svipgerð, en öldrun á ouabain-næmum A549 er það ekki. Mikilvægt er að hindrun á virkni andfjólulyfspróteins MCL-1 fyrir hjartaglýkósíðmeðferð leiddi til greiningar á öldrunarþolnum END-MSC öldrunarþolnum apoptosis. Þess vegna gefum við skýrar vísbendingar um að apoptosis-viðnám er ekki almennur eiginleiki öldrunarfrumna. Byggt á gögnunum sem fengust komumst við að þeirri niðurstöðu að skilvirkni greiningaraðferða gæti verið háð því hvort frumur hafi örugglega orðið apoptosis-ónæmar við öldrun.

efni og aðferðir

Frumur

END-MSCs, WJ-MSCs, DP-MSCs, AD-MSCs, A549 og SK-Help voru fengnar frá Russian Collection of Cell Cultures (Institute of Cytology, Saint-Petersburg, Russia). A549 og SK-hjálparlínur voru staðfestar með karyology, æxlismyndun, ísóensímprófum (LDH og G6PD) og STR greiningu. Frumur voru ræktaðar í fullkomnu miðli DMEM F12(Gibco BRL) sem bætt var við 10 prósent FBS (HyClone), 1 prósent penicillín-streptomycin (Gibco BRL) og 1 prósent glútamín (Gibco BRL). Allar frumur voru reglulega prófaðar fyrir mycoplasma mengun.

Öldrunar- og streituvaldandi aðstæður

Fyrir öldrun af völdum oxunarálags voru END-MSCs/WJ-MSCs meðhöndlaðir með 200 uM/100 uM HO(Sigma) í 1 klst. Fyrir öldrun af völdum doxórúbicíns voru DP-MSCs/A549 meðhöndluð með 1 μM af doxórúbicíni (Veropharm) í 3 daga. Í hverju tilviki voru frumur taldar öldrunarlausar ekki fyrr en 14 dögum eftir meðferð. Fyrir endurtekna öldrun voru AD-MSCs fyrr en 4. leið auðkennd sem viðmiðunarfrumur og síðar en 10. sem öldrunarfrumur. Fyrir öldrun af völdum etópósíðs var A549/END-MSCs/SK-Hjálp meðhöndluð með 2 uM/5 uM/3 uM etópósíði (Veropharm) í 3 daga og greind ekki fyrr en 7 dögum eftir örvun öldrunar. Í þessu tilviki féll meðferðarhönnunin algjörlega saman við þær sem lýst er í rannsókninni sem RNA-seq gögn komu frá (Wang o.fl.,2017). Tvö hjartaglýkósíð notuðum við sem senolytic efnasambönd — Ouabain (Sigma) og Bufalin (Calbiochem).

Til þess að bera saman streituþol milli viðmiðunar- og öldrunar END-MSCs eða A549, voru frumur meðhöndlaðar annað hvort með 400/800 uM H O2(Sigma) í 1 klst eða með 0,3/1 uM staurosporini (Sigma). Lífvænleiki frumna var greind 48 klst. eftir framkalla streitu.

Til að loka á MCL-1 virkni voru END-MSC formeðhöndluð með 10 uM af A-1210477(Sigma) í 3 daga.

Flæðifrumugreining

Mælingar á lífvænleika frumna, útbreiðslu, frumustærð, sjálfflúrljómun, frumudauðahraða, kaspasa 3/7 klofningu, hvatberahimnugetu og himnuafskautun voru framkvæmdar með frumuflæðismælingu. Flæðifrumumælingar voru framkvæmdar með því að nota CytoFLEX (Beckman Coulter) og gögnin sem fengust voru greind með CytExpert hugbúnaðarútgáfu 2.0. Viðloðandi frumur voru skolaðar tvisvar með PBS og safnað með trypsínvæðingu. Aðskildar frumur voru sameinaðar og endursviflausnar í ferskum miðli og síðan taldar og greindar fyrir sjálfflúrljómun. Til að fá aðgang að lífvænleika frumna var 50 ug/ml própídíumjoðíði (Life Technologies) bætt við hvert sýni rétt fyrir greiningu. Frumastærðin var metin með frumudreifingu áfram ljósdreifingu á PI-neikvæðum frumum. Örvun apoptosis var staðfest með Annexin-V-APC (Invitrogen) og DAPI (Sigma) samlitun samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. Kaspasavirkni var metin með því að nota CellEventTM Caspase-3/7 Green Flow Cytometry Assay Kit (Invitrogen) samkvæmt samskiptareglum framleiðanda. Tap á hvatberahimnugetu var metið með því að nota hlutfallsmælingarlitinn JC-1 (Invitrogen). Litunaraðferðin var framkvæmd í samræmi við samskiptareglur framleiðanda. Fyrir himnuafskautun notuðum við DiBAC4(3)flúrljómun (Invitrogen).

Öldrunartengd -galaktósíðasa litun

Aldrunartengd -Galactosidase (SA- -Gal) litun var framkvæmd með því að nota öldrunar-galaktósíðasa litunarbúnað (Cell Signaling Technology) samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. Magngreining á myndum var framleidd með beitingu MatLab pakkans, samkvæmt reikniritinu sem lýst var áður[41]. Fyrir hvern tilraunapunkt voru ekki færri en 50 frumur valdar af handahófi greindar.

Western blotting

Western blotting var framkvæmd eins og áður hefur verið lýst [41]. SDS-PAGE rafdráttur, flutningur yfir í nítrósellulósahimnu og ónæmisblettingu með ECL (Thermo Scientific) greiningu voru framkvæmdar samkvæmt stöðluðum samskiptareglum framleiðanda (Bio-Rad Laboratories). Mótefni gegn eftirfarandi próteinum voru notuð: glýseraldehýð-3-fosfat dehýdrógenasi (GAPDH)(klón 14C10), fosfó-p53(Ser15), p21(klón 12D1), fosfó-Rb (Ser807/811) , HMGB1 (klón D3E5), sem og piparrótarperoxídasa-tengd geita-antikanínu IgG. Þynningarhlutfall var 1:1000 fyrir öll frummótefni og 1:7000 fyrir aukamótefni. Öll mótefni voru keypt frá Cell Signaling. Scion Image 4.0 (Scion Corporation) var notað til að velja og ákvarða bakgrunnsfrádráttinn þéttleika böndanna í öllum hlaupunum og blotunum.

Transcriptomic greining

Sýni úr eftirfarandi þremur Gene Expression Omnibus (GEO)RNA-seq gagnasettum voru notuð í greiningunni: GSE102639(GSM2742113-GSM2742114 og GSM2742121-GSM2742122 fyrir stjórn og öldrunarA549 frumur, í samræmi við það); GSE122081(GSM3454482-GSM3454484 og GSM3454500-GSM3454502 fyrir eftirlits- og öldrunar IMR-90 frumur, í samræmi við það); og gagnasafn okkar GSE160702 (GSM4877895-GSM4877898 og GSM4877907-GSM4877910 fyrir stjórnunar- og öldrunar END-MSCs, í sömu röð). Gögnin fyrir öll gagnasöfnin voru unnin á sama hátt.

Raw lesgögn fóru í gegnum gæðasíun og millistykkisklippingu í gegnum FilterByTile og BBDuk forskriftir úr BBtools pakkanum (útgáfa 38.75) með því að nota sjálfgefna valkosti. Aflestrarnir voru til viðbótar síaðir og klipptir með notkun þriðjungsskriftar frá FastqPuri pakkanum (útgáfa 1.0.7).cistanche BretlandiSnyrtingin var beitt fyrir báða enda aflestra ef þeir innihéldu N eða gæði þeirra voru undir gæðaþröskuldinum sem sett var á 27, öllum lestum sem voru styttri en 25 basar var hent. Gæðaeftirlit með klippingu var haldið með FastQC hugbúnaðinum (útgáfa 0.11.7) og FastqPuri skriftum. Aflestur, sem hefur staðist allar aðgerðir, samanstanda af ekki minna en 90 prósent af upphaflegu gögnunum.

Magn afrita var metið með því að nota Salmon léttan kortlagningu (útgáfa 1.1.0) sem var keyrð í sértækri jöfnunarham. Listi yfir tálbeitur var myndaður á grundvelli Gencode tilvísunarerfðamengisins GRCh38.p13 (útgáfa 33) og notaður frekar til að byggja upp vísitöluna á samtengdum umrits- og erfðamengi Gencode tilvísunarskrám (útgáfa 33) með kmer stærð 21. Kortlagningaraðgerðir voru keyrðar með viðbótarfánum——numBootstraps 30——paljetti——gcBias——staðfesta kortlagningu. Kortlagningarhlutfallið var um 70 prósent.

Frekari gagnavinnsla var framkvæmd með því að nota R útgáfu 3.6.3 með Tidyverse pakkasafninu (útgáfa 1.3.0). Áætluð genafjöldi, lýsigögn og umritssvið voru hlaðin inn í R og tekin saman á genastig með því að nota tximeta (útgáfa 1.4.5). Talningarfylki sem myndast var síað þannig að það innihaldi línur með að minnsta kosti 5 áætlaðar talningar í öllum sýnum, fylkið sem fékkst innihélt 20.400 gen.

Fyrir PCA og hitakort framsetningu, voru lestölur staðlaðar með því að nota log umbreytingu frá DESeq2 pakkanum (útgáfa 1.26.0).cistanche wirkungHitakort voru smíðuð með notkun genasíu (útgáfa 1.38.0) og hitakorts(útgáfa 1.0.12)R pakka. Staðfesting á skiptingarsýnum eftir öldrunarbreytu var framkvæmd með undirstillingu, staðlaðri lestrarfjölda eftir genum sem tengjast Gene Ontology hugtakinu „Frumuöldrun“(GO 0090398). Mismunatjáningargreining og mat á logfalda breytingum var reiknað út með því að nota DESeq2 fyrir síðustu breytuna í hönnunarformúlunni control-ling fyrir öldrunarstöðu frumna, ouabain meðferðarviðbrögð og víxlverkun tilgreindra þátta. Til að styrkja mismunatjáningarprófun var leiðrétting á logbrotsbreytingum með því að nota blöndu af aðlögandi rýrnunarmati úr lófapakkanum (útgáfa 1.8.0) og tilgreindur viðbótarþröskuldur fyrir logbrotsbreytingu sem jafngildir 0,667 beitt. Samdráttarmatið sem leiddi til var notað frekar fyrir genaröðun og keyrslu á auðgunargreiningu genasetts með því að nota klasasnið (útgáfa 3.14.3) og fuse (útgáfa 1.12.0)R pakka með p gildum leiðrétt fyrir margvíslegan samanburð samkvæmt Benjamin-Hochberg aðferðinni. Affymetrix örfylkissýni fyrir viðmiðunar- og senes-cent AD-MSCs voru fengin úr GEO gagnagrunninum (GSE66236) og unnin með Phantasus vefforriti með log2 og quantile count normalization. Auðgunargreining genasetts var framkvæmd með notkun öryggi (útgáfa 1.12.0)R pakka.

RNA útdráttur, öfug umritun og rauntíma PCR

RNA útdráttur, öfug umritun og rauntíma PCR voru framkvæmd eins og lýst er í fyrri rannsókn okkar [32]. Hvarfefni fyrir RNA útdrátt (ExtractRNA hvarfefni), öfug umritun (MMLV RT Kit) og rauntíma PCR (HS SYBR Kit) voru fengin frá Evrogen. Genatjáningarstig var metið með rauntíma PCR BioRad CFX-96 magnara (BioRad) með eftirfarandi keyrsluforriti fyrir öll rannsökuð gen: 40 lotur af bráðnun í 10 sekúndur við 95 gráður, glæðing í 15 sekúndur við 57,5 ​​gráður , og nýmyndun í 15 sekúndur við 72 gráður. Bræðsluferlagreining var beitt til að stjórna sérhæfni viðbragða. Eftirfarandi greining á gögnunum sem fengust var framkvæmd með því að nota Bio-Rad CFX Manager hugbúnaðinn (BioRad) með stöðluðu 2deltaCt magngreiningaraðferðinni með notkun GAPDH tjáningar sem viðmiðun. Grunnraðir eru taldar upp í töflu 1.

tölfræðigreining

Til að fá þýðingu í muninum á milli hópanna tveggja var t-próf ​​nemenda eða t-próf ​​Welch beitt. Fyrir margvíslegan samanburð á milli hópa var ANOVA með Tukey's HSD notað. Nema annað sé tekið fram eru öll megindleg gögn sýnd sem meðaltal±SD og stjörnurnar gefa til kynna marktækan mun sem hér segir: ns, ekki marktækur,*p<0.05,><><0.001. statistical="" analysis="" was="" performed="" using="" r="">

Niðurstöður

H2O2-meðhöndlaðir END-MSCs fara í ótímabæra öldrun

Innan þessarar rannsóknar notuðum við mannkyns mesenchymal stofnfrumur einangraðar úr afflögðu legslímu (END-MSCs), sem uppfylla lágmarksviðmiðin sem ISCT lagði til til að skilgreina hMSCs [41]. Áður höfum við þróað áreiðanlegt tilraunalíkan til að rannsaka ýmsa þætti ótímabæra öldrunar END-MSCs [30]. Við höfum nefnilega sýnt fram á að END-MSCs sem urðu fyrir oxunarálagi undir dauða öðluðust smám saman alla dæmigerða eiginleika öldrunarfrumna, þar á meðal viðvarandi DNA skemmda brennipunkta og virk DNA skemmdarsvörun, óafturkræf frumuhringsstopp sem miðlað er af klassíska p53/p21/Rb ferill, tap á útbreiðslu, ofstækkun frumna, útlit SA- -gallitunar og þróun öldrunartengdrar seytingarsvipgerðar [30, 32, 42]. Hér notuðum við hönnuðu líkanið til að rannsaka senolytic áhrif ouabains sem og til að sýna undirliggjandi innanfrumubreytingar á jónajafnvægi. Upphaflega, með því að áætla algengustu breyturnar, staðfestum við að stakur skammtur (1 klst., 200 μM) HO meðferð nægði til að framkalla öldrun í END-MSCs. Mikilvægt er að stressaðir END-MSCs voru taldir öldraðir tveimur vikum eftir oxunarálagið; því voru öll öldrunarmerki metin ekki fyrr en 14 dögum eftir H-Oz meðferð. Reyndar leiddi H-Oz meðferð á END-MSC til útbreiðslu blokkunar, frumustækkunar eins og sýnt er fram af aukinni frumustærð, uppsöfnun lípófussíns sem greindist með aukinni sjálfflúrljómun, útliti SA- -Gal, virkjun á p21/Rb leið og tap á HMGB1 styðja saman öldrun stofnunar við valin tilraunaskilyrði (mynd ac, e, f).

Talið er að skaðlegustu áhrif öldrunarfrumna á vefja- og lífverustigi séu afleiðing langvarandi lífskrafts þeirra. Í samræmi við þetta atriði héldu HO?-meðhöndlaðir END-MSCs mikilli lífvænleika, jafnvel á seinni stigum öldrunarþróunar (lífvænleiki END-MSCs sem öldruðust var metinn 17 dögum (14 dögum＋3 dögum) eftir upphaflega oxunarálagið) (Mynd 1d) ). Til að draga saman þá er ódrepandi HO2-meðhöndlun á END-MSC viðeigandi líkan af ótímabærri öldrun og er viðeigandi til að rannsaka áhrif senolytic efnasambanda á END-MSCs.

Hjartaglýkósíð ouabain hefur enga senolytic virkni gagnvart öldruðum END-MSCs á breiðu styrkleikabili

Nýlegar vísbendingar benda til þess að hjartaglýkósíð, þar á meðal ouabain, digoxin og bufalin, tákni fjölskyldu efnasambanda með blóðlýsuvirkni [25,26]. Jafnvel þó að í dag séu hjartaglýkósíð talin breiðvirk sýklalyf, þá vantar upplýsingar um áhrif þeirra á öldrunarhMSCs. Þess vegna prófuðum við hér hvort ouabain hafi tilhneigingu til að framkalla dauða valkvætt hjá öldruðum END-MSCs. Til að gera það, metum við hagkvæmni stjórnunar og senes-cent END-MSCs eftir meðferð með ouabain á breiðu styrkleikabilinu (frá 10-' til 10~ M). Athyglisvert er að hvorug styrkurinn sem var beitt leiddi til merkjanlegrar minnkunar á lífvænleika bæði viðmiðunar- og öldrunarfrumna á fyrsta degi eftir notkun ouabains (mynd 2 og viðbótarmynd S1).

Hins vegar, á þriðja degi eftir meðferð með ouabain, sýndum við marktæka skammtaháða lækkun á lífvænleika END-MSC stjórnunar (mynd 2a og viðbótarmynd S1). Óvænt reyndust öldrunarfrumur vera ónæmari fyrir ouabain við hvern styrk sem var prófaður. Í samræmi við þessa niðurstöðu,10- leiddi M ouabain til líklegri apoptótísks dauða í samanburðarfrumum (20,75 prósent An plús /PI-og 36,47 prósent An plús /PI plús ) samanborið við aldraða (15,01 prósent An＋/PI -og 12,15 prósent An plús /PI plús )(Mynd.2b). Fengnar niðurstöður sýna greinilega fram á að í samhengi við öldrunar END-MSCs hefur ouabain enga senolytic virkni.

Til að útiloka möguleg áhrif sem tengjast breytileika öldrunarörvandi áreiti á senolytic verkun ouabains, gerðum við viðbótarsett af tilraunum. Við meðhöndluðum nefnilega END-MSCs með etópósíði í stað oxunarálags til að framkalla ótímabæra öldrun.sítrus bioflavonoidsEtoposide-meðhöndlaðar END-MSCs sýndu alla eiginleika sem eru dæmigerðir fyrir öldrunarfrumur (Mynd 3a-e).

Mikilvægt er að ouabain hafði enga blóðlýsandi virkni gagnvart etópósíð-meðhöndluðum öldruðum END-MSCs (mynd 3f og viðbótarmynd S2). Þessi gögn veita frekari staðfestingu fyrir ofangreindum niðurstöðum og vísbendingar um að skortur á greiningu af völdum ouabains sé ekki afleiðing af steypuöldrun sem notaður er til að framkalla öldrun.

Mynd.1 Sannprófun á END-MSCs ótímabæra öldrunarlíkani af völdum oxunarálags. Aldraðir END-MSCs a laus fjölgun, b gangast undir ofvöxt, c öðlast aukið sjálfflúrljómun, halda mikilli frumulífvænni d og e sýna SA- -Gal virkni samanborið við viðmiðunarfrumur. f Fosfórunarmagn p53 og Rb og tjáningarstig p21 og HMGBI próteina í stjórnandi og öldruðum END-Ouabain hefur enga blóðlýsandi virkni gagnvart mönnum mesenchymal stofnfrumum af ýmsum uppruna. , greindum við ouabain áhrif á hMSCs einangruð frá öðrum aðilum, þar á meðal fituvef, tannmassa og Wharton's hlaup. Til að styrkja gögnin okkar til viðbótar beittum við mismunandi líkönum af öldrun——afritunaröldrun fyrir AD-MSCs, doxorubicin-framkallaða öldrun fyrir DP-MSCs og oxunarálagsframkallaða öldrun fyrir WJ-MSCs (mynd 4a-f).

Eins og sést á mynd 4g voru ýmsar gerðir hMSC mismunandi í lífvænleika við ouabain meðferð, til dæmis voru bæði viðmiðunar- og öldrunar DP-MSCs mun ónæmari fyrir ouabain verkun en WJ-MSCs (Mynd 4g og viðbótarmynd S3b, c). Engu að síður gat ouabain ekki framkallað senolysis í hvorri gerð öldrunar hMSCs (mynd 4g og viðbótarmynd S3). Saman sýna gögnin sem fengust að skortur á greiningum af völdum ouabains er algengur eiginleiki fyrir ýmsar gerðir hMSCs. MSCs. Gildin sem birt eru eru meðaltal±SD. Fyrir samanburð á mörgum hópum við a og d var einstefnu ANOVA beitt, n=3, ns ekki marktækur,***p<0.001. for="" pair="" comparisons="" at="" b,c="" and="" e="" welch's="" t-test="" was="" used,n="3" for="" b="" and="" c,n="50" for=""><0.001. scale="" bars="" for="" images="" are="" 500="">

GAPDH var notað sem hleðslustýring

Hjarta glýkósíð búfalín nær ekki að drepa öldruð END-MSCS

Til að sannreyna að hjartaglýkósíða væri ekki til staðar fyrir hMSC, notuðum við búfalin, annað efnasamband með tilgreinda senolytic virkni sem tilheyrir hjartaglýkósíð fjölskyldunni [25]. Búfalin hafði nánast engin áhrif á lífvænleika stjórnunar og H2O2-meðhöndluð senes-cent END-MSCs á breiðu styrkleikabili (frá 10-7 til 10-5 M) (mynd 5a og viðbót mynd S4a).

Svipað og við sáum fyrir ouabain meðferð, var skortur á greiningu á búfalíni óháð öldrunarörvandi áreiti, þar sem lífvænleiki ESCs sem greindust annaðhvort til að bregðast við oxunarálagi eða etópósíði var óbreytt (mynd 5a, b, viðbótarmynd S4a, b). Niðurstöðurnar sem lýst er hér að ofan staðfesta að hjartaglýkósíð reyndust óvirk til að framkalla markvissa dauða hjá öldruðum END-MSC. MSCs. Gildin sem birt eru eru meðaltal±SD. Fyrir samanburð á mörgum hópum við a og d var einstefnu ANOVA beitt, n=3, ns ekki marktækur,***p<0.001. for="" pair="" comparisons="" at="" b,c="" and="" e="" welch's="" t-test="" was="" used,n="3" for="" b="" and="" c,n="50" for=""><0.001. scale="" bars="" for="" images="" are="" 500="" um.="" gapdh="" was="" used="" as="" a="" loading="">

Hjarta glýkósíð búfalín nær ekki að drepa öldruð END-MSCS

Til að sannreyna að hjartaglýkósíða væri ekki til staðar fyrir hMSC, notuðum við búfalin, annað efnasamband með tilgreinda senolytic virkni sem tilheyrir hjartaglýkósíð fjölskyldunni [25]. Búfalin hafði nánast engin áhrif á lífvænleika stjórnunar og H2O2-meðhöndluð senes-cent END-MSCs á breiðu styrkleikabili (frá 10-7 til 10-5 M) (mynd 5a og viðbót mynd S4a).

Svipað og við sáum fyrir ouabain meðferð, var skortur á greiningu á búfalíni óháð öldrunarörvandi áreiti, þar sem lífvænleiki ESCs sem greindust annaðhvort til að bregðast við oxunarálagi eða etópósíði var óbreytt (mynd 5a, b, viðbótarmynd S4a, b). Niðurstöðurnar sem lýst er hér að ofan staðfesta að hjartaglýkósíð reyndust óvirk til að framkalla markvissa dauða hjá öldruðum END-MSC.

Mynd 2 Ouabain hefur enga blóðlýsuvirkni gagnvart HO2-meðhöndluðum senes-cent END-MSCs á breiðu styrkleikabili. Hlutfallsleg frumulífvænleiki ( prósent ) END-MSC viðmiðunar og öldrunar á 3 dögum eftir meðferð með 1077,10~6,10-5 M ouabain. b Örvun á frumudauða í END-MSC við 10-6 M ouabain metið með viðauka V/DAPI tvöfaldri litun. n=3 óháðar tilraunir. Öll gögn samsvara meðaltali ± SD. Tölfræðileg marktækni var metin með t-prófi Welch:ns ekki marktækt,***bls<>

Bæði hjartaglýkósíð ouabain og bufalin geta framkallað frumudauða valkvætt í öldruðum A549 og SK-Hep1 frumum

Með hliðsjón af þeirri staðreynd að niðurstöður okkar eru ekki í samræmi við nýlega birtar vísbendingar um breiðvirka senolytic verkun hjartaglýkósíða, ákváðum við að endurskapa þessi áhrif með því að nota frumulíkanið sem lýst er í viðeigandi rannsóknum [25,26]. Þannig gerðum við röð tilrauna með því að nota viðmiðunar- og öldrunar A549 lungnakrabbameinsfrumur. Öldrun í A549 frumum var framkölluð með etópósíð meðferð. Etoposide-framkallað öldrun A549 frumna er oft notað og þar af leiðandi vel einkennandi líkan af meðferðar-framkölluðum öldrun [4]. Einnig var sýnt fram á að ouabain drepur valkvætt etópósíð-meðhöndlaðar öldrunar A549 frumur[25]. Til að sanna öldrun í A549, metum við útbreiðsluhraða, frumustærð, uppsöfnun lípófíns, SA- -gallitun, virkjunarstöðu af p53/p21/Rb leiðinni og tjáningarstig HMGB1 (mynd 6a-e).

Til að sannreyna blóðlýsuvirkni ouabains gagnvart öldruðum krabbameinsfrumum, áætluðum við fyrst skammtaháða lífvænleika frumna. Í samræmi við niðurstöður okkar sem lýst er hér að ofan, gátum við ekki greint neina marktæka fækkun á fjölda lífvænlegra stjórnunar- eða öldrunar A549 frumna innan 24 klst. eftir notkun ouabain (viðbótarmynd S5a). Hins vegar, á 3 dögum eftir meðferð, minnkaði ouabain marktækt lífvænleika A549 frumna sem öldruðu á sér á skammtaháðan hátt, en fjöldi samanburðar A549 frumna minnkaði í mun minna mæli (Mynd 7a og viðbótarmynd S5a). Nefnilega, um það bil 90 prósent viðmiðunarfrumna varðveittu lífvænleika við 10- M ouabain samanborið við 50 prósent af öldruðum A549 frumum sem fengu sama skammt (Mynd 7a). Þar að auki voru öldrunarfrumur A549 hætt við búfalíni af völdum frumudauða en hliðstæða þeirra í samanburði (mynd 7b) (mynd 5b og viðbótarmynd S5b).

Samkvæmt útgefnum gögnum kveikti ouabain af stað kaspasa-3-háð frumudauði í öldruðum A549 frumum [26]. Reyndar sýndum við marktæka aukningu á tvöföldu jákvæðu og/eða PI-hlutfalli í öldruðum krabbameinsfrumum sem fengu meðferð með 10-6M ouabain (Mynd 7c). Ennfremur, með því að nota flúrljómunarpróf, sáum við virkjun caspasa-3 í ouabain-meðhöndluðum öldruðum A549 frumum (Mynd 7d). Samanlagt eru þessar niðurstöður algjörlega í samræmi við gögn sem lýst er af öðrum höfundum og staðfesta blóðlýsuvirkni ouabains gagnvart A549.

Einnig notuðum við doxórúbicín í stað etópósíðs til að valda öldrun í A549 (Mynd 8a-e). Eins og búist var við sýndu doxórúbicín-meðhöndlað öldrunarefni A549, sem og etópósíð-meðhöndlað, hærra næmi bæði fyrir ouabain og búfalíni samanborið við hliðstæða þeirra í samanburði (mynd 8g og viðbótarmynd S6). Hið síðarnefnda staðfestir að senolytic áhrif hjartaglýkósíða eru óháð öldrunarörvandi áreiti. Þannig hafa hjartaglýkósíð örugglega senolytic

Mynd 3 Ouabain getur ekki framkallað senolysis í etópósíð-meðhöndluðum öldruðum END-MSCs. Staðfesting á öldrunarlíkani af völdum þátta fyrir END-MSC: a fjölgunargetu, b frumustærð, c sjálfflúrljómunarstig og d SA- -Gal virkni, e fosfórunarstig Rb og tjáningarstig p21 og HMGBI próteina. f Hlutfallsleg lífvænleiki frumna ( prósent ) viðmiðunar- og öldrunarfrumna eftir meðferð með 10-6 ouabaini. Gildi eru meðaltal±SD. Fyrir marga hópa var samanburður á einstefnu ANOVA beitt,n=3, ns ekki marktækur,***p<0.001.for pair="" comparisons="" at="" b,c,d,f="" welch's="" t-test="" was="" used,="" n="3" for="" b,="" c,f="" n="50" for="" d,="" ns="" not="" significant,=""><0.05,><0.001. scale="" bars="" for="" images="" are="" 500="" μm.="" gapdh="" was="" used="" as="" loading="" control="" activity="" towards="" a549,="" but="" these="" compounds="" turned="" out="" to="" be="" ineffective="" for="" targeted="" death="" induction="" in="" senescent="">

Að lokum ákváðum við að endurskapa greiningartilraunir á etópósíð-meðhöndluðum lifrarkrabbameinsfrumum SK-Help, annað frumulíkan með sannað senolytic áhrif hjartaglýkósíða samkvæmt Guerrero o.fl. rannsókn [25] (Mynd.9a-e). Etoposide-meðhöndlað öldrunarefni SK-Hjálp sýndi hærra næmni fyrir báðum lyfjunum samanborið við hliðstæða þeirra í samanburði, sem sannaði blóðlýsuvirkni hjartaglýkósíða gagnvart þessari frumugerð (Mynd 9f og viðbótarmynd S7).

Saman benda þessi gögn til þess að sértækni blóðlýsu sem framkölluð er af hjartaglýkósíðum byggist meira á frumueðli en á steypuöldrun.

Þessi grein er dregin út úr Cellular and Molecular Life Sciences (2021) 78:7757–7776 https://doi.org/10.1007/s00018-021-03980-x