Efnafræðileg og erfðafræðileg mismunun á Cistanches Herba byggt á UPLC-QTOF/MS og DNA strikamerki

Tengiliður: emily.li@wecistanche.com

Sihao Zheng, Xue Jiang, Labin Wu, Zenghui Wang og Linfang Huang *

Ágrip

CistanchesHerba (Rou Cong Rong), þekkt sem "Ginseng of the desert", hefur sláandi læknandi áhrif á styrk og næringu, sérstaklega í nýrnastyrkingu til að styrkja yang. Hins vegar eru tveir plöntuupprunar Cistanches Herba,Cistanche deserticolaogCistanche tubulosa, mismunandi hvað varðar lyfjafræðilega verkun ogefniíhlutir. Til að greina uppruna plöntunnarCistanchesHerba, samsett aðferðakerfi afefniogerfðafræðilega–UPLC-QTOF/MS tækni og DNA strikamerki – var fyrst notað í þessari rannsókn. Niðurstöðurnar gáfu til kynna að þrjú möguleg merkjasambönd (hverfu af campneoside II, cistanoside C og cistanoside A) hafi verið fengin til að greina uppruna þessara tveggja með PCA og OPLS-DA greiningum. DNA strikamerki gerði kleift að aðgreina tvo uppruna nákvæmlega. NJ tré sýndi að tveir upprunar flokkuðust í tvær klæðar. Niðurstöður okkar sýna að tveir upprunaCistanchesHerba eiga mismunandiefnitónsmíðar ogerfðafræðilegaafbrigði. Þetta er fyrsta tilkynnt mat á tveimur upprunaCistanches Herba, og niðurstaðan mun auðvelda gæðaeftirlit og klíníska beitingu þess.

Smelltu hér til að fá frekari upplýsingar um Cistanche

Kynning

CistanchesHerba (Rou Cong Rong), þekkt sem „Ginseng eyðimerkurinnar“, er upprunnið úr þurrkuðum safaríkum stilkum afCistanchedeserticola YC Ma og Cistanche tubulosa (Schrenk) Wig samkvæmt kínversku lyfjaskránni (2010 útgáfu), og er vinsæl fyrir að styrkja nýrna-yin, gagnast lífskjarnanum og slaka á þörmum. Eins og er er Cistanches Herba aðallega dreift í þurrum og hlýjum eyðimörkum í norðvesturhluta Kína, sérstaklega í Xinjiang og Innri Mongólíu héruðum. Hins vegar eru tveir upprunar Cistanches Herba ólíkir hvað varðar lyfjafræðilega virkni þeirra ogefniíhlutir. Tu et al. rannsakað decoction af þremurCistanchetegundir (C. deserticola, C. tubulosa, Cistanche salsa) og komst að því að C. tubulosa sýndi minnstu áhrifin í Yang-skorts músarlíkani [1]. Zhang o.fl. bar saman lyfjafræðilega virkni milli C. deserticola, C. tubulosa og C. salsa og komst að því að þessar tegundir höfðu lækningahlutverk eins og þreytuþol og súrefnisþol, en ekki í sama mæli [2]. Fyrri rannsóknir greindu fráefnihluti og tilgreindi mismuninn áefnihluti og innihald fyrir uppruna plantnaCistanchesHerba [3]. Eins og fyrir klíníska notkun og markaðsdreifingu, sem tonic, C. tubulosa hefur jafnan verið notað sem blóðrásarhvetjandi efni og við meðferð á getuleysi, ófrjósemi, lumbago, líkamsveikleika í Japan [4]–[8].

Þar af leiðandi er mjög mikilvægt að greina á milli tveggja upprunaCistanchesHerba fyrir gæðaeftirlit og klíníska notkun. Hins vegar er engin rannsókn áhersla á mismunun á tveimur uppruna Cistanches Herba. Margar rannsakaðar aðferðir, þar á meðal smásjárskoðun, útfjólubláa og innrauða uppgötvun, millieinfaldar endurtekningaraðferðir hafa verið notaðar til að bera kennsl á ættkvísl Cistanches, en ekki aðeins fyrir tvo uppruna sérstaklega [9]–[20]. Hér notuðum við samhliðaefniog sameindatækni til að greina tvo upprunaCistanchesHerba, UPLC-QTOF/MS (ultra-performance vökvaskiljun ásamt quadrupole time-of-flight massagreiningu) og DNA strikamerki. UPLC-QTOF/MS veitir upplýsingar hraðar og skilvirkari miðað við aðrar aðferðir. Mikil sértækni og næmni UPLC-QTOF/MS hefur leitt til notkunar þess fyrir bæði megindlegar og eigindlegar greiningar, svo og í greiningu á umbrotsefnum og auðkenningu flókinna efnasambanda í hefðbundinni kínverskri læknisfræði [21] - [22]. Aðalþáttagreining (PCA) og hornrétt vörpun til duldrar uppbyggingargreiningargreiningar (OPLSDA) eru einnig þróuð til að bera kennsl á hugsanleg merkisambönd. DNA strikamerki, auðveldari og alhliða sameindamerkjatækni, notar DNA brot til að bera kennsl á tegundir eða ættkvíslir. Það er hlutlægt, nákvæmara og auðveldara í framkvæmd en hefðbundnar auðkenningaraðferðir og önnur sameindamerkjatækni. Þar að auki hefur DNA strikamerki verið beitt með góðum árangri til að bera kennsl á dýr og plöntur, þar á meðal lækningajurtir [23]–[26].

Tilgangur þessarar rannsóknar er að koma á fót vísindalegu aðferðakerfi, sameinuðu UPLC-QTOF/MS og DNA strikamerki, til að greina á milli tveggja plantna upprunaCistanchesHerba.

Efni og aðferðir

Siðferðisyfirlýsing

Við staðfestum að vettvangsrannsóknirnar tóku ekki til dýra í útrýmingarhættu eða verndaðar. GPS hnit hafa verið innifalin í sýnishornsupplýsingunum, vinsamlegast sjá töflu 1."

Tafla 1 Sýnishorn afCistanchedeserticola og Cistanche tubulosa.

WLMQ þýddi Wu Lu Mu Qi borg; GJH þýddi Gan Jia Hu; HBKSEMG þýddi Hoboksar Mongol Autonomous County; KLMY þýddi Ke La Ma Yi borg; BDJLSM þýddi Badain Jaran eyðimörk; ALSZQ þýddi Alxa vinstri borði; DSX þýddi Dong San sýsla; CL þýddi Ce Le sýsla; MF þýddi Min Feng sýsla; HT þýddi He Tian sýsla.

Plöntuefni og hvarfefni

Safaríkar stilkar afCistanchesJurtum var safnað frá villtum eyðimerkursvæðum í Innri Mongólíu, Qinghai héruðum, Xinjiang Uygur sjálfstjórnarsvæðinu, Alþýðulýðveldinu Kína (tafla 1) í maí 2012. Sýnum rannsóknanna var öllum safnað í villtum eyðimerkursvæðum, ekki í einkalandi, þar sem ekki var þörf á sérstökum heimildum. Grasafræðileg auðkenni stilkanna var staðfest af Dr. Linfang Huang. Skírteinissýni voru afhent hjá The Institute of Medicinal Plant Development. Hágæða vökvaskiljun (HPLC) asetónítríl (Merck KGaA, Darmstadt, Þýskalandi) og maurasýru (Tedia, Bandaríkjunum) voru notuð fyrir UPLC greiningu. Afjónað vatn var hreinsað með Milli-Q kerfi (Millipore, Bedford, MA, Bandaríkjunum). Allt annaðefnivoru af greiningareinkunn.

Undirbúningur sýnis

CistanchesHerba sýni (1,0 g, 65-möskva) voru flutt í 50-ml keiluflösku og 50 ml af 70 prósent metanóli var bætt við. Eftir að hafa legið í bleyti í 30 mínútur var ultrasonication (35 kHz) framkvæmd við stofuhita í 30 mínútur. Eftir skilvindu við 10,000 snúning/mín í 10 mínútur, var flotið geymt við 4 gráður og síað í gegnum 0.22-μm himnu fyrir inndælingu í UPLC-QTOF/MS kerfið til greiningar.

UPLC-QTOF/MS

Fyrir UPLC greiningu voru eftirfarandi kerfi/færibreytur notuð: Waters Acquity kerfi (Waters) búið tvíundirri leysisdælu, sjálfvirkum sýnatökutæki og PDA skynjara tengdum Waters Empower 2 gagnastöð; ultrasonication (250 W, 50 kHz, Kunshan Ultrasonic Instrument Co., Zhejiang, Kína); og rafrænt greiningarjafnvægislíkan AB135-2 (Mettler-Toledo., Greifensee, Zürich, Sviss). Waters Acquity UPLC BEH C18 súla (1,7 µm, 2,1×100 mm, Waters) og Waters C18 verndarsúla (sama efni, vatn) voru notuð og haldið við 30 gráður. Hreyfanlegur fasi var 0,1 prósent maurasýruvatnslausn (A) og asetónítríl (B) með hallakerfi sem hér segir: 0–3 mín., 10–22 prósent B; 3–4 mín., 22–23 prósent B; 4–6 mín., 23–35 prósent B; 6–8 mín, 35–37 prósent B; 8–11 mín., 37–42 prósent B; 11–12 mín, 42–48 prósent B; 12–15 mín., 48 prósent –50 prósent B við 0,3 ml/mín. Inndælingarrúmmálið var 5 µL.

UPLC/MS greiningin var gerð á QTOF Synapt G2 HDMS kerfi (Waters, Manchester, Bretlandi) búið rafúðajónunargjafa (ESI) sem er starfrækt í neikvæðri jónaham. N2 var notað sem losunargas. Upplausnarhitastigið var stillt á 45{{10}} gráður við flæðihraða 800 l/klst., og hitastigið var stillt á 120 gráður. Háræðaspennan og keiluspennan voru stillt á 2500 og 40 V, í sömu röð. Gögnum var safnað á bilinu 50–1200 Da með 0.1-s skannatíma og 0.01-s milliskannunartöf á 15-mín. greiningartíma. Argon var notað sem árekstursgasið við þrýstinginn 7,06661023 Pa. Öllum MS gögnum var safnað með LockSpray kerfinu til að tryggja massa nákvæmni og endurgerðanleika. [MH]-jón leucine-enkephalin við m/z 554.2615 var notuð sem læsimassa í neikvæðum ESI ham.

UPLC-QTOF/MS gögn fyrirCistanchesHerba sýni voru greind til að bera kennsl á hugsanlegar aðgreiningarbreytur. Hámarksuppgötvun, röðun og síun ES hrágagna var framkvæmd með því að nota Marker Lynx forritastjórann, útgáfu 4.1 (Waters, Manchester, Bretlandi). Stærðirnar sem notaðar voru voru sem hér segir: varðveislutími (tR) upp á 0–15 mín., massi 50–1200 Da, varðveislutímaþol upp á 0,02 mín. og massi þol 0,02 Da. Notuð voru þrjú endurtekin sýni sem safnað var frá hverri landfræðilegri staðsetningu (n = 3). Alls voru 6.339 breytur notaðar til að búa til líkanið.

DNA strikamerki: DNA útdráttur, PCR mögnun og raðgreining

Sýni sem tekin voru úr þurrkuðum holdugum stilkum af C. deserticola og C. tubulosa (30 mg) voru nudduð í 2 mínútur með 30 r/s tíðni. DNA var dregið út samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda (Tiangen). Sérstaklega var samskiptareglunum breytt þannig að klóróformi var skipt út fyrir blöndu af klóróformi: ísóamýlalkóhóli (24∶1 í sama rúmmáli) og jafnalausn GP2 með ísóprópanóli (sama rúmmáli). Nuddaða duftið var sett í 1,5 ml eppendorf glös, bætt við 700 µL 65 gráðu forhitaða GP1 og 1 µL -merkaptóetanól til að blanda með því að nota hvirfil í 10–20 sekúndur og ræktað í 60 mínútur við 65 gráður; Bæta við 700 µL blöndu af klóróformi: ísóamýlalkóhóli (24∶1), skilið í 5 mínútur við 12000 rpm (∼13400×g); Pípettaðu flotvatn í nýtt rör, bættu 700 µL ísóprópanóli við, blandaðu í 15–20 mínútur; Setjið alla blönduna í snúningssúlu CB3 og skilið í 40 sekúndur við 12000 rpm; Fargið síuvökvanum og bætið við 500 µL GD (bætt við magnbundnu vatnsfríu etanóli fyrir notkun), skilið í skilvindu við 12000 rpm í 40 s; farga síuvökvanum og bæta við 700 µL PW (bætt við magnbundnu vatnsfríu etanóli fyrir notkun) til að þvo himnuna, skilvindu í 40 s við 12000 rpm; Fargaðu síuvökvanum og 500 µL PW bætt við, skilvindu í 40 sekúndur við 12000 rpm; Fargið síuvökvanum og skilið í skilvindu í 2 mínútur við 12000 rpm til að fjarlægja leifar af þvottajafna PW; Snúningssúlan CB3 er færð yfir í hreint 1,5 ml eppendorf rör og þurrkað við stofuhita í 3–5 mínútur; Miðflótta í 2 mínútur við 12000 snúninga á mínútu til að fá heildar DNA. Primers fyrir pólýmerasa keðjuverkun (PCR) voru byggðir á röðum sem greint var frá áður [4], [5]. PCR hvarfblöndur innihéldu 2-μL DNA sniðmát, 8.5-μL ddH2O, 12.5-μL 2× Taq PCR Master Mix (Beijing TransGen Biotech Co., Kína), 1/{ {57}}μL fram/aftur (F/R) grunnur (2,5 µM), í lokarúmmáli 25 µL. PCR mögnun var framkvæmd eins og lýst er af Kress et al. [4]. Grunnur PCR hvarfsins var fwd PA: GTTATGCATGAACGTAATGCTC (5′-3′) og rev TH: CGCGCATGGTGGATTCACAATCC (5′-3′). PCR afurðir voru aðskildar og greindar með 1 prósent agarósa gel rafdrætti. PCR vörur voru hreinsaðar í samræmi við samskiptareglur framleiðanda og beint undir raðgreiningu.

Röð röðun og greining

ITS og ITS2 röðum var safnað úr GenBank gagnagrunninum. Raðir úr raðgreiningu sýnanna voru sendar inn í GenBank gagnagrunninn (Aðgangsnúmer voru skráð í töflu 1), settar saman með CodonCode Aligner 3.7.1 (CodonCode Co., USA) og samræmdar með ClustalW. Kimura 2-Fjarlægðir færibreytu (K2P), GC innihald grunn- og nágrannatenginga (NJ) trjáa voru reiknuð út og smíðuð með MEGA 5.05 með Bootstrap aðferðinni (1000 endursýnatöku) og K2P líkani [27]. Strikamerkisbil (spacer svæði sem myndaðist á milli innan- og millisértækserfðafræðilegaafbrigði) og skilvirkni auðkenningar (geta auðkenningar til að bera saman mismunandi strikamerki) voru teiknuð og reiknuð út frá aðferðinni sem Meyer og Paulay greindu frá [28].

Niðurstöður

Bráðabirgðahámarksúthlutun UPLC-QTOF/MS

Sýndarmynd C. deserticola og C. tubulosa frá mismunandi framleiðslusvæðum eru sýnd á mynd 1. Fingrafaraskiljunin gaf til kynna líkindi meðalCistanchesHerba sýni. Alls greindust 23 hæfir massatoppar og 16 toppar voru auðkenndir með því að passa við varðveislutíma og massaróf við þær sem áður var greint frá (tafla 2) [29] - [35]. Toppar 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 15, 16, 17, 20, 21, 22 og 23 voru með semingi auðkenndir sem cistanoside F, mussaenoside acid, cistanbuloside C1/C2, campneoside , hverfa af campneoside II, echinacoside, cistanoside A, acteoside, isoacteoside, syringalide A-3′- -L-rhamnopyranoside, cistanoside C, 2'-acetylacteosid, osmanthuside B, cistanoside D, og ​​tubuloside D, cistancinenside A, í sömu röð.EfniÁkvörðuð var að innihaldsefnin væru fyrst og fremst fenýletanóíð glýkósíð (PhGs), en eitt efnasambandið, mussaenósíðsýra, var iridoid fjölsykra. PhGs eru helstu virku efnasamböndin hvað varðar meðferð á nýrnaskorti og andoxunarefni og taugaverndandi áhrif [36].

Mynd 1 Dæmigerð litskiljun C. deserticola og C. tubulosa.

Vinstra megin var litskiljun C. deserticola safnað frá mismunandi stöðum; hægra megin var litskiljun C. tubulosa safnað frá mismunandi stöðum. Þessi mynd sýnir muninn á þessum tveimur uppruna íefnisnið.

Tafla 2 Tilgreind efnasambönd frá C. deserticola og C. tubulosa með bráðabirgðatölum.

PCA af C. deserticola og C. tubulosa

PCA var notað til að greina sýni af mismunandi plöntutegundum. PCA er eftirlitslaus margbreytileg gagnagreiningaraðferð sem miðar að því að sjá líkindi og/eða mismun innan fjölþátta gagna samsetningar efri umbrotsefna [37]. Tveggja þátta PCA líkanið var uppsafnað fyrir 46,04 prósent af breytileikanum (PC1, 36,43 prósent; PC2, 9,61 prósent). Mynd 2 sýnir að 24 sýni voru flokkuð í tvo hópa í PCA stigunum sem teiknuð voru eftir uppruna tegunda, sem gefur til kynna að efnasamsetning C. deserticola og C. tubulosa hafi verið marktæk frábrugðin.

Mynd 2 PCA af C. deserticola og C. tubulosa.

Þessi sýni voru flokkuð í tvo hópa eftir uppruna tegunda sem benti til þess að efnasamsetning C. deserticola og C. tubulosa væri marktækt ólík.

OPLS-DA og auðkenning merkja

Til að greina möguleikaefnimerki fyrir mismunun tegundanna tveggja, S-reiturinn af OPLS-DA var myndaður (mynd 3). Í S-reitinu táknar hver punktur eitt tR–m/z jónapar. X og Y ásarnir tákna framlag og sjálfstraust jónarinnar, í sömu röð; því lengri fjarlægð sem jónin t R–m/z parið bendir frá núlli, því stærra er framlag/öryggi þessarar jónar til munarins á milli hópanna tveggja. Þannig táknar tR–m/z jónin sem vísar á tvo enda 'S' einkennandi merki með hæsta öryggi í hverjum hópi.

Mynd 3 OPLS-DA (S-mynd) af C. deserticola og C. tubulosa.

Eitt plot táknar eitt tR–m/z jónapar. Þessar ferningalóðir voruefnimerkjajónir sem fundust greina á milli tveggja uppruna. Ferningsreitir í þriðja fjórðungi voru efnamerkijónir með hærra framlag og öryggi í C. deserticola og ferningsreitir í fyrsta fjórðungi voru efnamerkisjónir með hærra framlag og öryggi í C. tubulosa.

OPLS-DA niðurstöður sýndu að hægt væri að nota UPLC-QTOF/MS til að greina C.deserticolafrá C.tubulosa(Mynd 3). Alls voru sex trúverðug og marktæk merki ákvörðuð til að auðvelda mismunun þessara hópa (tafla 3). Auðkenni þriggja hugsanlegra merkja var úthlutað með semingi. Þættirnir sem tengdust þessum þremur jónum voru með semingi auðkenndir sem hverfur af campneoside II, cistanoside C og cistanoside A. Hægt var að nota merkjasamböndin a, b og c til að greina plöntutegundirnar tvær, sem jónastyrkur a og b í C.deserticolavar hærra en í C. tubulosa (Mynd 4A, 4B), og merki c var hægt að greina í C. tubulosa, en ekki í C. deserticola (Mynd 4C).

Mynd 4 Jónastyrkur merkja a, b og c.

Jónastyrkur merkijóna a og b í C. deserticola var hærri en í C. Tubulosa og merkijónin c var hægt að greina í C. tubulosa en ekki í C. deserticola.

Tafla 3 Marer tR–m/z jónapör í S-reitinu.

DNA strikamerki: upplýsingar um röð og skilvirkni auðkenningar

Upplýsingar um röð komu fram í töflu 4. Meðaltalerfðafræðilegafjarlægð psbA-trnH (0.1732) var stærri en hin svæðin tvö (0.0740, 0,1197) verulega. Meðal GC innihald psbA-trnH (20,64 prósent) var minna en á hinum tveimur svæðunum (55.00 prósent, 55.00 prósent). Þrátt fyrir að árangur ITS og ITS2 hafi ekki náðst í þessari rannsókn, gekk psbA-trnH svæðið vel í PCR mögnun og raðgreiningu (100 prósent, 87,23 prósent). Skilvirkni auðkenningar náðist með BLAST1 greiningu og aðferð við næstu fjarlægð og endurspeglaði aðallega árangur strikamerkjanna. PsbA-trnH svæðið var greinilega hærra en hinir tveir strikamerkin í skilvirkni auðkenningar miðað við tvær aðferðir. Skortur á röðum er líklega ástæðan fyrir því að ITS-svæðið sýndi 100 prósent auðkenningarvirkni miðað við BLAST1 aðferðina og 0 miðað við aðferðina í næstu fjarlægð.

Tafla 4 Skilvirkni auðkenningar þriggja staðla með mismunandi aðferðum við tegundagreiningu.

Greining á erfðafræðilegum mismun með sex breytum

Sex færibreytur voru notaðar til að greina innansértæka breytileika og innbyrðis frávik með því að nota þrjú strikamerki (tafla 5). Marktækur munur á milli innbyrðis og innansértækra afbrigða var til marks um notagildi DNA strikamerkja. Hér var lágmarks millisértæk fjarlægð þriggja strikamerkja öll hærri en hámarks innansértæk fjarlægð. Þar að auki hafði psbA-trnH svæðið meiri hámarks innansértæka fjarlægð og meðaltal millisérhæfðra fjarlægð en hinir tveir strikamerkin, sem gefur til kynna að psbA-trnH svæðið hafi staðið sig vel við að greina á milli uppruna tveggjaCistanchesHerba.

Tafla 5 Greining á millikynssértækri mismunun og innansértækum breytingum þriggja strikamerkja.

Greining á strikamerkisbili til að bera kennsl á C. deserticola og C. tubulosa

Strikamerkisbilið sýnir ótrúlega breytileika milli tegunda og innan tegunda og sýnir aðskilda dreifingu sem ekki skarast á milli innan- og millisértækra sýna. Í þessari rannsókn (mynd 5) var fjarlægðarsviðið stillt á 0–0.45, vegna þess að mesta K2P fjarlægð psbA-trnH milli C. deserticola og C. tubulosa var nálægt { {11}}.45. Strikamerkin þrjú sýndu áberandi eyður í dreifingu á milli- og millisértækum breytileika. Ennfremur var bilið á psbA-trnH marktækt stærra en í hinum tveimur strikamerkjunum. Þess vegna gæti psbA-trnH svæðið verið tilvalið strikamerki til að greina á milli tveggja upprunaCistanchesHerba.

Mynd 5 Hlutfallsleg dreifing á millisértækum fráviki og millisértækum breytingum í þremur strikamerkjum.

Þrjú strikamerki fyrir ITS2, ITS, psbA-trnH voru greind með tilliti til hlutfallslegrar dreifingar á millisértækum fráviki og innansérhæfðum breytileika milli C. deserticola og C. tubulosa byggt á K2Perfðafræðilegafjarlægð.

Nágrannatengt (NJ) tré

NJ tré sýnir tengslin milli tegunda og auðveldar ákvörðun þyrpingar þeirra. Í þessari rannsókn var NJ tré af þremur strikamerkjum byggt á K2P líkaninu (mynd 6). Niðurstöðurnar sýndu fram á að tveir upprunaCistanchesHerba flokkaðist í tvær klæðar sérstaklega. Þannig greindi NJ tréð greinilega á milliC. deserticola og C. tubulosa.

Mynd 6 NJ tré af C. deserticola og C. tubulosa með þremur strikamerkjum.

NJ tré af C. deserticola og C. tubulosa með þremur strikamerkjum voru smíðuð. Skoðanir fyrir ræsiband (1000 endurtekningar) eru sýndar (meira en eða jafnt og 50 prósent) fyrir hverja grein. C. deserticola og C. tubulosa voru flokkaðar í tvær klæðar greinilega.

Umræður og ályktanir

CistanchesHerba er mikilvægt lækningaefni sem almennt er notað til að næra Asíusamfélagið [38]. Hins vegar hafa tveir upprunar Cistanches Herba, C. deserticola og C. tubulosa, mismunandi efnasamsetningu og lyfjafræðilega virkni í sömu röð. Samtímis eru þessir tveir upprunar ólíkir í klínískri notkun og hrávörumarkaði. Flokkunin áCistancheer ruglaður og stórfelldir staðgöngu- og hórdómsefni flæða yfir markaðinn vegna skorts á auðlindum og sérstöku vaxtarumhverfi fyrir Cistanches Herba. Ættkvísl Cistanche er samþykkt að innihalda fjórar tegundir og eitt afbrigði: C. deserticola, C. tubulosa, C. Sinensis, C. salsa og C. salsa var. albiflora [39]. Vísindamenn í Japan töldu uppruna Cistanches Herba sem C. salsa [40]–[43], á meðan það var auðkennt sem C. deserticola af Tu [44]–[46]. Þess vegna er það ruglað saman við flokkun Cistanche og það er erfitt að greina á milli tveggja uppruna Cistanches Herba.

Hefðbundnar aðferðir við gæðaeftirlit meðCistanchesHerba eru formfræðileg auðkenning [47], [48], smásjá auðkenning [49] og TLC (Thin-Layer Chromatography) [50], [51], FTIR (Fourier Transform Infrared Spectroscopy) [14], HPLC (High Performance Liquid Chromatography) ) [52], [53]. Formfræðilegar og smásæjar aðferðir geta auðveldlega greint tegundir frá mismunandi ættkvíslum eða fjölskyldum sem búa yfir miklum mun á formfræðilegum og smásæjum eiginleikum, á meðan erfitt er að greina systkinategundir. TLC og FTIR geta greinilega greint tegundir sem búa yfir mismunandi efnasamsetningu, en erfitt er að ákvarðaefnihluti og innihald. HPLC er aðallega notað til að greina tegundir með mismunandiefniinnihald frumefna, engu að síður er tími greiningar lengri og næmi er tiltölulega lægra miðað við UPLC. Að sama skapi var UPLC-QTOF/MS tæknin hraðari og nákvæmari við að ákvarða efnasamsetningu en aðrar efnafræðilegar aðferðir. Sameindagreiningaraðferðir sýna vel í mismunun byggða áerfðafræðilegaafbrigði, eins og SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis) [54], AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) [55], [56]. Hins vegar eru þessar sameindaaðferðir ekki auðveldar í notkun og eru ekki alhliða. Að sama skapi gæti DNA strikamerki greint tegundum á almennari, fljótari og nákvæmari hátt en aðrar sameindaaðferðir. Fyrir tegundir af sömu ættkvísl og nærrierfðafræðilegasamband, þá er ekki víst að þessar aðferðir einar og sér skili árangri við auðkenningu. Hér sameinuðum við UPLC-QTOF/MS og DNA strikamerki við að bera kennsl á C. deserticola og C. tubulosa og metum efna- og sameindamerkin sem myndu gera þeim kleift að mismuna þeim. 23 hæfir massatoppar fundust og 16 voru auðkenndir með því að nota UPLC–QTOF/MS, og í fyrsta lagi fundust þrjú möguleg merkjasambönd til að auðvelda aðgreiningu tveggja uppruna með PCA og OPLS-DA greiningu. Ennfremur voru fjórir vísbendingar metnir með DNA strikamerkjatækni með tilliti til getu þeirra til að greina á milli tveggja uppruna: Skilvirkni auðkenningar, erfðafræðilegrar skilvirkni, strikamerkisbils og NJ trégreiningar. PsbA-trnH svæðið var stutt sem hentugt DNA strikamerki til að greina á milli C. deserticola og C. tubulosa.

Að lokum stofnuðum við í fyrsta lagi nýja sameinda ogefnigreining-samsett aðferð til að mismuna og gæðaeftirlit í tveimur upprunaCistanchesHerba. DNA strikamerki getur greint á milli tveggja uppruna íerfðafræðilegabreyta og sannvotta tegundir alhliða og nákvæmlega; UPLC-QTOF/MS tækni getur greint efnasamsetningu til að meta gæði lyfjaefna hratt og nákvæmlega. Samsetta aðferðin við DNA strikamerki og UPLC-QTOF/MS tækni tryggja auðkenningu margra lyfjagjafa á nákvæmari og vísindalegri hátt og getur þjónað sem aðferð til að bera kennsl á aðrar ruglingslegar tegundir eða ættkvíslir í flokkun.

Fjármögnunaryfirlýsing

Rannsóknin var studd af styrkjum frá National Natural Science Foundation of China (nr. 81274013, vefsíða: www.nsfc.gov.cn). Fjármögnunaraðilar höfðu ekkert hlutverk í hönnun náms, gagnasöfnun og greiningu, ákvörðun um útgáfu eða gerð handritsins.

Heimildir

1. Tu PF, Lou ZC, Li SC, Wang CS, Jiang WY, o.fl. (1996) Samanburður á nýrnanæringu og yang sem styrkir virkni þriggja mismunandi tegunda af jurtumvegalengdir. Journal of Chinese medicinal materials 19: 420–421. [Google Scholar]

2. Zhang Y, Wu H, Wang SN, Zheng HC (1994) Samanburður á nýrnanærandi og yang-styrkjandi virkni þriggja mismunandi tegunda af herba cistanches. China Journal of Chinese Materia Medica 19: 169–171. [PubMed] [Google Scholar]

3. Lei L, Song ZH, Tu PF (2003) Framfarir í rannsóknum áefniinnihaldsefni í plöntum afCistancheHoffing. et Link. Kínversk hefðbundin og náttúrulyf 34: 473–476. [Google Scholar]

4. Yoshikawa M, Matsuda H, Morikawa T, Xie H, Nakamura S, o.fl. (2006) Phenylethanoid oligoglycosides og acylated oligosugars með æðaslakandi virkni frá Cistanche tubulosa. Bioorg Med Chem 14: 7468–7475. [PubMed] [Google Scholar]

5. Shimoda H, Tanaka J, Takahara Y, Takemoto K, Shan SJ, o.fl. (2009) Kólesteróllækkandi áhrif Cistanche tubulosa þykkni, kínversks hefðbundins hrályfs, í músum. Am J Chin Med 37: 1125–1138. [PubMed] [Google Scholar]

6. Yamada P, Iijima R, Han J, Shigemori H, Yokota S, o.fl. (2010) Hamlandi áhrif akteósíðs einangrað úrCistanchetubulosa áefnilosun miðlara og bólgueyðandi frumumyndun af RBL-2H3 og KU812 frumum. Planta Med, 1512–1518. [PubMed]

7. Morikawa T, Pan Y, Ninomiya K, Imura K, Matsuda H, et al. (2010) Asýleruð fenýletanóíð fáglýkósíð með lifrarverndandi virkni frá eyðimerkurplöntunniCistanchetubulosa. Bioorg Med Chem 18: 1882–1890. [PubMed] [Google Scholar]

8. Morikawa T, Pan Y, Ninomiya K, Imura K, Yuan D, o.fl. (2010) Iridoid og ósýklísk mónóterpen glýkósíð, kankanósíð L, M, N, O og P frá Cistanche tubulosa. Chem Pharm Bull (Tókýó) 58: 1403-1407. [PubMed] [Google Scholar]

9. He YP, Yin ZZ, Tu PF, Lou ZC (1997) Auðkenning og könnun á hráefni í atvinnuskyni af herba cistanchis. Journal of Chinese medicinal materials 20: 117–122. [PubMed] [Google Scholar]

10. Zhu SY (2001) Lyfjafræðileg auðkenning á Cistanche tubulosa sem er ruglað tegund afCistanchedeserticola. Journal of Chinese medicinal materials 24: 24–25. [PubMed] [Google Scholar]

11. Xu XQ, Ni H, Wei HY, Jia XG, Zhang BG, o.fl. (2013) Smásjá auðkenning þriggja herba cistanches í Xin Jiang. Shizhen Medicine and Materia Research 24: 881–883. [Google Scholar]

12. Zhang M, Fu XL, Wang SY (2004) Smásjá auðkenning á auglýsingum Herba Cistanches með stafrænni myndgreiningartækni. Journal of Chinese medicinal materials 27: 400–402. [PubMed] [Google Scholar]

13. Li JS, Yao ZQ, Yu MX (2000) Rannsókn á auðkenningu herbahellurog hórdómsmenn. Shizhen Medicine and Materia Research 11: 317–318. [Google Scholar]

14. Xu R, Sun SQ, Liu YG, Chen J, Liu TN, o.fl. (2010) FTIR og 2D-IR litrófsrannsóknir á mismunandi uppsprettum jurtahellur. Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi 30: 897–900. [PubMed] [Google Scholar]

15. Chen J, Sun SQ, Xu R, Liu YG, Yu J, o.fl. (2009) Auðkenning á Cistanche deserticola frá Boschniakla rossica og Cynomorium songaricum með FTIR og tvívíddar fylgni IR litrófsgreiningu. Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi 29: 1502–1507. [PubMed] [Google Scholar]

16. Yang HC, Xia PX, Huang JX, Yuan HZ (2008) Rannsókn á HPLC fingrafar afCistanchedeserticola. Pharm Care & Res 8: 255–257. [Google Scholar]

17. Xie JN, Zhao MB, Wu FW, Tu PF (2005) Litskiljun fingrafar af Cistanche deserticola með HPLC. Kínversk hefðbundin og náttúrulyf 36: 268–271. [Google Scholar]

18. Han JP, Song JY, Liu C, Chen J, Qian J, o.fl. (2010) Auðkenning áCistanchetegundir (Orobanchaceae) byggðar á röðum plastíðs psbA-trnH intergenic svæði. Acta Pharmaceutica Sinica 45: 126–130. [PubMed] [Google Scholar]

19. Shi HM, Wang J, Wang MY, Tu PF, Li XB (2009) Identification of Cistanche Species byEfniog Inter-simple Sequence Repeat Fingerprinting. Biol. Pharm. Naut. 32: 142–146. [PubMed] [Google Scholar]

20. Han LF, Yiadom MB, Liu EW, Zhang Y, Li W, o.fl. (2012) Uppbyggingareinkenni og auðkenning fenýletanóíð glýkósíða fráCistanchesdeserticola YC Ma eftir UHPLC/ESI-QTOF- MS/MS. Phytochemical analysis 23: 668-676. [PubMed] [Google Scholar]

21. Jiang X, Huang LF, Wu LB, Wang ZH, Chen SL (2012) UPLC-QTOF/MS Greining á alkalóíða í hefðbundnum unnum Coptis Chinensis Franch. Evid Based Complement Alternat Med 2012: 942384. [PMC ókeypis grein] [PubMed] [Google Scholar]

22. Wu LB, Jiang X, Huang LF, Chen SL (2013) Processing Technology Investigation of Loquat (Eriobotrya japonica) Leaf by Ultra-Performance Liquid Chromatography- Quadrupole Time-of-Flight Mass Spectrometry Combined with Chemometrics. PLoS ONE 8: e64178. [PMC ókeypis grein] [PubMed] [Google Scholar]

23. Hebert PD, Ratnasingham S, Waard JR (2003) Strikamerki dýralíf: cýtókróm c oxidasa undireining 1 mismunur meðal náskyldra tegunda. Frv. R. Soc. Lond. B. 270 Suppl 1S96–99. [PMC ókeypis grein] [PubMed] [Google Scholar]

24. Hebert PD, Cywinska A, Ball SL, Waard JR (2003) Líffræðileg auðkenni með DNA strikamerkjum. Proc Biol Sci., 270 313: 321. [PMC ókeypis grein] [PubMed] [Google Scholar]

25. Kress WJ, Wurdack KJ, Zimmer EA, Weigt LA, Janzen DH (2005) Notkun DNA strikamerkja til að bera kennsl á blómstrandi plöntur. Proc Natl Acad Sci. 102: 8369–8374. [PMC ókeypis grein] [PubMed] [Google Scholar]

26. Chen S, Yao H, Han J, Liu C, Song J, o.fl. (2010) Staðfesting á ITS2 svæðinu sem nýju DNA strikamerki til að auðkenna lækningajurtategundir. PLoS One 5: e8613. [PMC ókeypis grein] [PubMed] [Google Scholar]

27. Tamura K, Peterson D, Peterson N, Stecher G, Nei M, et al. (2011) MEGA5: Molecular EvolutionaryErfðafræðiGreining með hámarkslíkum, þróunarfjarlægð og hámarks sparsemisaðferðum. Mol Biol Evol 28: 2731-2739. [PMC ókeypis grein] [PubMed] [Google Scholar]

28. Meyer CP, Paulay G (2005) DNA strikamerki: villuhlutfall byggt á alhliða sýnatöku. PLoS Biol 3: e422. [PMC ókeypis grein] [PubMed] [Google Scholar]

29. Kobayashi H, Karasawa H, Miyase T, Fukushima S (1984) Studies on the Constituents Cistanchis Herba. IV. Einangrun og uppbygging tveggja nýrra fenýlprópanóíð glýkósíða, cistanosides C og D. Chem Pharm Bull 32: 3880–3885. [Google Scholar]

30. Kobayashi H, Karasawa H, Miyase T, Fukushima S (1985) Studies on the Constituents of Cistanchis Herba. VI. Einangrun og uppbygging nýs Iridoid Glycoside, 6-Deoxyeatalpol. Chem Pharm Bull 33: 3645-3650. [Google Scholar]

31. Jiang Y, Li SP, Wang YT, Chen XJ, Tu PF (2009) Differentiation of HerbaCistanchesmeð fingrafara með afkastamikilli vökvaskiljun – díóða fylkisgreining – massagreiningu. Journal of Chromatography A 1216: 2156–2162. [PubMed] [Google Scholar]

32. Han LF, Boakye YM, Liu E, Zhang Y, Li W, o.fl. (2012) Uppbyggingareinkenni og auðkenning á fenýletanóíð glýkósíðum frá Cistanches deserticola YC Ma eftir UHPLC/ESI–QTOF–MS/MS. Phytochem Anal 23: 668-676. [PubMed] [Google Scholar]

33. Li L, Tsao R, Yang R, Liu CM, Young JC, o.fl. (2008) Einangrun og hreinsun fenýletanóíð glýkósíða frá Cistanche deserticola með háhraða mótstraumsskiljun. Food Chemistry 108: 702–710. [PubMed] [Google Scholar]

34. Lu DY, Zhang JY, Yang ZY, Liu HM, Li S, o.fl. (2013) Megindleg greining áCistanchesHerba notar hágæða vökvaskiljun ásamt díóða fylkisgreiningu og háupplausnarmassagreiningu ásamt efnafræðilegum aðferðum. J Sep Sci 26: 1945–1952. [PubMed] [Google Scholar]

35. Kobayashi H, Karasawa H, Miyase T, Fukushima S (1985) Studies on the Constituents Cistanchis Herba. V. Einangrun og uppbygging tveggja nýrra fenýlprópanóíð glýkósíða, Cistanoside E og F. Chem Pharm Bull 33: 1452-1457. [Google Scholar]

36. Jiang Y, Tu PF (2009) Greining áefniinnihaldsefni í Cistanche tegundum. J Chromatogr A 1216: 1970–1979. [PubMed] [Google Scholar]

37. Masssart DL, Vandeginste BGM, Deming SN, Michotte Y, Kaufman L (1988) Gagnameðferð í vísindum og tækni. Efnafræði: kennslubók.

38. Huang LF, Zheng SH, Wu LB, Jiang X, Chen SL (2014) Vistgerðir afCistanchedeserticola byggt áefnisamsetningu og sameindaeiginleika. SCIENTIA SINICA Vitae 44: 318–328. [Google Scholar]

39. Tu PF, Jiang Y, Guo YH (2011) rannsóknir og þróun iðnaðar á herba cistanches. Journal of Chinese Pharmaceutical 46: 882–887. [Google Scholar]

40. Kobayashi H, Oguchi H, Takizawa, Miyase T, Ueno A, o.fl. (1987) Ný fenýletanóíð glýkósíð fráCistanchetubulosa (SCHRENK) krókur. f. I. Chem Pharm Bull 35: 3309-3314. [Google Scholar]

41. Kobayashi H, Karasawa H, Miyase T, Fukushima S (1984) Rannsóknir á innihaldsefnum Cistanchis herba III. Chem Pharm Bull 32: 3009-3014. [Google Scholar]

42. Kobayashi H, Karasawa H, Miyase T, Fukushima S (1984) Rannsóknir á innihaldsefnum Cistanchis herba IV. Chem Pharm Bull 32: 3880-3885. [Google Scholar]

43. Kobayashi H, Karasawa H, Miyase T, Fukushima S (1985) Rannsóknir á innihaldsefnum Cistanchis herba VI. Chem Pharm Bull 33: 3645-3650. [Google Scholar]

44. Moriya A, Tu PF, Karasawa D, Arima H, Deyama T, et al. (1995) Lyfjafræðilegar rannsóknir á Cistanchis Herba (I). Nat Med 49: 383–393. [Google Scholar]

45. Moriya A, Tu PF, Karasawa D, Arima H, Deyama T, o.fl. (1995) Lyfjafræðilegar rannsóknir á Cistanchis Herba (II). Nat Med 49: 394–400. [Google Scholar]

46. ​​Liu XM, Jiang Y, Sun YQ, Xu XW, Tu PF (2011) Rannsókn áefniefnisþáttum íCistanchedeserticola. Chin Pharm J 46: 1053-1058. [Google Scholar]

47. Gu XY, Wang X (2013) Auðkenning milli upprunalegu plantna RouCongRong og ruglaðra afbrigða. Western Journal of Traditional Chinese Medicine 26: 17–18. [Google Scholar]

48. Zhang HJ, Ding XF Auðkenning á Cistanche deserticola og hórdómsdýrum. Shizhen Medicine and Materia Research, 183.

49. Xu XQ, Ni H, Wei HY, Jia XG, Zhang BG, o.fl. (2013) smásæjar auðkenningarrannsóknir á þremur tegundum Cistanche komu frá Xinjiang héraði. Shizhen Medicine and Materia Research 24: 881–883. [Google Scholar]

50. Huang M, Liu G (2004) Auðkenningarrannsóknir áCistanchedeserticola og Cynomorium songaricum. HuBei tímarit um hefðbundna kínverska læknisfræði. 26:54–55. [Google Scholar]

51. Liu YG, Xu R, Wang W, Liu TN, Chen J (2009) Framfarir í rannsóknum á gæðaeftirliti og mati á Cistanche deserticola YC Ma. Heimsvísindi og tækni - Nútímavæðing hefðbundinnar kínverskrar læknisfræði. 11: 439–444. [Google Scholar]

52. Ma ZG (2011) Aðgreining á unnum Cistanche Sinensis G.Beck og Herba Cistanches með HPLC fingraförum. Haka. Pharm J. 46: 899–902. [Google Scholar]

53. Huang LX, Wang YE, Shi MH, Jia XG, Xie X, o.fl. (2011) HPLC fingrafararannsóknir áCistanchetubulosa. Xinjiang tímarit um hefðbundna kínverska læknisfræði. 29:54–56. [Google Scholar]

54. Chen P, Guo YH, Wang BM, Zhai ZX (2006) SDS-PAGE af leysanlegum próteinum í fjórum plöntum Cistanche Hoffing. Et Link. Kínversk hefðbundin og náttúrulyf 37: 1399–1402. [Google Scholar]

55. Xu R, Chen J, Chen SL, Liu TN, Na R (2007) AFLP Greining á fjölbreytileika kímplasmaauðlindar í ræktuðum og villtum Cistanche deserticola. Kínversk hefðbundin og náttúrulyf 38: 1703–1707. [Google Scholar]

56. Gan XY, Li M, Ma HA, Song YX (2011) Rannsókn á innansértækum breytingum áCistanchedeserticola YCMa með því að nota AFLP sameindamerki. Norræn garðyrkja, 141–143.

Greinar frá PLoS ONE eru veittar hér með leyfi almenningsbókasafns vísinda

PLoS One. 2014; 9(5): e98061.

Birt á netinu 2014 22. maí. doi: 10.1371/journal.pone.0098061

PMCID: PMC4031141

PMID: 24854031