MRNA bóluefni kallar fram STING-háð ónæmissvörun gegn æxli

Ágrip

Lípíð-samsett RNA bóluefni hafa verið mikið notuð til að koma í veg fyrir og meðhöndla sjúkdóma, en samt á eftir að skilgreina verkunarmáta þeirra og einstaka þætti sem stuðla að slíkum aðgerðum. Hér sýnum við að lækningakrabbameinsbóluefni sem samanstendur af prótamín/mRNA kjarna og lípíðskel er mjög öflugt til að stuðla að frumudrepandi CD8þ T frumuviðbrögðum og miðla ónæmi gegn æxli. Vélrænt séð er bæði mRNA kjarna og lípíðskel nauðsynleg til að örva tjáningu interferóna af tegund I og bólgusýtókína í dendritic frumum að fullu. Örvun á tjáningu interferóns er eingöngu háð STING og æxlishemjandi virkni frá mRNA bóluefninu er verulega skert hjá músum með gallað Sting gen. Þannig vekur mRNA bóluefnið STING-háð andæxlisónæmi.

cistanche ávinningur fyrir karla styrkir ónæmiskerfið

1. Inngangur

Hröð þróun og um allan heim beitingu mRNA bóluefna til að koma í veg fyrir SARS-CoV-2 sýkingu hefur sýnt fram á kraft lyfja sem byggjast á mRNA í heilbrigðisþjónustu1,2. Vegna mikillar mólþyngdar og neikvæðrar hleðslu þarf að pakka mRNA sameindum inn í flutningstæki til að komast í spendýrafrumur á áhrifaríkan hátt. Pökkun í nanómetra-stærð afhendingartæki hefur einnig þann ávinning að vernda mRNA sameindir gegn ensímniðurbroti. Margir afhendingarvettvangar hafa verið þróaðir til að henta tilganginum, svo sem lípíð nanóögn 4, lípó fjölplex (LPP) 5, lípósóm-prótamín-RNA (LPR) 6, RNA lípoplex (RNA-LPX) 7 og veirulík bóluefnisögn (VLVP) )8. Þó að hver vettvangur hafi sína einstöku uppbyggingu og samsetningu, innihalda flest farartæki jónísk lípíð sameind sem auðveldar mRNA pökkun og flótta mRNA sameinda frá endósómunum. Með velgengni fyrirbyggjandi bóluefna er almennt ljóst að hægt er að nota mRNA meðferð til að meðhöndla kannski flestar ef ekki allar sjúkdómategundir9e12. Reyndar hafa mRNA-undirstaða lækningakrabbameinsbóluefni verið rannsökuð í mörg ár13,14. Nýlegar framfarir í klínískum rannsóknum hafa einnig sýnt fram á notkunarmöguleika þeirra hjá völdum krabbameinssjúklingum15e17. Ólíkt peptíðkrabbameinsbóluefnum sem eru unnin með hjálparsameindum18e20, geta mRNA bóluefnisagnir einnig þjónað sem sjálfshjálparefni21.

Til dæmis getur tveggja þátta mRNA byggt krabbameinsbóluefni sem inniheldur frítt og prótamín fléttað mRNA einnig virkjað toll-like receptor 7 (TLR7) merki22. Hins vegar, með auknum áhyggjum af bráðum meðfæddum ónæmiseitrun frá nöktu mRNA, nota flestir rannsakendur og fyrirtæki breytt RNA til að forðast meðfædda viðurkenningu TLRs23. Þar af leiðandi gegna lípíðhlutarnir mikilvægu hlutverki við að auka hjálparvirkni í mRNA bóluefnisögninni, helst með því að virkja boð sem ekki eru TLR. Nýleg rannsókn á lípíð-samsettu, neikvætt hlaðna RNA-LPX sem samanstendur af 1,2- dí-oktadesenýl-3-trímetýlammóníum (DOTMA, katjónískt lípíð)/díóleýlfosfatidýletanólamín (DOPE, hjálparlípíð) fitukorn leiddi í ljós. virkjun interleukin 1 (IL1)-interleukin 1 viðtaka mótlyfja (IL-1ra) áss við að stjórna seytingu bólgueyðandi frumudrepna og mikilvægu hlutverki þess að virkja tveggja þrepa bólguferilinn í einfrumu24. Athyglisvert er að önnur nýleg rannsókn á BNT162b2 sem byggir á LNP sem er unnin með ALC-0315 (jónað lípíð), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfókólín (DSPC, hjálparlípíð) , pólýetýlen glýkól-2000-N, N-di tetradecyl asetamíð (PEG2000-DTA), og kólesteról sýndu lykilhlutverkið við að virkja interferónháð MDA5 merki af tegund I, en ekki TLR eða inflammasome, við að örva bæði meðfædd og aðlagandi ónæmi COVID-19 bóluefnisins25. Þessar rannsóknir benda á þann möguleika að afhendingarvettvangar sem samanstanda af breytilegum lípíðsameindum geti reitt sig á mismunandi merkjaflutningsleiðir fyrir virkni bóluefnisins. Þess vegna er mikilvægt að rannsaka til hlítar virkni lykilsameinda og samsetningar þeirra til að bæta mRNA meðferðina enn frekar.

Í núverandi rannsókn settum við upp tilraunir til að kryfja starfrænt hlutverk einstakra íhluta í lækningakrabbameinsbóluefni. mRNA bóluefnisögnin (MVP) er samsett úr prótamín/mRNA kjarna sem er hjúpaður í lípíðskel sem samanstendur af katjónískum lípíði, hjálparlípíði, pegýleruðu lípíði og kólesteróli (mynd 1A). Sýnt hefur verið fram á að innlimun hlaðins lípíðs getur auðveldað markvissa afhendingu RNA26 og díóleóýletýl fosfatidýlkólín (EDOPC) og díólýl-3- trímetýlammóníum própan (DOTAP) eru tvö af katjónískum lípíðum sem hafa verið prófuð í þessum tilgangi5,27. Við skoðuðum örvun tjáningar interferóns-b (IFN-b), IL-1b og æxlisdrepsþáttar-a (TNF-a) með mRNA kjarna, mRNA-fríu burðarefni og öllu MVP, og tengdi slíka virkni við TLR7, hvatbera veiruhemjandi boðefni (MAVS, einnig þekkt sem IPS-1), örvandi IFN gena (STING), og millistykki sem inniheldur TIR lén sem framkallar IFN-b (TRIF) boð. Í kjölfarið könnuðum við hlutverk prótamíns í kjarnanum og katjónískt lípíð í skelinni við að örva IFN-b og TNF-a tjáningu. Að lokum bárum við saman ónæmissvörun gegn æxli frá MVP í villigerð og gen-knockout músum.

Kostir cistanche tubulosa-antitumor

2. Efni og aðferðir

2.1. Efni

1,2-díólóýl-sn-glýseró-3-etýlfosfókólín (EDOPC) (890704), 1,2-díólóýl-sn-glýseró-3-fosfatidýletanólamín (DOPE) (850725) ), 1,2-dístearóýl-sn-glýseró-3-fosfóetanólamín-N- [amínó(pólýetýlen glýkól)-2000 (DSPE-PEG2k) (880128), 1,2- díóleóýl-3-trímetýlammoníum-própan (DOTAP) (890890), 1,2- díólýl-sn-glýseró-3-fosfókólín (DOPC) (850375) voru keypt frá Avanti Polar Lipids, Inc. ( Birmingham, AL, Bandaríkjunum). Kólesteról (C8667) var fengið frá Sigma-Aldrich (Saint Louis, MO, Bandaríkjunum). Hvarfefnin voru leyst upp í etanóli í styrkleikanum 2 mg/ml fyrir DSPE-PEG2k, 10 mg/ml fyrir kólesteról og DOPC, og 20 mg/ml fyrir EDOPC, DOPE og DOTAP, í sömu röð. Prótamín súlfat (P4020) var fengið frá Sigma Aldrich. mRNA sameindir sem kóða ovalbumin (OVA-mRNA) (L-7210), eGFP (eGFP mRNA) (L-7201) og luciferasa (Luc-mRNA) (L-7204) voru keyptar frá TriLink líftækni (San Diego, CA, Bandaríkin). RNase-frítt vatn (W0805-010) var fengið frá GeneDEPOT (Baker, TX, Bandaríkjunum). TLR7 örvandi imiquimod (tlrimq) og Sting örvandi 20 30 - cGAMP (tlrl-nacga23) voru vörur frá Invivogen (San Diego, CA, Bandaríkjunum). Lipofectamine 2000 (11668019) og Quant-iT™ RiboGreen™ RNA prófunarsett (R11490) voru keypt frá Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, Bandaríkjunum). Raðbrigða mús GM-CSF (554586) var keypt frá BD Biosciences (San Diego, CA, Bandaríkjunum). 500 Protein transporter inhibitor kokteil (00-4980-93) var vara frá Invitrogen. Cytofix/Cytoperm Kit (AB_2869010) var keypt frá BD Biosciences. EasySep™ Mouse T Cell Isolation Kit (19851) var fengið frá STEMCELL Technologies, Inc. (Vancouver, BC, CAN). Eftirfarandi mótefni voru fengin frá BioLegend (San Diego, CA, Bandaríkjunum): and-CD80-PE-Cy7 (104734), and-CD86-FITC (105006), and-CD11b-APC- Cy7 (101226), and-CD8-BV510 (100752), and-CD44-APC (103012), and-CD69-APC (104514) og and-H{{89 }}Kb (SIINFEKL)-PE (141604), and-CD64- PE-Cy7 (139314), and-B220-APC (103212), and-MHCII-BV711 (107643) og and-CD103-PE (121406). And-CD40-FITC (553723), and-LY6C-AF700 (557979) og and-IFN-g-PE (554412) voru frá BD Biosciences. OVA257e264-MHCI dextramerPE (JD2163) var keypt frá ImmuDex (Fairfax, VA, Bandaríkjunum). ELISA sett fyrir IL-1b (EM2IL1B) og TNF-a (BMS607-3) voru keypt frá Invitrogen og ELISA sett fyrir CCL5 (DY478) og IFN-b (DY8234) voru fengin frá R&D Systems , Inc. (Minneapolis, MN, Bandaríkjunum). Mótefni fyrir Western blot greiningu, þar á meðal and-MAVS (4983), and-STING (13647), and-TBK1 (3504), andphospho-TBK1 (5483), and-b-actin (4970), and and-GAPDH (5174) voru keyptir frá Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, Bandaríkjunum).

Mynd 1 Undirbúningur og einkenni mRNA agna. (A) Skýringarmynd af undirbúningi bóluefnisagna. (B) Agarósa hlaup rafskaut sýnir að mRNA sameindir voru geymdar í sýnishleðslu brunninum í sýnum sem voru útbúin með mRNA/prótamíni í hlutfallinu 1:1 til 1:2. (CeF) Einkenni mRNA bóluefnisagna (MVP) byggt á hlutfalli hjúpunar, fjöldreifingarstuðuls, zeta-getu og stærð. (G) Fulltrúar TEM myndir af MVP2 ögnum, mælikvarða Z 50 nm. (H) Hlutfall eGFP tjáningar eftir að DC2.4 frumur voru meðhöndlaðar með eGFP-MVP í 16 klst. (I) Flúrljómun af DC2.4 frumum sem tjá eGFP, mælistiku Z 400 mm. (J) Magngreining á lífljómun í BMDCs meðhöndluð með MVPs hjúpuð með luciferasa-kóða mRNA í 16 klst. (K) Breytingar á lífvænleika BMDC sem eru meðhöndlaðir með PBS, mRNA-fríu burðarefni, mRNA/prótamínkjarna eða mRNA-hjúpuðu MVP2. Meðferðarþéttni var mRNA-jafngildi. Gögn eru sett fram sem meðal SEM (n Z 3). *P < 0,05; **P < 0,01.

2.2. Frumulínur og frumuræktun

DC2.4 murine dendritic frumulínan var fengin frá ATCC (Manassas, VA, USA) og var ræktuð í RPMI-1640 sem innihélt 10% nautgripafóstursermi (FBS) og 1% penicillín-streptomycin. Músa sortuæxlisfrumulína B16-OVA var keypt frá Dr. Kenneth Rock, Dana-Farber Cancer Institute (Boston, MA, Bandaríkjunum). B16-OVA frumur voru ræktaðar í DMEM ásamt 10% FBS og 1% penicillín-streptomycini. Murine ristilkirtilkrabbameinsfrumulína MC38 var keypt frá ATCC. Frumur voru gerðar með OVA tjáningu og voru ræktaðar í DMEM með 10% FBS og 1% penicillín-streptomycini. Frumurækt var haldið við 37 C með 5% CO2.

cistanche tubulosa-bæta ónæmiskerfið

2.3. undirbúningur mRNA bóluefnisagna

Allar mRNA bóluefnisagnir voru útbúnar með því að nota NanoAssemblr Benchtop örvökvatæki frá Precision Nanosystems, Inc., (Vancouver, BC, CAN) með því að blanda lífræna fasanum og vatnsfasanum. Til að undirbúa lífræna fasann voru EDOPC (20 mg/ml), DOPE (20 mg/ml), kólesteról (10 mg/ml) og bis-DSPE-PEG2k (2 mg/ml) leyst upp í etanóli og blandað við 34°C. :30:35:1 M hlutfall með flæðihraða 9 ml/mín. Til að undirbúa vatnsfasa mRNA kjarnann var mRNA blandað saman við prótamínsúlfat í 1:1 (w/w) í örvökvatækinu með flæðihraða 9 mL/mín. Eftir 20 mín ræktun við 20 C var vatnsfasa mRNA kjarnanum blandað saman við lífræna fasann til að mynda mRNA bóluefni agnir. Eftir 20 mínútur var bóluefnisagnasviflausnin færð yfir í Amicon ofur miðflótta síu (MWCO 30 kDa) og 9-rúmmálsvatni af sameindagráðu var bætt við til að þynna styrk etanóls úr 25% í 2,5%. Agnasviflausnin var síðan þétt með skilvindu við 2000 g (Multifuge X4, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) við 4 C. Jafnt rúmmál af 2 PBS var bætt við þétta vöruna til að stilla osmósuþrýstinginn.

2.4. Hlaupþrengingarpróf

mRNA/prótamín kjarninn var fyrst greindur með hlaupskerðingu. Í stuttu máli var mRNA/prótamínkjarna sem innihélt 0,5 mg af mRNA hlaðið í brunninn á 1% agarósa hlaupi í 1 TBE lausn og rafskaut var framkvæmd við 120 V í 30 mínútur (PowerPac™, BioRad Co., Ltd., Hercules, CA). RNA bönd voru lituð með Gelred (Biotium, Hayward, CA) og greind með GelDoc kerfi (Gel Doc XRþ, BioRad Co., Ltd.).

2.5. Einkenni mRNA bóluefnisagna

Stærðardreifing og zeta möguleiki voru mæld með kraftmikilli ljósdreifingu Zetasizer (Zetasizer Nano, Malvern Pananalytical, Inc., Westborough, MA, Bandaríkjunum). Hraði umhlífarinnar var ákvarðaður með því að nota Quant-iT™ RiboGreen™ RNA prófunarbúnað. Í stuttu máli var bóluefnisagnasýni sem innihélt 0,5 mg af mRNA þynnt með TriseEDTA jafnalausn (10 mmól/L TriseHCl, 1 mmól/L EDTA, pH 7,5) með eða án 2% Triton-X100 í { {10}}brunnsplata. Eftir 10 mín ræktun við 37 C var RiboGreen bætt í hvern brunn og styrkleiki flúrljómunar mældur. Hjúpun skilvirkni var reiknuð eins og sýnt er í jöfnuði. (1): Sendingarrafeindasmásjárskoðun (TEM) á bóluefnisagnum var framkvæmd eftir áður lýstri aðferð9.

2.6. Dýr

Allar dýraaðgerðir voru samþykktar af dýraumönnunar- og notkunarnefnd Houston Methodist Hospital (samskiptanúmer AUP06200042). Mýs voru geymdar í umhverfi sem uppfyllti fullkomlega eftirlitsstaðla National Institute of Health og American Association of Laboratory Animal Care staðla. Villigerð C57BL/6J mýs og erfðabreyttar mýs þar á meðal Tlr7 /, Sting /, Mavs / og Trif / mýs voru keyptar frá Jackson Laboratory.

2.7. Myndun beinmergsfrumna úr músum (BMDC)

Beinmergsfrumur voru skolaðar út úr lærlegg og sköflungi með fullkomnu RPMI 1640. Rauð blóðkorn voru greind með ACK lýsisbuffi og óþroskaðar beinmergsfrumur voru ræktaðar í RPMI 1640 ásamt 20 ng/ml raðbrigða músa GM-CSF fyrir 10 daga við 37 C með 5% CO2. Frumuræktunarmiðill var endurnærður á 3., 6. og 8. degi og óviðloðandi dendritfrumum var safnað á 10. degi.

2.8. Mælingar á cýtókínum og chemokínum

BMDC var sáð í 24-brunnsplötu með þéttleika 5  105 frumna/holu. Eftir 1 klst af uppgjöri voru frumur meðhöndlaðar með 1 mg/ml imiquimod, 20 mg/ml 20 30 -cGAMP, (1 mg/ml mRNA jafngildi) bóluefnisögnum eða viðmiðum. Frumuræktunarmiðlum var safnað 24 klst. síðar og magn TNF-a, CCL5, IFN-b og IL-1b var mælt með því að nota ensímtengd ónæmissogandi prófunarsett (ELISA) með því að fylgja leiðbeiningum frá framleiðanda.

cistanche plöntuaukning ónæmiskerfi

2.9. Greinir á DC transfection, DC þroska og örvun

Til að greina DC transfection skilvirkni in vitro voru DC2.4 frumur sáð í 2.5 105 frumur/brunn í 24-brunnsplötu. Frumur voru meðhöndlaðar með eGFP- eða luciferasa-kóða mRNA-hjúpuðum ögnum í lokastyrk 1 mg mRNA/ml. Frumur voru teknar 24 klst. síðar, þvegnar með 2% FBS í PBS lausn og síðan endursviflausnar í sömu lausn áður en þær voru notaðar fyrir frumuflæðisgreiningu með BD LSR II flæðifrumumæli (LSR II, BD Biosciences, San Jose, CA) . Til að mæla DC þroska og framsetningu mótefnavaka in vitro voru BMDCs sáð í 2.5  105 frumur/holu í 24-brunnsplötu og meðhöndluð með 1 mg/ml OVA-MVP í 24 klst. BMDCs voru lituð í 30 mínútur með mótefnum sem eru sértæk fyrir CD11c, MHC I, MHC II, CD40, CD80 og CD86 fyrir DC-þroska, og and-H-2Kb (SIINFEKL) fyrir mótefnavakakynningu. Til að ákvarða örvandi virkni in vivo voru C57BL/6J mýs bólusettar einu sinni með 10 mg af OVA-MVP í hverri mús í fótpúðanum og tæmandi popliteal LNs voru safnað 24, 48 og eftirfarandi frumuyfirborðsmerki: CD11c, MHC I, CD11b, B220 , LY6C, CD64, CD8, CD103, CD86.

2.10. Flæðifrumumælingar á virkjun og fjölgun T-frumna

Til að mæla virkjun T-frumna in vivo, voru mýs bólusettar einu sinni með 10 mg af OVA-MVP og LNs í hnébeina voru einangruð eftir 24 eða 48 klst. T frumur voru litaðar með eftirfarandi mótefnum: CD45, CD3, CD4, CD8 og CD69. Til að greina mótefnavaka-sértækar T-frumur, voru æxli, milta og hvolfseitlar safnað 5 dögum eftir seinni bólusetninguna. Vefjar voru unnar til að mynda einfrumu sviflausnir og frumur voru litaðar með T-frumu-sértækum mótefnum og OVA257e264-MHCI dextramer samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. Til að mæla innanfrumu IFN-g magn, voru 2  106 miltisfrumur eða frumur einangraðar úr LNs í hnébeina og æxlum örvaðar með 10 mg/mL OVA257e264 peptíði í fullkomnu RPMI 1640 miðli bætt við 55 mmól/L b-merkaptóetanóli og 1 próteinflutningshemli kokteill í 18 klst. Frumur voru teknar og litaðar með T-frumu-sértækum mótefnum. Eftir festingu og gegndræpi með Cytofix/Cytoperm setti voru frumur litaðar með and-IFN-g mótefni og sóttar til greiningar á BD LSR II flæðifrumumæli (BD Biosciences). Til að mæla útbreiðslu T-frumna voru T-frumur einangraðar úr milta OT-I erfðabreyttra músa með því að nota T-frumueinangrunarsett úr músum. Þær voru litaðar með 1 mmól/L CFSE í RPMI 1640 sem innihélt 200 mg/ml BSA í 10 mínútur við 37 C. CFSE merktar T frumur voru þvegnar tvisvar með 5 bindum af köldu fullkomnu RPMI 1640. Í millitíðinni voru þroskaðir BMDCs meðhöndlaðir með 2 mg/ml OVA mRNA-hjúpað MVP í 24 klst fyrir T-frumueinangrun. Þegar T frumur voru tilbúnar voru BMDC og T frumur ræktaðar saman í hlutfallinu 1:5 (DC:T) í 72 klst. Frumum var safnað og litað með yfirborðsmótefnum fyrir T frumum, fjölgunin var prófuð með BD LSR II flæðifrumumæli (BD Biosciences) og greind. Allar niðurstöður flæðifrumumælinga voru greindar með FlowJo v10 hugbúnaðinum (Ashland, OH, Bandaríkjunum).

2.11. Rekja prótein tjáningu í lifandi músum

BALB/c mýs voru meðhöndluð með inndælingu í fótpúða með 10 mg af Luc mRNA-hjúpuðu MVP. Þeim var sprautað í kviðarhol með 30 mg af RediJect D-luciferin á mús 6, 12, 24 eða 48 klst. síðar og lífljómun var mæld með Xenogen IVIS-200 myndgreiningarkerfinu (Caliper Life Sciences, Inc., Hopkinton, MA, Bandaríkjunum).

2.12. ELISpot prófun

IP síuplötur voru skolaðar með 50 ml af 35% etanóli og skolaðar vandlega þrisvar sinnum með PBS áður en etanólið gufaði upp. Plöturnar voru síðan húðaðar með and-IFN-g fanga mótefnum við 4 C yfir nótt. Plöturnar voru stíflaðar með RPMI 1640 fullkomnum miðli sem innihélt 55 mmól/L b-merkaptóetanól í 2 klst við 37 C. Frumum (1  105 miltfrumur, 1  105 frumur úr LN í hnakkapípum) var sáð í hvern brunn og örvað í 36 klst með 10 mg/ml OVA257e264 peptíði. Miðlum var hent og frumur voru þvegnar 4 sinnum með PBST (PBS sem inniheldur 0,05% Tween 20) og tvisvar með PBS. Eftir lokaþvottinn var and-IFN-g greiningarmótefni bætt við og ræktað í 2 klst við stofuhita í myrkri. Plötur voru þvegnar 4 sinnum með PBST og tvisvar með PBS, og avidin-HRP var bætt við og ræktað í aðrar 45 mínútur við stofuhita í myrkri. Að lokum voru plöturnar þvegnar með PBST og PBS aftur eins og lýst er hér að ofan, og 50 mL af AEC hvarfefni var sett á og fylgst með blettaviðbrögðum. Þegar blettir komu í ljós var hvarfið stöðvað með því að farga AEC undirlaginu og skola það með tvöföldu eimuðu vatni 5 sinnum. Eftir loftþurrkun yfir nótt voru plöturnar skannaðar og greindar með CTL ImmunoSpot SeriesS5 Versa ELISpot Analyzer (S5Versa-02- 9038, CTL Inc., Cleveland, OH, Bandaríkjunum).

2.13. Western blot greining

BMDCs unnin úr villigerð, Mavs KO eða Sting KO músum var safnað og frumur voru leystar í RIPA frumulýsubuffi sem bætt var við próteasa og fosfatasa hemlum. Próteinstyrkur í frumulýsi var mældur með BCA próteingreiningarsetti. Próteinsýni voru aðskilin með natríumdódecýlsúlfat-pólýakrýlamíð gel rafdrætti (SDS-PAGE) og flutt yfir á pólývínýlíden tvíflúoríð (PVDF) himnu. MAVS og STING tjáning greindist eftir að himnan var ræktuð með and-MAVS eða and-STING mótefni í 1:2000 þynningu og síðan ónæmisgreining með SuperSignal West Pico og Femto Chemiluminescent Substrate. Til að mæla virkjun STING ferilsins voru BMDCs fengnar úr villigerðum músum meðhöndlaðir með burðarefni eða OVA mRNA-hjúpuðu MVP við tilgreindan styrk í 2 klst. Frumur voru ljósaðar og haldið áfram í Western blot greiningu með and-TBK1 og andphospho-TBK1 mótefnum í 1:2000 þynningu.

2.14. Æxlismæling

Músæxlislíkön voru mynduð með því að sáð 2  105 frumur B16-OVA sortuæxlisfrumur eða 5  105 MC38-OVA frumur á mús undir húð í vinstri hlið 6 til {{5} }vikugamlar kvenkyns C57BL/6J mýs. Músum var skipt af handahófi í meðferðarhópa og meðhöndlaðar tvisvar sinnum aðskildar með 7 daga með 10 mg af OVA MVP eða viðmiðum í fótpúðanum. Fylgst var með æxlisvexti á 2ja daga fresti. Æxlisrúmmál var reiknað samkvæmt jöfnuði. (2):

Mýsnar voru aflífaðar 5 dögum eftir seinni bólusetninguna og þyngd æxlisvefja skráð.

2.15. tölfræðigreining

Allar niðurstöður eru settar fram sem meðal SEM. Tölfræði var metin með einstefnu ANOVA prófi með Tukey's leiðréttingu fyrir samanburð á mörgum hópum og óparuðu tvíhliða t-prófi fyrir tveggja hópa samanburð. Gögnin voru greind með GraphPad Prism v8.0.2 hugbúnaðinum. P < 0.{{10}}5 var talið tölfræðilega marktækt (*P < 0.05; **P < 0,01; ***P < 0,005; ****P < 0,001).

3. Úrslit

3.1. MVP miðlar öflugri mRNA tjáningu í dendritic frumum (DC)

Við undirbúin kjarna-skel bóluefni agnir í tveggja þrepa ör-vökva nálgun (Mynd 1A), og kerfisbundið metin einstaka þætti í nanóögninni til að setja saman bóluefni ögn með miklum stöðugleika, hár frumuupptöku, og hár tjáningarmöguleika í DCs. Gel rafskaut leiddi í ljós að stöðugur mRNA kjarna gæti myndast þegar mRNA og prótamín hlutfall var 1 eða lægra (mynd 1B). Með því að nota eGFP-kóða mRNA sem staðgöngumerki komumst við að því að lípíðsamsetning í mólhlutfallinu 34% EDOPC/30% DOPE/35% kólesteról/1% DSPEPEG2k veitti ákjósanlegan hjúpunarhraða og bestu tjáningarskilvirkni (tafla 1, Stuðningsupplýsingar mynd S1AeS1D). Breyting hleðsluhlutfalls breytti ekki marktækt hleðsluhraða, fjöldreifingarvísitölu eða yfirborðshleðslu agnanna (tafla 2, mynd 1CeE); þó var stærð agnanna sem myndaðist á milli 70 og 80 nm í þvermál þegar hlutfallið var á milli 12 og 16, samanborið við þvermál 120e130 nm þegar hlutfallið féll út fyrir svið (mynd 1F og G). Besta tjáningin greindist í DC2.4 frumum sem voru meðhöndlaðar með MVP2 sem höfðu hleðsluhlutfallið 12 (mynd 1H og I). Svipað mynstur kom fram þegar agnir voru útbúnar með mRNA sem kóðar lúsiferasa og skammtaháð tjáning greindist (mynd 1J). MRNA-hjúpaðar agnirnar sýndu æskilegan stöðugleika þar sem þær misstu ekki virkni eftir frostþurrkun eða frostþíða (mynd S1E og S1F). Að auki var engin frumueiturhrif eftir að beinmerg-afleiddar dendritic frumur (BMDCs) voru meðhöndlaðar með mRNA kjarna eingöngu, burðarefni ögn sem er útbúin án mRNA sameinda, eða mRNA sem inniheldur MVP2 (mynd 1K). Þannig sýndi MVP2 bestu tjáningarmöguleikann. Það var notað fyrir allar frekari tilraunir í rannsókninni og merkt sem MVP í restinni af textanum. MVP agnirnar gátu í raun skilað mRNA sameindum in vivo og engar greinanlegar eiturverkanir voru frá mRNA-hjúpuðu MVP byggt á líkamsþyngdarbreytingum (mynd S1GeS1I).

3.2. MVP framkallar á áhrifaríkan hátt mótefnavakakynningu og virkjun T-frumna in vitro og in vivo

Við útbjuggum mRNA kjarna, mRNA-frjáls burðarefni og OVA mRNA hjúpað MVP og beittum þeim til að prófa DC þroska og mótefnavaka kynningu (mynd 2A). BMDCs sem voru meðhöndlaðir með MVP sýndu skammtaháða oftjáningu á DC þroskamerkjum þar á meðal CD40, CD80 og CD86 (mynd 2BeD). Meðferð með annaðhvort mRNA-lausu burðarefninu eða mRNA-hjúpuðu MVP kveikti MHC I oftjáningu (Mynd 2E), sem gefur til kynna að áhrifin hafi verið tengd burðarefninu frekar en mRNA-komplexinu. Að auki leiddi MVP meðferð til frumuyfirborðs birtingar OVA257e264 mótefnavaka epitope-MHC I flókið (SIINFEKL-MHC I) sem greindist með and-SIINFEKL-MHCI mótefni (mynd 2F), sem sýnir árangursríka mótefnavakavinnslu og framsetningu BMDCs. . Ennfremur, samræktun MVP-meðhöndlaðra BMDCs með B3Z, CD8þ T frumulínu sem þekkti sérstaklega OVA257e264 epitope, eða T frumur einangraðar úr milta OT-I músar sem tjáði OVA257e264-sértæka T frumu viðtaka, kveikti IL-2 seytingu, afleiðing sem ekki sést í T-frumum samhliða DC sem meðhöndlaðar voru með burðarefni eingöngu eða mRNA/prótamínkjarna einum saman (mynd 2G). Flæðifrumumæling greindi 32,5% fjölgun CD8þ T frumur eftir samræktun með MVP (mynd 2H og I). OVA mRNA-hjúpaðar MVP agnir voru einnig notaðar til að meðhöndla mýs með inndælingu í húð. Athugun á frumum í tæmandi eitlum leiddi í ljós stöðuga aukningu á CD86 tjáningu meðal bæði klassískra DCs (CD8þ DC, CD11bþ DC, CD103þ DC) og plasmacytoid DCs (pDC) á fyrstu 48 klst., sem bendir til örvunar DC þroska (mynd 2J). Meðferð stuðlaði einnig að auðgun CD8þ T-frumna í eitlum, með marktækri aukningu á þýði CD69þCD8þ T-frumna (mynd 2K og L), sem bendir til virkjunar T-frumna við meðferðina. Til að ákvarða virkjun T-frumna, söfnuðum við frumum í tæmandi eitlum 3, 5 eða 7 dögum eftir MVP meðferð og gerðum ELISpot greiningar eftir að frumur voru ögraðar með OVA257e264 mótefnavaka peptíðinu (stuðningsupplýsingar mynd S2). MVP meðferð kveikti stórt stökk í IFN-g-seytandi frumum á tímabilinu, með hámarksvirkni á degi 5 (mynd 2M). Þessar niðurstöður sýndu öfluga DC örvun, mótefnavakakynningu og T-frumuvirkjun eftir meðferð með MVP.

Tafla 1 Samsetning nanóagna sem eru hjúpaðar með eGFP-kóða mRNA.

Tafla 2Fitusamsetning og hleðsluhlutfall MVPeindir.

3.3. MVP vekur öflugt ónæmi gegn æxli í músalíkönum af ristilæxli og sortuæxlum

MVP var notað til að meðhöndla mýs með MC38 ristilkrabbameini og B16 sortuæxli. Í báðum gerðum lokaði meðferð með OVA mRNA hjúpuðu MVP tvisvar algjörlega æxlisvöxt undir húð; til samanburðar hafði meðferð með eGFP mRNA hjúpuðu MVP eða burðarefni eitt sér ekki nein greinanleg hamlandi áhrif á æxlisvöxt (Mynd 3AeD, Stuðningsupplýsingar Fig. S3). Í samræmi við mynstur CD4 til CD8 breytinga í eitlum (mynd 2), sáum við aukningu á CD8þ/CD4þ T frumuhlutfalli í æxlum úr músum sem voru meðhöndlaðir með OVA mRNA hjúpuðu MVP (Mynd 3E). Að auki fundum við hækkuð magn í IFN-gþCD8þ T-frumum í milta, eitlum og æxlum í músum sem fengu OVA mRNA-hjúpað MVP, en ekki með burðarefni einu sér eða GFP mRNA-hjúpað MVP (Mynd 3FeH, Stuðningsupplýsingar mynd S4). Ennfremur var marktæk aukning á OVA257e264-MHCI dextramer-jákvæðum CD8þ T-frumum í æxlum úr OVA mRNA-hjúpuðum MVP meðferðarhópnum sem bendir til fjölgunar mótefnavaka-sértækra CD8þ T-frumna (mynd 3I). ELISpot prófun með frumum einangruðum úr milta og eitlum veitti frekari stuðning við virkjun T-frumna (mynd 3JeM).

3.4. MVP örvar meðfædd ónæmissvörun með því að virkja STING-háð boð

Við notuðum mRNA kjarna, mRNA-frítt burðarefni og mRNA hjúpað MVP til að meðhöndla BMDC til að bera kennsl á lykilþætti og leiðir sem bera ábyrgð á örvun á tegund I IFN og bólgutjáningu cýtókína. Athyglisvert er að MVP var eins öflugt og Tlr7 örvandi imiquimod til að koma IFN-b seytingu af stað og burðarefnið eitt og sér sýndi einnig virkni við að ýta undir IFN-b seytingu, þó að virkni þess væri ekki eins mikil og MVP; hins vegar var mRNA kjarninn einn árangurslaus til að örva IFN-b seytingu (mynd 4A). Niðurstaðan gaf í skyn að bæði mRNA og efnisþættir í burðarefninu væri þörf til að hámarka IFN-b tjáningu. Í millitíðinni sýndu imiquimod og burðarefni svipaða virkni við að stuðla að TNF-a og IL-1b tjáningu, á meðan MVP var mun öflugra en annað hvort þeirra (mynd 4B og C). Tjáning á CCL5, cýtókíni sem almennt er tengt við NF-kB og IFN eftirlitsþætti, var örvað jafnt í frumum sem fengu imiquimod, eingöngu burðarefni eða MVP (mynd 4D). TLR7, MAVS, STING og TRIF eru lykilþættir í helstu merkjaflutningsleiðum sem miðla frumuviðbrögðum við veiru-RNA og skemmdu DNA28e30. Við bjuggum til BMDCs úr músum með Tlr7, Mavs, Sting eða Trif genútsláttur (KO) og meðhöndluðum frumur með mRNA kjarna, mRNA-frjáls burðarefni eða mRNA hjúpað MVP til að skoða IFN-b og TNF-a tjáningu.

Mynd 2 Örvun ónæmissvörunar með MVP. (A) Skýringarmynd af mRNA/prótamínkjarna, mRNA-fríu burðarefni og heill MVP. (BeD) Þroska BMDC eftir að hafa verið meðhöndluð með OVA-MVP í 24 klst. (E og F) MHC I tjáning og OVA257e264 mótefnavaka epitope-MHC I flókið í BMDC eftir að hafa verið meðhöndluð með OVA-MVP í 24 klst. (G) Stig IL-2 frá meðhöndluðum BMDCs sem ræktaðar eru með B3Z eða OT-I T frumum. (H og I) Flæðifrumugreining á T-frumum í fjölgun. Sýndar eru táknmyndir T-frumna. (J) DC þroska eftir MVP meðferð in vivo. C57BL/6J mýs voru meðhöndluð með OVA-MVP, og DCs í hvolfseitlum voru greind. (K og L) T-frumuþýðisgreining. C57BL/6J mýs voru meðhöndluð með burðarefni eða OVA-MVP og T-frumur í hvolfseitlum voru greindar með frumuflæðismælingu. (M) ELISpot prófun. C57BL/6J mýs voru meðhöndluð með OVA-MVP og eitlum var safnað á tilgreindum tímapunktum. Einangraðar frumur voru notaðar til að mæla frumur sem tjá IFN-g. Gögn eru sett fram sem meðal SEM (n Z 3). *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0,005; ****P < 0,001; ns, ekki marktækt.

Mynd 3 Anti-æxlisvirkni frá MVP. (A) Hindrun á MC38-OVA æxlisvexti. Kvenkyns C57BL/6J mýs voru sáð undir húð með 5  105 MC38-OVA æxlisfrumum/mús á degi 0 og meðhöndlaðir með PBS stjórn, burðarstýringu, GFP-MVP eða OVA-MVP á Dagur 3 og 10. (B) Hömlun á B16-OVA æxlisvexti. Kvenkyns C57BL/6J mýs voru sáð undir húð með 2  105 B16-OVA æxlisfrumum/mús á degi 0 og meðhöndlaðir með PBS stjórn, burðarstýringu, GFP-MVP eða OVA-MVP á 3. og 1. degi0. (C og D) Mynd og þyngd B16-OVA æxla á degi 17. (E) T frumufjöldi í æxlum músa eftir meðferð. (FeH) IFN-gþCD8þ T frumur í milta, eitlum (LN) og æxlum músa eftir meðferð. (I) OVA-sértækar CD8þ T frumur í æxlum músa eftir meðferð. (JeM) Myndir og magngreining á ELISpot prófun á milta og LN frumum frá músum eftir meðferð. Gögn eru sett fram sem meðal SEM (n Z 5). *P < 0.05; **P < 0,01; ***P < 0,005; ****P < 0,001.

KO staða Mavs og Sting í BMDCs var staðfest með Western blot greiningu (stuðningsupplýsingar mynd S5A). Furðu, Sting KO þurrkaði út örvandi virkni á IFN-b seytingu frá bæði burðarefninu einu sér og MVP (mynd 4E), sem gefur til kynna að MVP virkjaði tegund I IFN tjáningu í gegnum STING. Til að styðja hugmyndina fundum við fosfórun á tankbindandi kínasa 1 (TBK1) (mynd S5B), kínasa sem er almennt tengdur við STING virkni31. Að auki var þessi leið óháð TLR7 merkjum, þar sem IFN-b tjáning var ekki í hættu í frumum sem fengu imiquimod (mynd 4E). Til samanburðar hafði Trif eða Mavs KO lágmarks áhrif á IFN-b tjáningu sem MVP stuðlaði að. Eins og búist var við var imiquimod óvirkt við að örva IFN-b seytingu í BMDC sem fengin eru frá Tlr7 KO; hins vegar hafði Tlr7 KO neikvæð áhrif á örvandi áhrif frá MVP (mynd 4E). Athyglisvert var að mismunandi snið kom fram á TNF-a seytingu frá sömu meðferðum. Knockout af Sting, Trif eða Tlr7 hafði engin til lágmarks áhrif á MVP-örvaða frumtjáningu. Knockout of Mavs minnkaði aftur á móti verulega TNF-a gildi í frumum sem voru meðhöndlaðar með annað hvort burðarefni einu sér eða MVP (mynd 4F). Niðurstaðan gefur til kynna að MAVS sé lykilstjórnandi á TNF-a tjáningu í DCs við MVP meðferð.

3.5. MVP örvar STING og MAVS leiðir til að stuðla að seytingu IFN-I og bólgusýtókína

Til að bera kennsl á hluti í farartækinu sem ber ábyrgð á örvun STING og MAVS merkja, undirbjuggum við farartæki og MVP með því að skipta út eða sleppa lykilhlutum og notuðum þá til að meðhöndla BMDC. Sting örvandi hringlaga GMP-AMP (cGAMP) þjónaði sem jákvæð stjórn við að örva IFN-b seytingu. Að skipta út katjóníska lípíðinu EDOPC í burðarefninu fyrir annað jákvætt hlaðið lípíð, DOTAP, þurrkaði algjörlega út IFN-b seytingu. Til samanburðar var örvandi áhrifum frá burðarefninu og MVP haldið með eða án prótamíns og slík örvandi virkni var háð ósnortnu Sting geni (mynd 4G). Athyglisvert er að BMDCs sem voru meðhöndlaðir með einstökum þáttum lípíðskeljarins, þar á meðal EDOPC, stuðlaði ekki að sterkri IFN-b seytingu (stuðningsupplýsingar mynd S6). Þannig var EDOPC nauðsynlegt fyrir STING virkjun, og virkni þess er háð myndun lípíð nanóagna (þ.e. burðarefni eða MVP). Farartæki og MVP útbúið með EDOPC eða DOTAP var einnig notað til að meðhöndla BMDCS úr villigerð og Mavs KO músum og TNF-magn í frumuvaxtarmiðlum var ákvarðað. Eins og búist var við, að skipta út EDOPC fyrir DOTAP eða DOPC útilokaði örvandi átak frá ökutækinu og MVP. Að auki var TNF-a stig verulega lækkað í Mavs KO frumum samanborið við villigerð frumur, en ekki minnkað (Mynd. 4H), sem gefur til kynna að fleiri þættir gætu tekið þátt í að miðla MVP-örvaðri TNF-a tjáningu.

3.6. STING ferillinn er nauðsynlegur fyrir MVP-miðlaða ónæmissvörun gegn æxli

Bæði villigerðar- og knockout-mýs voru meðhöndluð með OVA mRNA hjúpuðu MVP og DC-þroska og T-frumufjölgun voru skoðuð. Sting KO minnkaði marktækt hlutfall CD80þ og CD86þ DC frumna og CD69þ T frumna (mynd 5AeD). ELISpot prófun leiddi í ljós marktækt minnkaðar IFN-g-framleiðandi frumur í milta og eitlum frá Sting KO músum samanborið við villigerðar mús eftir að þær voru meðhöndlaðar með sama skammti af MVP (mynd 5EeH). Áhrif Mavs KO voru lítil þar sem enginn munur var fylgst með CD44þCD8þ minni T frumum, OVA257e264-MHCI dextramer-jákvæðum CD8þ T frumum, eða fjölda IFN-g framleiðandi frumna í eitlum samanborið við villt- gerð músa (mynd 5IeL). Niðurstaðan styrkir þá hugmynd að fleiri þættir fyrir utan MAVS geti tekið þátt í MVP örvuðu bólgueyðandi frumutjáningu. Bæði villigerð og Sting KO mýs voru notuð til að sáð B16-OVA æxli og mýs voru meðhöndluð með PBS stjórn eða OVA mRNA hjúpuðu MVP. Flæðifrumugreining á eitla- og æxlissýnum sem safnað var úr bólusettum músum leiddi í ljós verulega minnkaðan fjölda IFN-g-framleiðandi CD8þ T frumna í Sting KO músunum (mynd 6A og B). Fyrir vikið var æxlisvöxtur algjörlega hindraður í villigerðum músum sem fengu MVP, samanborið við aðeins hluta hömlunar í Sting KO músunum (mynd 6C).

cistanche plöntuaukning ónæmiskerfi

Smelltu hér til að skoða Cistanche Enhance Immunity vörur

【Biðja um meira】 Netfang:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

4. Umræður

Í núverandi rannsókn höfum við kerfisbundið skoðað virknihlutverk einstakra þátta í MVP við örvun ónæmissvörunar gegn æxli. Frumu-undirstaða rannsókn okkar hefur greinilega sýnt fram á að bæði mRNA sameindir og RNA-frjálsa burðarefnið í MVP eru nauðsynlegar fyrir fulla virkni þess til að stuðla að tjáningu IFN-b og fjölda bólgueyðandi frumuefna, þar á meðal IL-1b og TNF -a í dendritic frumum. Sýnt hefur verið fram á að slík cýtókín gegna mikilvægu hlutverki í virkjun dendritic frumu og bóluefnismiðluðu andæxlisónæmi20. Rannsókn okkar hefur einnig leitt í ljós að örvun cýtókínframleiðslu er háð fjölda lykilmerkjaflutningsleiða sem taka þátt í meðfæddri ónæmisskynjun, þar á meðal þeim sem miðlað er af STING og MAVS. Þó STING sé nauðsynlegt fyrir IFN-b tjáningu, tekur MAVS aðallega þátt í að stjórna TNF-a tjáningu (mynd 6D). Mikilvægi STING-boða á MVP-miðlað ónæmi gegn æxli er enn frekar sýnt fram á minni T-frumuvirkni og þar af leiðandi skert æxlisvaxtarhömlun í Sting KO músum. Þessi niðurstaða er í samræmi við aðrar skýrslur um að STING virkjun ákvarðar frumudrepandi T frumumiðlað andæxlisónæmi32. MAVS er lykilmiðlari í RIG-I-viðtaka (RLR) merkjum sem svar við veirusýkingu. Virkjun þessarar leiðar leiðir til þess að bólgusvörun ríkir33. Það er forvitnilegt að virkni T-frumna er ekki í hættu hjá Mavs KO músum, í ljósi þess að MAVS-boðin gegna greinilega stóru hlutverki við að stjórna tjáningu bólgusýtókína, þar með talið TNF-a. Hugsanleg ástæða er sú að örvun slíkra cýtókína með MVP er miðlað af mörgum leiðum og truflun á MAVS brautinni minnkar ekki tjáningu cýtókína niður í nógu lágt stig til að hafa veruleg áhrif. Að öðrum kosti er tap á MAVS merkjum bætt upp með öðrum leiðum. Frekari rannsókna er þörf til að bera kennsl á þessar leiðir til að skilja frekar verkunarmáta MVP bóluefnis. Þrátt fyrir að TLR7 hafi jafnan verið tengt við mRNA meðferð21, virðist TLR7 merkjasendingin ekki gegna stóru hlutverki í að miðla MVP virkni. Notkun fullmetýleraðra mRNA sameinda í núverandi rannsókn kann að hafa gert TLR7 merki minna viðeigandi. Það hefur verið vel sýnt fram á að RNA metýlering bælir viðurkenningu TLRs23. TRIF er lykilaðlögunarprótein fyrir TLR3/7/8 merkjasendingar28. Knockout of Trif hefur ekki áhrif á MVP virkni heldur, sem styrkir þá hugmynd að ofangreind TLR, þar á meðal TLR7, gegni ekki stóru hlutverki í að miðla frumuviðbrögðum við MVP. Margir Sting-örvar hafa verið notaðir við þróun krabbameinsbóluefna, þar með talið hringlaga dínukleótíð og lítil og stór sameindasambönd34e37. Slíkum Sting-örvum þarf að bæta við sem ytri hjálparefni við undirbúning bóluefnisins sem bætir enn einu flóknu lagi við bóluefnissamsetninguna. Að auki getur Sting-örvi sem er bætt við utanaðkomandi valdið óæskilegum aukaverkunum þegar hann er aðskilinn frá mRNA-fléttunni. Til samanburðar þjónar MVP okkar sem sjálfshjálparefni og virkar í samhengi við krabbameinsbóluefni, þar sem enginn af einstökum þáttum bóluefnisins, þ. Athyglisvert er að ekki er hægt að skipta út katjóníska fosfólípíðinu EDOPC fyrir DOTAP sem ekki er fosfólípíð sem einnig er jákvætt hlaðið. Það er forvitnilegt að geta sér til um mögulegan fyrirkomulag fyrir muninn á þessum tveimur katjónísku lípíðum. Hins vegar hefur verið skjalfest að aðrir eiginleikar lípíðsameindarþáttar eins og vatnsfælni geta haft mikil áhrif á heildarvirkni nanóagna og skilvirkni hennar fyrir kjarnsýrur38. Þess vegna verður að gæta varúðar við að velja réttu sameindirnar til að búa til fullvirkt mRNA bóluefni. Í stuttu máli höfum við þróað öflugt mRNA byggt lækningakrabbameinsbóluefni og úthlutað einstökum þáttum í bóluefninu með virkni þeirra. Verkunarháttur þess er talsvert frábrugðinn öðrum mRNA vettvangi sem notaður er til fyrirbyggjandi og lækningalegra inngripa. Þekkingin sem fengin er úr núverandi rannsókn mun örugglega leiða framtíðarþróun viðbótar mRNA meðferðarefna.

Mynd 4 Efling meðfæddra ónæmissvörunar með MVP. (AeD) BMDCs meðhöndlaðir með 1 mg/ml imiquimodi, 1 mg/ml mRNA-jafngildum kjarna, burðarefni eða MVP í 24 klst. IFN-b, TNF-a, IL-1b og CCL5 gildi voru mæld með ELISA. (E og F) IFN-b og TNF-a tjáning BMDCs unnin úr villigerð og genaútsláttarmúsum (KO) músum. BMDCs voru meðhöndluð með tilgreindum hvarfefnum í 24 klst. IFN-b og TNF-a voru mæld með ELISA. (G) IFN-b í BMDCs unnin úr villigerð og Sting knockout músum. BMDC voru meðhöndluð með 20 mg/ml cGAMP, 1 mg/ml mRNA-jafngildum kjarna, burðarefni eða MVP í 24 klst. Ökutæki (DOTAP): útbúið með því að skipta út EDOPC fyrir DOTAP; burðarefni (án prótamíns): framleitt með því að sleppa prótamíni. ND: ekki greinanlegt. (H) TNF-a í BMDC sem er unnin úr villigerð og Mavs knockout músum. BMDCs voru meðhöndlaðir með 1 mg/ml mRNA-jafngildum kjarna, burðarefni eða MVP í 24 klst. Ökutæki (DOTAP): útbúið með því að skipta út EDOPC fyrir DOTAP; ökutæki (DOPC): útbúið með því að skipta út EDOPC fyrir DOPC. Gögn eru sett fram sem meðal SEM (n Z 3). ***P < 0.005; ****P < 0,001; ns, ekki marktækt.

Mynd 5 Antitumor ónæmissvörun í Sting og Mavs knockout músum. (AeD) Minnkuð DC og T frumuvirkjun í Sting knockout músum. Bæði villigerð og Sting knockout mýs voru meðhöndluð með OVA mRNA-hjúpuðu MVP, og eitlum var safnað 48 klst síðar fyrir DC og T frumumælingu. (EeH) Minni IFN-g-tjáandi T frumur í milta og eitlum frá Sting knockout músum. Bæði myndir af blettum og magngreiningar eru sýndar. (IeL) Engin áhrif á virkni T-frumna í Mavs knockout músum. Bæði villigerð og Mavs knockout mýs voru meðhöndluð með PBS stjórn eða OVA mRNA hjúpuðu MVP, og eitlum var safnað 48 klst síðar til að mæla CD44þCD8þ minni T frumur (I), OVA257e264-MHCI dextramer-jákvæðar CD8þ T frumur (J) og fjöldi frumna sem framleiða IFN-g (K og L). Gögn eru sett fram sem meðal SEM (n Z 3 eða 5). *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0,005; ****P < 0,001; ns, ekki marktækt.

Mynd 6 Stunguháð ónæmi gegn æxli. (A og B) Greining á T-frumum sem tjá IFN-g í eitlum og æxlisvef eftir villigerð og Sting knockout mýs sem bera B16-OVA æxli voru meðhöndluð með OVA mRNA-hjúpuðu MVP. Mýs voru meðhöndluð á 3. og 1. degi 0 og eitlum og æxlum var safnað á 15. degi. Einstakar frumur voru greindar með frumuflæðismælingu. (C) Hömlun á æxlisvexti í villigerð og Sting knockout músum. Mýs voru meðhöndluð með PBS viðmiðun eða MVP á degi 3 og 10. Gögn eru sett fram sem meðal SEM (n Z 5). *P < 0,05; ****P < 0,001; ns, ekki marktækt. (D) Skýringarmynd á MVP örvun merkjaflutningsleiða sem leiða til frumumyndunar í DCs. Þó örvun á IFN-b tjáningu sé eingöngu miðluð af STING, þá eru margir þættir þar á meðal MAVS sem miðla TNF-a og IL-1b tjáningu.

Heimildir

1. El Sahly HM, Baden LR, Essink B, Doblecki-Lewis S, Martin JM, Anderson EJ, et al. Virkni mRNA-1273 SARS-CoV-2 bóluefnisins við lok blindaðs fasa. N Engl J Med 2021;385:1774e85.

2. Moreira Jr ED, Kitchin N, Xu X, Dychter SS, Lockhart S, Gurtman A, o.fl. Öryggi og verkun þriðja skammts af BNT162b2 Covid-19 bóluefni. N Engl J Med 2022;386:1910e21.

. Dowdy SF. Að sigrast á frumuhindrunum fyrir RNA meðferð. Nat Biotechnol 2017;35:222e9.

4. Cullis PR, Hope MJ. Lipid nanóagnakerfi til að gera genameðferð kleift. Mol Ther 2017;25:1467e75.

5. Persano S, Guevara ML, Li Z, Mai J, Ferrari M, Pompa PP, o.fl. Lipopolyplex eykur ónæmi gegn æxlum við bólusetningu sem byggir á mRNA. Lífefni 2017;125:81e9.

6. Wang Y, Su HH, Yang Y, Hu Y, Zhang L, Blancafort P, o.fl. Kerfisbundin sending á breyttu mRNA sem kóðar herpes simplex veiru 1 týmidínkínasa fyrir markvissa krabbameinsgenameðferð. Mol Ther 2013;21:358e67.

7. Kranz LM, Diken M, Haas H, Kreiter S, Loquai C, Reuter KC, et al. Kerfisbundin RNA afhending til dendritic frumna nýtir veirueyðandi varnir fyrir krabbameinsónæmismeðferð. Náttúra 2016;534:396e401.

8. Meng C, Chen Z, Mai J, Shi Q, Tian S, Hinkle L, o.fl. Veiruherma mRNA bóluefni til krabbameinsmeðferðar. Adv Ther 2021;4:2100144.

9. Pardi N, Hogan MJ, Porter FW, Weissman D. mRNA bóluefni ný tímabil í bólufræði. Nat Rev Drug Discov 2018;17:261e79.

10. Rurik JG, Tombacz I, Yadegari A, Mendez Fernandez PO, Shewale SV, Li L, o.fl. CAR T frumur eru framleiddar in vivo til að meðhöndla hjartaáverka. Vísindi 2022;375:91e6.

11. Esteban I, Pastor-Quinones C, Usero L, Plana M, Garcia F, Leal L. Á tímum mRNA bóluefna, Er einhver von um HIV-virka lækningu? Veirur 2021;13:501.

12. Krienke C, Kolb L, Diken E, Struber M, Kirchhoff S, Bukur T, et al. Bólgueyðandi mRNA bóluefni til meðhöndlunar á tilrauna sjálfsofnæmisheilabólgu. Vísindi 2021;371:145e53.

13. Miao L, Zhang Y, Huang L. mRNA bóluefni fyrir krabbameinsónæmismeðferð. Mol Cancer 2021;20:41.

14. Van Hoecke L, Verbeke R, Dewitte H, Lentacker I, Vermaelen K, Breckpot K, et al. mRNA í krabbameinsónæmismeðferð: umfram uppspretta mótefnavaka. Mol Cancer 2021;20:48.

15. Sahin U, Derhovanessian E, Miller M, Kloke BP, Simon P, Lower M, o.fl. Persónuleg RNA stökkbreytt bóluefni virkja fjölsértækt meðferðarónæmi gegn krabbameini. Náttúra 2017;547:222e6.

16. Sahin U, Oehm P, Derhovanessian E, Jabulowsky RA, Vormehr M, Gold M, o.fl. RNA bóluefni ýtir undir ónæmi í sortuæxlum sem hafa verið meðhöndluð með eftirlitsstöð hemlum. Náttúra 2020;585:107e12.

17. Hilf N, Kuttruff-Coqui S, Frenzel K, Bukur V, Stevanovic S, Gouttefangeas C, et al. Virk einstaklingsmiðuð bólusetningarpróf fyrir nýgreind glioblastoma. Náttúra 2019;565:240e5.

18. Carreno BM, Magrini V, Becker-Hapak M, Kaabinejadian S, Hundal J, Petti AA, et al. Krabbameins ónæmismeðferð. Tengdfrumubóluefni eykur breidd og fjölbreytni sortuæxla nýmótefnavaka-sértækra T-frumna. Vísindi 2015;348:803e8.

19. Keskin DB, Anandappa AJ, Sun J, Tirosh I, Mathewson ND, Li S, o.fl. Neoantigen bóluefni framkallar T-frumuviðbrögð í æxli í Ib fasa glioblastoma rannsókn. Náttúra 2019;565:234e9.

20. Mai J, Li Z, Xia X, Zhang J, Li J, Liu H, o.fl. Samvirkt virkjun ónæmis gegn æxli með bóluefni til meðferðar í agna. Adv Sci 2021;8:2100166.

21. Kobiyama K, Ishii KJ. Að gera meðfædda tilfinningu fyrir mRNA bóluefnisvirkni. Nat Immunol 2022;23:474e6.

22. Fotin-Mleczek M, Duchardt KM, Lorenz C, Pfeiffer R, Ojkic-Zrna S, Probst J, et al. Messenger RNA-undirstaða bóluefni með tvíþættri virkni framkalla jafnvægi TLR-7-háð aðlögunarónæmissvörun og veita æxlishemjandi virkni. J Immunother 2011;34:1e15.

23. Kariko K, Buckstein M, Ni H, Weissman D. Bæling á RNA-þekkingu með Toll-eins viðtaka: áhrif núkleósíðbreytinga og þróunaruppruni RNA. Ónæmi 2005;23:165e75.

24. Tahtinen S, Tong AJ, Himmels P, Oh J, Paler-Martinez A, Kim L, o.fl. IL-1 og IL-1ra eru lykilstjórnendur á bólgusvörun við RNA bóluefnum. Nat Immunol 2022;23:532e42.

25. Li C, Lee A, Grigoryan L, Arunachalam PS, Scott MKD, Trisal M, et al. Vélar meðfædds og aðlögunar ónæmis fyrir PfizerBioNTech BNT162b2 bóluefninu. Nat Immunol 2022;23:543e55.

26. LoPresti ST, Arral ML, Chaudhary N, Whitehead KA. Skipting hjálparlípíða með hlaðnum valkostum í lípíð nanóögnum auðveldar markvissa mRNA afhendingu til milta og lungna. J Control Release 2022;345:819e31.

27. Charbe NB, Amnerkar ND, Ramesh B, Tambuwala MM, Bakshi HA, Aljabali AAA, o.fl. Lítið truflandi RNA fyrir krabbameinsmeðferð: sigrast á hindrunum í fæðingu. Acta Pharm Sin B 2020;10:2075e109.

28. Fuertes MB, Woo SR, Burnett B, Fu YX, Gajewski TF. Interferónsvörun af tegund I og meðfædd ónæmisskynjun krabbameins. Trends Immunol 2013;34:67e73.

29. Harding SM, Benci JL, Irianto J, Discher DE, Minn AJ, Greenberg RA. Mítóísk framvinda í kjölfar DNA skemmda gerir kleift að þekkja mynstur innan örkjarna. Náttúra 2017;548:466e70.

30. Hartlova A, Erttmann SF, Raffi FA, Schmalz AM, Resch U, Anugula S, et al. DNA-skemmdir frumur interferónkerfið af tegund I í gegnum frumu-DNA-skynjarann ​​STING til að stuðla að meðfæddu ónæmi gegn örverum. Ónæmi 2015;42:332e43.

31. Zhang Z, Yuan B, Bao M, Lu N, Kim T, Liu YJ. Helicasa DDX41 skynjar innanfrumu DNA sem miðlað er af millistykkinu STING í dendritic frumum. Nat Immunol 2011;12:959e65.

32. Sivick KE, Desbien AL, Glickman LH, Reiner GL, Corrales L, Surh NH, o.fl. Umfang meðferðarlegrar STING virkjunar ákvarðar CD8þ T frumumiðlað andæxlisónæmi. Cell Rep 2018;25: 3074e3085 e5.

33. Reikine S, Nguyen JB, Modis Y. Mynsturþekking og merkjakerfi RIG-I og MDA5. Front Immunol 2014;5:342.

34. Fu J, Kanne DB, Leong M, Glickman LH, McWhirter SM, Lemmens E, et al. STING örvandi krabbameinsbóluefni geta læknað æxli sem eru ónæm fyrir PD-1 blokkun. Sci Transl Med 2015;7: 283ra52.

35. Corrales L, Glickman LH, McWhirter SM, Kanne DB, Sivick KE, Katibah GE, et al. Bein virkjun STING í æxlisörumhverfinu leiðir til öflugs og almenns æxlishvarfs og ónæmis. Cell Rep 2015;11:1018e30.

36. Miao L, Li L, Huang Y, Delcassian D, Chahal J, Han J, o.fl. Afhending mRNA bóluefna með heterósýklískum lípíðum eykur virkni gegn æxli með STING miðlaðri virkjun ónæmisfrumna. Nat Biotechnol 2019;37:1174e85.

37. Luo M, Wang H, Wang Z, Cai H, Lu Z, Li Y, o.fl. STING-virkjandi nanóbóluefni fyrir ónæmismeðferð gegn krabbameini. Nat Nanotechnol 2017;12:648e54.

38. Wang L, Koynova R, Parikh H, MacDonald RC. Transfection virkni tvöfaldra blanda af katjónískum o-setnum fosfatidýlkólínafleiðum: vatnsfælni kjarninn mótar mjög eðliseiginleika og virkni DNA afhendingu. Biophys J 2006;91:3692e706.