Viðloðandi og sviflausar nýrnafrumur úr hamstra eru með mismunandi frumubeinagrind og yfirborðsviðtaka

Tengiliður: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Netfang:audrey.hu@wecistanche.com

Veronika Dill¹, Florian Pfaff¹, Aline ZimmerID², Martin Beer¹, Michael EschbaumerID^1*

Ágrip

Dýrafrumurækt, þar sem stakar frumur vaxa innfrestun, helst í efnafræðilega skilgreindu umhverfi, er uppistaðan í líflyfjaframleiðslu. Tilbúna umhverfið skortir utanaðkomandi vaxtarþætti og krefst venjulega tímafrekts aðlögunarferlis til að velja frumuklóna sem fjölga sér ífrestuntil háa frumufjölda. Sameindakerfin sem auðvelda aðlögunina og eiga sér stað inni í frumunni eru að mestu óþekkt. Sérstaklega fyrir frumulínur sem eru notaðar til framleiðslu á vírusmótefnavaka eins og nýrnahömstrum (BHK) frumur, er takmörkun á vexti vírusa með þróun óæskilegra frumueinkenna mjög óæskileg. Samanburður á fastvaxandi BHK frumum og sviflausnarfrumum með mismunandinæmnitil gin- og klaufaveikiveiru leiddi í ljós mun á tjáningu frumuviðtaka eins og integrína og heparansúlfata og á skipulagi aktín umfrymis. Transcriptome greiningar og vöxturhreyfifræðisýndi fram á fjölbreytileika BHK frumulína og staðfesti mikilvægi vel einkenndra foreldrafrumuklóna og meðvitaðrar skimunar til að tryggja að nauðsynleg frumueinkenni glatist ekki við aðlögun.

Cistanche tubulosa kemur í veg fyrir nýrnasjúkdóm, smelltu hér til að fá sýnishornið

1. Inngangur

Dýrafrumuræktunartækni var fyrst notuð til að framleiða vírusmótefnavaka í bóluefnaframleiðslu, en nýlega hefur bakteríu- eða gerframleiðslupöllum fyrir raðbrigðaprótein verið breytt í spendýrafrumukerfi líka [1, 2]. Mikilvægar í báðum samhengi eru nýrnafrumur (BHK), unnar úr sýrlenska gullhamstinum (Mesocricetus auratus). Upphaflega voru BHK frumur fast vaxandi, akkerisháð spendýrafrumulína með vefjafrumuvaxtarmynstur við staðlaðar frumuræktunaraðstæður, þar með talið nautgripasermi (FBS) [3, 4]. Aðlögun viðloðandi BHK frumna aðfrestunVöxtur í sermilausum miðlum ásamt ræktunarskilyrðum í stórum stíl er árangurssaga fyrir framleiðslu raðbrigða próteina (td storkuþáttar VIII) með mikilli uppskeru [1, 2]. Ennfremur eru BHK frumur næmar fyrir fjölmörgum vírusum, þar á meðal gin- og klaufaveikiveiru (FMD) [5]. Til að mæta aukinni eftirspurn eftir bóluefni gegn MKS víða um heim verður að framleiða mikið magn af mótefnavaka á eins ódýran hátt og mögulegt er, sem er hægt að ná með því að auka lífvænlega frumuþéttleika frumuhliðarinnar og lækka kostnað með einföldun á vinnslu upp og niður. mótefnavakans á framleiðsluhliðinni [6]. Dýrahlutalaus miðlar (ACFM) draga úr hættu á mengun af völdum aukaefna og einfalda ferlið að auki þegar ekki þarf að bæta við sermi [6, 7]. Hins vegar er aðlögun frumna til að vaxa í sviflausn án sermis og í ACFM tímafrekt og hægfara ferli [6, 8]. BHK frumur ná auðveldlega frumuþéttleika upp á 3,5×106 frumur/ml í sviflausn en aðlögunin hefur alltaf í för með sér hættu á að þróast óæskilega frumueiginleika í samanburði við upphafsþýðið sem getur leitt til lélegrar vaxtar, ófullnægjandi frumusértækrar uppskeru eða æxlismyndunar. [5, 7]. Aftur á móti geta breytingar á frumunum leitt til óvæntra vírusafbrigða meðan á menningaraðlögunarferlinu stendur. Sérstaklega fyrir framleiðslu bóluefnis mótefnavaka er breyting á eiginleikum veiru og mótefnavaka mjög óæskileg. BHK frumur eru nú þegar mismunandi hvað varðar næmi og möguleika þeirra til að fjölga ákveðnum veirustofnum af FMDV [9]. Augljóslega mun breytingin frá festingarháðum vefjafrumnavexti með samsöfnun og myndun kúlu til frumna sem vaxa sjálfstætt í sviflausn fylgja verulegar breytingar á frumunni sjálfri [4, 6]. Tap á integrinboðum vegna truflunar á snertingu utanfrumufylkis og frumu leiðir til breytinga á tjáningu próteina í himnu og á skipulagi aktínfrymisbeina sem er mikilvægur móttakandi integrínmiðlaðrar merkjasendingar [6, 10]. Á sama tíma gegna þessi integrín mikilvægu hlutverki í FMDV sýkingu vegna þess að þau eru viðtakinn fyrir FMDV í náttúrulegum hýsli og aðalviðtakinn í frumuræktun [11].

Dýpri skilningur á frumumun á HK frumum sem vaxa stöðugt og frumum ífrestunmun opna nýja möguleika fyrir frumuverkfræði og einfalda val á hentugum frumuklónum til framleiðslu mótefnavaka fyrir bóluefni.

Í þessari rannsókn, fast vaxandi BHK frumur og ACFM-aðlagaðarfrestunBHK frumur voru skoðaðar með tilliti til tjáningar frumuviðtaka eins og integrína og heparansúlfata (HS), hæfni þeirra til að setja fram prótein á yfirborði frumna og skipulag frumuaktínbeinagrindarinnar. Umskriftargreiningar og vaxtarhvarfafræði veita upplýsingar um fjölbreytileika prófaðra BHK frumulína.

cistanche getur nært nýru og bætt nýrnastarfsemi

2. Efniviður og aðferðir

2.1 Frumulínur og frumurækt

Helstu frumulínurnar sem notaðar voru voru tvær viðloðandi BHK-21 klón 13 afleiður (frá American Type Culture Collection [ATCC] CCL-10, haldið sem CCLV-RIE 164 og 179 í safni frumulína í dýralækningum , Friedrich-Loeffler-Institut, Greifswald, Þýskalandi; í stuttu máli: BHK164 eða BHK179) ogfrestunfrumulínur BHK21C13-2P (BHK-2P) frá European Collection of Authenticated Cell Cultures (ECACC; 84111301) og BHK-InVitrus (BHK-InV, einnig kölluð "lína #8" eins og í fyrri útgáfu okkar [12]; Sigma-Aldrich, St. Louis, Bandaríkjunum).

Fyrir vaxtarhvörf voru eftirfarandi frumulínur notaðar að auki: BHK-2P haldið annað hvort í Glasgow's Minimal Essential Medium (GMEM) með 10 prósent FBS ("lína #2") eða aðlagað að ACFM Cellvento™ BHK200 ( Merck KGaA, Darmstadt, Þýskalandi) í tveimur mismunandi ferlum (línur #4 og #5), auk fjögurra annarrafrestunfrumulínur: BHK21C13 aðlagaðar að vexti ífrestunmeð hægfara afturköllun á sermi (lína #3), BHK21-C (lína #6), BHK21-Hektor (lína #7) og framleiðslu BHK (lína #9) [12]. Allar þessar frumur voru útvegaðar af Merck KGaA.

Allar BHK-21 frumur sem notaðar eru í rannsókninni eru að lokum fengnar úr BHK-21 klón 13 frumulínu Macpherson og Stoker [13]. Hugtakið "frumulína" er notað lauslega; ekki allar ellefu BHK-21 línurnar sem lýst er í þessari rannsókn eru sannarlega aðskildar frumulínur frekar en afleiður ræktaðar við mismunandi aðstæður. Til að auðvelda tilvísun er númerun línanna haldið í samræmi við númerið í fyrri útgáfu okkar [12].

Frumlína #1 frá fyrri útgáfu var ekki innifalin í þessari rannsókn og þessi tala er því ekki notuð. Þess í stað er öll tilvísun í BHK-2P frumur sem nefna ekki línunúmer #2, #4 eða #5 til aðalfrestunfrumulína BHK21C13-2P (ECACC84111301) kynnt í upphafi þessa kafla.

Viðloðandi kínverska hamstur (Cricetulus griseus) eggjastokka (CHO) frumulínur CHO-K1 (ATCCCCL-61, haldið sem CCLV-RIE 134) og CHO677 (CRL 2244, haldið sem CCLV-RIE 1524) auk IB-RS -2 frumur (Instituto Biolo´gico-Rim Suı´no-2, haldnar sem CCLV-RIE 103) og Madin-Darby nautgripa nýrnafrumur (í stuttu máli: MDBK, haldið sem CCLV-RIE261) voru notaðar sem viðmið í frumuflæðitilraunum.

Ræktunarskilyrði voru 37 ˚C, 5 prósent CO2, og fyrirfrestunfrumur 320 rpm í TubeSpin lífreactors (TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Sviss) við 80 prósent rakastig. Allar viðloðandi frumulínur voru ræktaðar í Minimum Essential Medium Eagle (MEM) ásamt Hanks' og Earle's söltum (Sigma-Aldrich) með 10 prósent FBS. Allar sviflausnarfrumulínur voru aðlagaðar til að vaxa í Cellvento™ BHK200 miðli (Merck KGaA) nema frumulína #2, sem var ræktuð eins og lýst er hér að ofan.

Mælingar á frumuþéttleika og lífvænleika voru gerðar með því að nota trypan blátt (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) og sjálfvirkan frumuteljara (líkan TC20, Bio-Rad).

2.2 Vaxtarferilgreining sviffrumna

Vaxtarferilgreiningar voru gerðar sem lotutilraunir, gerðar í tvíteknum, tvisvar í sitthvoru lagi, með sáningarþéttleika 0.6×106 frumur/ml. Viable cell density (VCD) og lífvænleiki í prósentum voru mældir daglega allt að sex dögum eftir frumu sáningu.

Frumasértæku útreikningarnir voru gerðir í samræmi við jöfnurnar sem gefnar eru upp af [14]:

X: VCD (á mL); t: tímapunktar sýnatöku (klukkustund); n og n-1: tveir samfelldir sýnatökustaðir.

Númer frumudeildar (geisladiskur):

2.3 Flæðifrumumæling

Flæðifrumumælingar voru gerðar með því að nota flæðifrumumælingartækið FACSCanto II (BD Biosciences, Oxford, Bretlandi). Frumurusl var lokað út miðað við dreifingarmynstrið fram og til hliðar. Fyrir aktínlitun var miðgildi flúrljómunarstyrks í Alexa 488 rásinni mældur beint. Fyrir alla mótefnaliti var hlutfall Alexa 488 eða PE-jákvæðra frumna ákvarðað með millibili þar sem neðri mörkin voru stillt á grundvelli samsætustjórnunar. Allar tilraunir voru gerðar þrisvar sinnum sjálfstætt.

2.3.1 Mótefnalitun frumuyfirborðsviðtaka.

yfirborð. MDBK frumur þjónuðu sem jákvæð stjórn á tjáningu v 3, IB-RS-2 frumur þjónuðu sem jákvæð stjórn fyrir tjáningu v 8 og CHO-K1 frumur þjónuðu sem jákvæð stjórn á tjáningu HS . CHO677 frumur tjá hvorki prófuð integrín né HS og virkuðu því sem neikvæð viðmiðun í öllum tilraunum. Eftirfarandi mótefni voru notuð: fyrir v 3, PE-tengdan klón LM609 (þynning 1:20) (mAb1976H, Merck KGaA); fyrir v 8, aðal mótefni 11E8, klón 68, mús IgG2a (þynning 1:100) (vinsamlega veitt af Dr. StephenNishimura) með annars mótefni geit gegn mús IgG2a (þynning 1:1000) samtengd með Alexa Fluor Fisher Scientific 488 (Thermo) ); fyrir HS, klón 10E4, mús IgM (þynning 1:200) (Amsbio, Abingdon, Bretlandi) með efri mótefni geit gegn mús IgM mu keðju (þynning1:2000) samtengd með Alexa Fluor 488 (ab150121, Abcam, Cambridge, Bretlandi) . Aðeins eitt aðal mótefni var notað í hverri tilraun.

Sviffrumur voru þvegnar með fosfat-bufferuðu saltvatni (PBS). Viðloðandi frumur voru losaðar með 10 mM EDTA í PBS og síðan skolaðar með PBS. Eftir þvott voru frumur síaðar í gegnum frumusíu (nylon möskva, 70 μm holuþvermál, VWR, Radnor, USA) til að fjarlægja frumukekki og voru þær stilltar á 1×106 frumur/ml fyrir 1 μL af LIVE/ DEAD FixableViolet dauðafrumublettur (Thermo Fisher Scientific) var bætt við 1 ml frumusviflausn í 30 mínútur. Þetta skref og öll næstu skref voru framkvæmd varið gegn ljósi og við 4 ˚C. Aðal mótefnið var ræktað í 30 mínútur og annað mótefnið var ræktað í 20-30 mínútur. Þvottaskref með 2 ml FACS jafnalausn (PBS, 0,1 prósent natríumazíð, 0,1 prósent BSA) og skilvindu við 300 × g, 5 mín, 4 ˚C var framkvæmt eftir öll skref. Að lokum voru lituðu frumurnar endursviflausnar í 300 μL FACS jafnalausn.

2.3.2 Aktín litun.

Þráðlaga aktín var litað með Phalloidin-iFluor 488 hvarfefni (ab176753, Abcam), útbúið samkvæmt gagnablaðinu. BHK179, BHK-2P og BHK-InVfrumur voru losaðar eins og lýst er hér að ofan og festar með 4 prósent formaldehýði í 20 mínútur við stofuhita (RT). Frumur voru þvegnar tvisvar með PBS og 1×106 fastar frumur voru gegndræpnar með 0,1 prósent Triton X-100 (Sigma-Aldrich) í PBS, fylgt eftir með ræktun við RT í 3 mín. Frumur voru þvegnar tvisvar með PBS (skilvindu við 300 × g, 5 mín) áður en tilbúinni falloidín stofnlausninni var bætt við, þynnt 1:1000 í FACS jafnalausn og ræktuð í 20 mínútur við RT. Að lokum voru frumur þvegnar tvisvar með FACS jafnalausn og voru endursviflausnar í 300 μL FACS buffer. Litaðar frumur voru greindar beint með flúrljómunarsmásjá og notaðar fyrir FACS-greiningu.

2.3.3 Transfection tilraunir.

BHK164 og BHK-2P frumur voru færðar með annað hvort EGFP-N1, plasmíði sem tjáir aukið grænt flúrljómandi prótein (EGFP) (Clontech), eða í annarri röð tilrauna með pVSV-G, plasmíði sem tjáir G prótein í blöðru. munnbólgu Indiana veiru (VSV), með því að nota Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific) samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. Í stuttu máli var 2 ug af plasmíði DNA og 1,875 μL eða 3,75 μLof lípofectamíni þynnt í Cellvento™ BHK200 miðli blandað saman og ræktað við RT í 20 mínútur til að leyfa fléttumyndun. Síðan voru þessar blöndur fluttar í frumur á 12-brunnsplötum (u.þ.b. 4×105 frumur/ml) og miðlinum var bætt við upp í 200 μL. Frumurnar voru ræktaðar við 37 ˚C í 24 klst.

Fyrir FACS greiningu var allt innihald brunnanna safnað eftir 24 klst. PEGFP transsýktar frumur voru þvegnar þrisvar sinnum með PBS og voru endursviflausnar í 300 μL FACS jafnalausn. Ein afrit af pVSV-G-transsýktum frumum var gegndræpi með PBS með 0,1 prósent (v/v) TritonX -100 í 5 mínútur við RT áður en mótefnalitun var lituð, en hin hélst ógegndræp. Mótefnalitun var framkvæmd eins og lýst er hér að ofan með fjölstofna kanínusermi VSV 274/E (þynning 1:500, vinsamlega útvegað af Dr. Stefan Finke) og aukamótefnagei gegn kanínu (H plús L) samtengd Alexa Fluor 488 (þynning 1: 1000; Thermo Fisher Scientific).

2.4 Tölfræðigreining

Gögnin voru greind með GraphPad Prism útgáfu 07.04 fyrir Windows (GraphPad Software, La Jolla, Bandaríkjunum). Venjuleg einhliða dreifigreining var gerð með Tukey's post-hottest til að meta mun á meðferðarhópum. Viðmiðunarmörk fyrir tölfræðilega marktekt voru sett á p-gildið 0,001.

2.5 Transcriptome greining

2.5.1 RNA útdráttur, undirbúningur safns og raðgreining.

Þrjár óháðar lotur af hverri viðloðandi BHK179 frumulínum og BHK-2P og BHK-InV sviflausnarfrumulínum voru notaðar til greiningar á umriti. Að meðaltali voru 8,3×105 BHK179 frumur, 1,6×107 BHK-2Pfrumur og 1,4×107 BHK-InV frumur ljósaðar í TRIzol Reagent (Thermo Fisher Scientific). Eftir að 0,2 rúmmáli af tríklórmetani var bætt við frumulýsið, ræktun og skilvindu, var vatnsfasanum safnað saman og honum blandað saman við eitt rúmmál af 100 prósent etanóli. Úr þessu var heildar-RNA dregið út með því að nota RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Þýskalandi) með DNase-meltingu á dálki með RNase-Free DNase Set (Qiagen) eftir leiðbeiningum framleiðenda. ERCC RNA Spike-In Mix 1 (Thermo Fisher Scientific) var bætt við og notað sem innra eftirlit fyrir öll eftirfarandi skref. Næst var pólýadenýlerað mRNA einangrað úr 1–3 ug af hágæða heildar-RNA með Dynabeads mRNA DIRECT Micro Kit (ThermoFisher Scientific). Í kjölfarið var mRNA brotið og notað til cDNA myndun og undirbúnings safns með því að nota TruSeq Stranded mRNA LT Sample Prep Kit (Illumina, San Diego, Bandaríkjunum) samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. Raðgreining var framkvæmd á Heinrich-Pette-stofnuninni, Hamborg, með því að nota NextSeq 500 (2x75 bp) og HiSeq 4000 (1x50 bp) búnað (Illumina).

2.5.2 Tölfræðileg greining á mismunandi genatjáningu.

Gæðaathugun á hráum lestum frá hverju raðasafni var framkvæmd með FastQC (útgáfa {{0}}.11.9; Babraham Institute, Cambridge, Bretlandi) með áherslu á lestrarlengdardreifingu og millistykkismengun fyrir og eftir millistykki klipping með því að nota Trim Galore (útgáfa 0.6.4_dev, Babraham Institute) og Cutadapt (útgáfa 2.10) [15]. Með því að nota Lax [16] var klippt hráa lesið síðan nánast kortlagt við erfðamengi sýrlenska gullhamstsins.

Í stuttu máli má segja að erfðafræðilegar og umritatilvísanir GCF{{0}}.1_MesAur1.0 voru fengnar frá National Center for Biotechnology Information (NCBI) og sameinuð viðmiðunarröðum ERCC spike- í stjórnum. Tálbeitu-meðvitaður transcriptome index [17] var smíðaður til að leyfa sértæka röðun við lax. Til magngreiningar voru tíu endurtekningar af stígvélum notaðar og uppbót fyrir raðsértæka hlutdrægni, GC hlutdrægni og 5' eða 3' stöðuskekkju var virkjuð.

Í kjölfarið voru magngreiningargögnin fyrir ERCC spike-in viðmiðin tengd við fræðilegan styrk þeirra, til að greina vandamál við undirbúning sýna.

Ennfremur voru genasértæku magngreiningargögnin upphaflega síuð (aðeins gen sem birtast í fleiri en einni endurtekningu með yfir 15 talningum), staðlað með reglulegri log umbreytingu (rlog), og notuð til könnunargagnagreiningar, td með PCA. Mismunandi tjáð gen voru auðkennd og síðan notuð til greiningar á ferli með því að nota DESeq2 [18]. Tjáningargögnin voru greind fyrir gena sem tjáðust á marktækan hátt á milli frumulínupöranna BHK-2P og BHK179, BHK-InV og BHK-2P og BHK-InV og BHK179. Í kjölfarið var tvöfaldur logaritmísk (log2) faltbreytingin leiðrétt með því að nota föllin „lfcShrink“ og „apglm“ í DESeq2 til að vega upp á móti lágum eða breytilegum lestrarfjölda sem geta leitt til ofmats dreifni [19].

Viðmiðin fyrir geni sem tjáð er marktækt öðruvísi voru stillt á hámarks leiðrétt gildi upp á {{0}}.05 og lágmarksalgildi minnkaðrar log2 faldrar breytingar upp á 1. Pathway og The skilyrði fyrir geni sem tjáð er marktækt öðruvísi voru stillt á hámarks leiðrétt gildi 0,05 og lágmarksalgildi minnkaðrar log2 falt breytingarinnar upp á 1. Ferða- og auðgunargreining var framkvæmd með því að nota fallið „auðga“ í klasasniði (útgáfa 3.16.0).

cistanche getur nært nýru og bætt nýrnastarfsemi

3. Úrslit

3.1 Næmni frumulínu fyrir FMDV er óháð einstökum vaxtarhraða hennar og frumuskiptafjölda

Lotutilraunir með níu mismunandi BHK sviflausnarfrumulínum voru gerðar á sex daga tímabili og lífvænleg frumuþéttleiki (VCD) og lífvænleiki voru mældir daglega. Byggt á fyrri athugunum þess efnis að frumulínurnar væru mismunandi hvað varðar næmi fyrir FMDV sermigerð Asíu{{0}} [12], var athugað hvort hækkuð umbrot og vaxtarhraði frumna tengist minni næmi fyrir sýkingu með þessu. vírus (tafla 1). Tvær af þremur næmum BHK sviflausnarfrumulínum eru hægt vaxandi frumur með litla frumuskiptingartölu (cd) upp á 0.60 (#3) og 0.70 (#9), en þriðja næma frumulínan (#8) hefur hæsta vaxtarhraða og cd (μ=0.035, cd=1.62) meðal allra prófaðra frumulína.

Afturköllun sermis og aðlögun að vexti í ACFM hafði ekki áhrif á næmni fyrir FMDV í hópi okkar af rannsakaðum frumulínum. Frumulína #2 er hægt vaxandi, sermiháð undanfari BHK-2P frumulínanna, haldið í sviflausn með GMEM með sermi frá nautgripum. Við aðlögun að vexti í ACFM voru frumurnar valdar fyrir háan VCD, tengd við háan vaxtarhraða og cd. Líkt og aðal BHK-2P frumulínan sem notuð var við rannsóknina eru frumulínur #4 og #5 einnig fengnar úr frumulínu #2 en eru mismunandi hvað varðar aðlögun að ACFM. Allar BHK-2P frumulínur sem viðhaldið er í ACFM sýndu mjög svipaðan vaxtarsnið. Næmi fyrir FMDV sermisgerð Asíu-1 fékk ekki nein þessara frumulína við aðlögun að ACFM, líklega vegna þess að upprunalega línan #2 hafði þegar verið ónæm. Á sama hátt sást engin breyting á næmi fyrir sviflausnarfrumulínu #3. Þegar þær vaxa fast (sbr. frumulínu #1 í [12]), höfðu frumurnar verið næmar fyrir FMDV Asíu-1 og þær héldu þessum eiginleika við aðlögun að vexti í sviflausn. Á sama tíma öðluðust þeir ekki hraðvaxtarsnið annarra sviffrumna.

3.2 Sviffrumur sýna færri frumviðtaka en fleiri aukaviðtaka fyrir FMDV á yfirborði þeirra en viðloðandi BHK frumur

Fyrsta skrefið til að veira geti smitað frumu er binding veiruögnarinnar við viðtakasameindir á yfirborði frumunnar. Til að greina muninn á fastvaxandi BHK frumum og BHK frumum í sviflausn, voru prófuð mótefni gegn frumuviðtökum sem taka þátt í utanfrumu fylkisvíxlverkun og vitað er að gegna mikilvægu hlutverki í FMDV sýkingu. Integrin v 3 og v 8 voru skoðuð sem dæmigerð frumuviðtaka sem þekkja RGD (Arg-Gly-Asp) bindandi mótíf og hafa samskipti við sermisþætti og utanfrumu fylkið en eru einnig notaðir af FMDV sem náttúrulegir aðalviðtakar þess. Hvorug prófuðu sviflausnarfrumulínuna (BHK-InV og BHK-2P) tjáði integrin v 3 eða v 8 á frumuyfirborðinu. Þó að munurinn á viðloðandi BHK og sviflausn BHK hafi ekki verið marktækur fyrir integrin v 8 (mynd 1b), tjáði marktækt hærra hlutfall af viðloðandi BHK179 integrin v 3 samanborið við sviflausnarfrumulínurnar BHK-InV og BHK-2P ( mynd 1a).

Mikið magn af HS kom fram á yfirborði beggja sviflausnarfrumulína. Tjáning HS var mjög mismunandi á milli endurtekinna rækta af viðloðandi BHK179 frumum. Í samanburði við sviflausnarfrumulínurnar voru færri frumur í BHK179 ræktunum HS-jákvæðar, jafnvel þótt munurinn væri ekki marktækur á fyrirfram ákveðnu marktæknistigi (mynd 2).

Litun og smásjárgreining leiddi í ljós mikinn mun á uppröðun aktínfrymisbeina milli viðloðandi frumna og sviffrumna (mynd 3). Aktínþráðunum í viðloðandi BHK179 frumunum er jafnt dreift yfir alla frumuna í fínu reticular mynstur (Mynd 3a), en frumur sem vaxa í sviflausn höfðu dreifða aktín litun (Mynd 3b). Athyglisvert er að magn þráðlaga aktíns var mismunandi milli sviflausnarfrumulína BHK-InV og BHK-2P. Miðgildi flúrljómunarstyrks (MFI) eftir phalloidin litun var marktækt hærri í BHK-InV frumum samanborið við BHK-2P, sem gefur til kynna hærra þráðlaga aktíninnihald í þessum frumum (mynd 3c).

3.3 Sviffrumur eru mismunandi hvað varðar flutningsvirkni en ekki getu þeirra til að sýna yfirborðsprótein

Vegna mismunar á aktínbyggingu milli viðloðandi frumna og sviffrumna voru frumurnar skoðaðar með tilliti til yfirfærni þeirra og hæfni til að kynna prótein á yfirborði þeirra. Almennt er virkni transfection, mæld með tjáningu EGFP, minnkuð í sviflausnarfrumum (mynd 4a). Þegar notaður er lítill skammtur af transfection hvarfefninu tjáði marktækt hærra hlutfall viðloðandi frumna EGFP samanborið við sviflausnarfrumurnar. Þegar stór skammtur af transfection hvarfefni var notaður tókst hærra hlutfall af sviflausnarfrumum að transsmitast, þó munurinn á stórum og litlum skömmtum væri ekki marktækur. Til að svara spurningunni um hvort sviflausnarfrumur séu enn færar um að setja fram prótein eins og frumuviðtaka á yfirborði þeirra, voru frumur umbreyttar með plasmíði sem kóðar VSV G próteinið (mynd 4b). Ein röð frumna var gegndræp fyrir litun til að gera grein fyrir möguleikanum á því að G próteinið væri tjáð en ekki sýnt á yfirborði frumunnar. Enginn marktækur munur var á hæfni til að tjá og kynna VSV G próteinið milli viðloðandi frumna og sviffrumna, hvorki þegar notaður var lítill eða stór skammtur af transfection hvarfefni.

3.4 Transcriptome greining leiðir í ljós mun á tjáningu gena sem tengjast utanfrumufylki milli sviffrumna

Umritagreining var gerð til að kanna frekar muninn á BHK frumum sem vaxa fast og BHK frumur í sviflausn og til að skýra hvers vegna sviflausnarfrumur eru mismunandi hvað varðar næmi fyrir FMDV. Viðloðandi BHK frumulína (BHK179) ræktuð í MEM bætt við FBS sem og ört vaxandi FMDV-næm frumulínu (BHK-InV) og ört vaxandi ónæm frumulínu (BHK-2P), bæði aðlagað að ACFM, voru valdir til greiningar.

Aðalþáttagreining (PCA) sýndi náið samband milli líffræðilegra endurtekna einstakra frumulína (mynd 5a). Allar endurtekningar af sömu frumulínu eru staðsettar þétt saman í söguþræðinum með litlar vísbendingar um áhrif frá lotu til lotu. Fyrsti aðalþátturinn (sem stendur fyrir 81 prósent af dreifni í staðlaða gagnasafninu) var túlkaður sem umritunarmunur milli frumna sem vaxa í sviflausn og frumna sem vaxa í viðloðun, en seinni aðalþátturinn (15 prósent af dreifni) táknaði muninn á milli sviflausnarfrumulínur BHK-2P og BHK-InV, hugsanlega tengdar næmi fyrir FMDV sýkingu. Saman gátu fyrstu tveir meginþættirnir útskýrt 96 prósent af dreifni sem fannst innan gagnasafnsins, sem gefur til kynna að umritagreiningin hafi bent á mikilvægan mun á frumulínunum þremur.

Minnsti fjöldi gena sem tjáðu sig með mismunandi hætti fannst þegar BHK-InV var borið saman við BHK-2P (590 upp-stýrt; 304 niður-stýrt). Svipaðar tölur sáust í samanburði á annað hvort BHK-2P eða BHK-InV fyrir sig við BHK179 (1527 og 1519 uppstýrt; 1308 og 943 niðurstýrt, í sömu röð) (mynd 5b). Þegar sviflausnarfrumulínurnar tvær (BHK-InV og BHK-2P) voru sameinaðar og borin saman við viðloðandi BHK179 frumulínuna, voru 1814 gen tjáð á mismunandi hátt. Þó að 411 gen séu eingöngu tjáð á mismunandi hátt þegar BHK179 er borið saman við BHK-InV, eru næstum tvöfalt fleiri (701 gen) eingöngu tjáð á mismunandi hátt milli BHK179 og BHK-2P. Á milli tveggja sviflausnarfrumulína voru aðeins 104 gen tjáð á mismunandi hátt.

Þegar borið var saman mengi mismunandi tjáðra gena af FMDV-næmum frumulínunum BHK179 og BHK-InV við FMDV-ónæmu frumulínuna BHK-2P, kom í ljós að undirmengi 553 gena var tjáð á mismunandi hátt í báðum samanburði ( mynd 5c). Þar sem þessi gen gætu tekið þátt í næmi fyrir FMDV, var gerð GO hugtakaauðgunargreining sem leiddi í ljós að mörg þessara gena tengjast frumuþáttum utanfrumu fylkisins (ECM), frumuhimnum og frumu-frumumótum (mynd 5d) .

Þar sem við sáum mun á milli frumulína sem tengjast ECM-víxlverkunum, var umritið endurgreint með áherslu á tjáningu integrina v 1, v 3, v 6, v 8, sem og aktíns, sem allt gæti haft þýðingu fyrir næmi fyrir FMDV sýkingu. (Mynd 5e). Að ACTA2 undanskildum var enginn marktækur munur á tjáningu aktíntengdra gena á milli BHK-InV og BHK-2P frumna á mRNA stigi. Staðlað genafjöldi fyrir öll skoðuð aktín-tengd gen var marktækt hærri í viðloðandi frumulínu BHK179 en í sviflausnarfrumulínunum (S1 mynd).

Allar þrjár frumulínurnar tjáðu svipað magn af ITGAV umritum, kóðaðar fyrir integrin undireiningu v en sýndu mismunadrifið tjáningu fyrir integrín undireiningarnar. Í smáatriðum tjáðu sviflausnarfrumulínurnar BHK-2P og BHK-InV marktækt minna ITGB1, ITGB3 og ITGB6 í samanburði við viðloðandi frumulínuna BHK179. ITGB3 og ITGB8 voru tjáð marktækt á mismun á milli sviflausnarfrumulína BHK-2P og BHK-InV. Athyglisvert er að ITGB8 var eina integrín undireiningakóðargenið sem var mjög oftjáð í bæði FMDV-næmum frumulínum BHK179 og BHK-InV samanborið við FMDV-ónæmu frumulínu BHK-2P (mynd 5e).

cistanche getur nært nýru og bætt nýrnastarfsemi

4. Umræður

Aðlögun frumna til að vaxa í sviflausn og í sermilausum miðlum er tímafrekt og smám saman en nauðsynlegt ferli í líftækni til að búa til afkastamiklar frumulínur sem notaðar eru til að framleiða mótefni, bóluefnismótefnavaka eða önnur prótein [1, 8 ]. Reyndar fylgir þessu ferli alltaf þeirri hættu að frumur öðlist óæskilega eiginleika miðað við upprunalega frumuefnið [7]. Þegar um er að ræða mótefnavakaframleiðslu í bóluefni skiptir næmni frumulínunnar fyrir markveirunni miklu máli. Fyrir gin- og klaufaveiru (FMDV) er það vel þekkt fyrirbæri að ákveðnar BHK frumulínur eru ónæmar fyrir sýkingu eða missa næmni við endurtekna undirræktun [20–22]. Að auki geta mótefnavakaeiginleikar veirunnar verið breytilegir eftir hýsilfrumu [9].

Sviffrumur vaxa óháð yfirborði og eru umluktar af súrefnisríkum næringarefnum, sem gerir þeim kleift að vaxa hratt. Hröð fjölgun frumna er nauðsynleg eiginleiki til að stækka ræktunina í stórt magn auðveldlega og á stuttum tíma. Það er nauðsynlegt að fjarlægja sermi úr miðlinum til að draga úr kostnaði, hættu á mengun og til að einfalda niðurskalaferli [23, 24].

Hópvaxtargreiningu á mismunandi BHK sviflausnarfrumulínum var ætlað að ákvarða hvort valið í átt að ört vaxandi frumustofni við sermislausar aðstæður væri skaðlegt fyrir fjölgun mund- og kjúklinga. Reyndar uxu tvær af þremur næmum frumulínum hægt en næmi þeirra fyrir FMDV reyndist vera óháð vaxtarefnaskiptum þeirra. Líklegra er að næmi fyrir kvefsýkingum sé þegar glatað (eða haldist) við fyrstu aðlögun að vexti í sviflausn. Losun frumanna frá yfirborði og afturköllun sermis í eftirfarandi skrefum við aðlögun að sviflausnarvexti leiðir til breytinga á tjáningarstigi yfirborðspróteina og próteina sem taka þátt í frumubeinagrindin [7].

Integrin eru mikilvæg fjölskylda frumuyfirborðsviðtaka sem eru samþættir í frumuhimnuna og miðla frumu-til-frumu boðefnum sem og sterkum tengslum milli frumunnar og yfirborðsins með bindingu utanfrumufylkis (ECM) þátta [10, 25 ]. Stýring frumuhringsins, skipulag frumubeinagrindarinnar og flutningur frumuviðtakasameinda í frumuhimnuna er háð integrínum [25]. Hjá mörgum integrínum er binding ECM, sem og binding bindla sem fást við frumurnar með því að bæta sermi við ræktunarmiðilinn, miðlað af RGD mótífinu [6, 25] og líklegt er að það breytist þegar frumur skipta úr viðloðandi vexti í sviflausn. Viðurkenning á RGD mótífinu af integrínum er einnig notuð af FMDV til að hefja viðtakamiðlaða innfrumumyndun á veiruögninni [26]. RGD mótífið í VP1 af FMDV er mjög varðveitt [27] og integrínin v 1, v 3, v 6 og v 8 eru þekktir viðtakar notaðir af FMDV in vivo og in vitro [28-31]. Vegna þess að grunsamlegur munur á frumuyfirborðspróteóminu milli viðloðandi frumna og sviffrumna getur einnig skipt sköpum fyrir muninn á næmi fyrir FMDV sýkingu, voru mótefni sem bindast integrininu v 3 og v 8 notuð til að lita viðloðandi BHK frumulínu sem og a næm og ónæm sviflausn BHK frumulínu. Engin v 6 litun var gerð vegna þess að áður hefur verið sýnt fram á að þetta integrin er ekki tjáð á yfirborði BHK frumna [32], jafnvel þó að ITGB6 mRNA sé greinanlegt. Á sama hátt, þrátt fyrir mikla ITGB8 mRNA tjáningu sem greindist í BHK179 og BHK-InV frumum, virðist v 8 integrín almennt ekki koma fram á yfirborði BHK frumna. Integrin v 3 fannst að litlu leyti á viðloðandi frumulínu, en ekki á sviflausnarfrumulínunum.

Burtséð frá integrínum, bindilbindingu, innbyrðis atburði og innanfrumuboða er hægt að miðla heparan súlfat (HS) próteóglýkönum [33] og öflun HS sem aukaviðtaka sést oft eftir endurtekna leið FMDV í ræktun [34]. Sértæk mótefnalitun leiddi í ljós mikið HS á báðum sviflausnarfrumulínum og í minna mæli einnig á viðloðandi BHK frumum. Stökkbreytingar í erfðamengi FMDV, sem leiða til breytinga á veirukapsíðpróteinum til að leyfa notkun HS sem viðtaka, eru þekktar fyrir að draga úr veirunni í náttúrulegum hýsli [35]. Aðgengi HS gæti því verið afgerandi þáttur fyrir breytt mótefnavaka á FMDV óháði frumulínu sem veiran hefur verið aðlöguð að.

Vegna þess að frumulosun tengist breytingum á samdráttarferli aktín-mýósíns [7] og ræktun frumna í sviflausn veldur mismunandi þörfum til að lifa af, td viðnám gegn mikilli skurðálagi vegna hræringar ræktunarvökvans [6], hefur aktínbeinagrindurinn verið hafa mikinn áhuga á þessari rannsókn. Smásjárgreining leiddi í ljós sköpulagða endurröðun frumubeinagrindarinnar frá netdreifingu í viðloðandi vaxtarfrumum yfir í þétt kúlulaga uppbyggingu við sviflausn. Þetta gæti verið aðlögunarbúnaður að ofangreindu háu klippiálagi og er einnig þekkt fyrir að eiga sér stað í CHO frumum við sömu aðstæður [6]. En það er líka athyglisvert að þótt enginn marktækur munur hafi verið á tjáningu flestra aktíngena milli BHK-InV og BHK-2P frumna á mRNA stigi, greindist marktækt meira þráðlaga aktínprótein í FMDV-næmu BHK. -InV en í FMDV-ónæmum BHK-2P. Þetta getur tengst mismunandi fjölliðunarhraða kúlulaga aktíns í þráðlaga aktíns.

Að minnsta kosti í viðloðandi frumum er innkoma FMDV háð aktínvirkni. Veiruinngangur veldur aktínflögum og truflun á aktínþráðarneti með breytingu þráðlaga aktíns í kúlulaga aktín hefur verið lýst á fyrstu stigum sýkingar [36-38]. Miðað við frumuáhrif (CPE) sem sjást í viðloðandi BHK frumum þegar þær eru sýktar af FMDV fer frumubeinagrindin í gegnum mikla endurröðun í mörgum af íhlutum þess [38]. Slíkt CPE sést ekki í sviflausnarfrumum vegna kúlulaga lögunar þeirra en hækkað aktíninnihald getur veitt veirunni ávinning. Vegna mismunar á aktín umfrymi voru gerðar tilraunir með transfemingu til að bera saman flutningsvirkni milli sviflausnar og viðloðandi BHK og til að ákvarða hvort þétt umfrymi sviffrumnanna hindri framsetningu próteina á frumuyfirborðinu. Almennt er vitað að mjög erfitt er að transfræða frumulínur í sviflausn, sem stafar af minnkaðri tengingu transfléttunnar við frumuhimnuna og í kjölfarið minnkaðri upptöku DNA-hleðslunnar [39]. Þetta var einnig staðfest með tilraunum okkar. En þrátt fyrir að flutningsvirknin hafi verið skert í BHK-2P frumum samanborið við viðloðandi BHK frumulínuna, þá var enginn munur á getu til að sýna umsmitaða VSV G próteinið á frumuyfirborðinu. Munur á hlutfalli litaðra frumna sást á milli pEGFP-N1 og pVSV-G tjáningarplasmíða í BHK-2P frumum. Þetta var ekki rannsakað frekar, en það gæti stafað af mismunandi greiningarmörkum á milli ónæmisflúrljómunarlitunar sem notuð er til að sjá fyrir VSV-G og meðfædds flúrljómunar EGFP.

Að lokum var umritagreining gerð til að gefa frekari upplýsingar um umritunarmun á viðloðandi og sviflausn BHK frumum annars vegar og á milli FMDV-næmra og FMDV-ónæma BHK frumulína hins vegar. Niðurstöður okkar eru í samræmi við aðrar rannsóknir á umritunarbreytingum í CHO, MDCK eða HEK frumum við skiptingu frá viðloðandi vexti í sviflausn. Almennt séð eru flestar breytingar tengdar uppbyggingu frumubeinagrindarinnar, umbrotum frumna og samspili ECM þátta og eru uppstýrðar fyrir sviffrumur [7, 40, 41]. Það kemur á óvart að FMDV-ónæm BHK-2P sviflausnafruman sýndi niðurstýringu þessara genasetta, sem gæti einnig útskýrt minnkað magn aktíns í BHK-2P samanborið við BHK-InV frumurnar. Sérstök greining á tjáningu integrín undireininga sýndi svipað magn af afritum af integrín undireiningu V í öllum þremur frumulínunum. Hæsta tjáningin í öllum frumulínum fannst fyrir integrín undireiningu 1. Mikilvægt er að hafa í huga að integrín 1 getur myndað heteródímera með tíu mismunandi keðjum og er formlega tjáð af flestum spendýrafrumum [6, 42]. Á sama hátt getur V undireiningin myndað heterodimer með fimm mismunandi keðjum, en 6 og 8 eru aðeins sýndar á yfirborði frumunnar í samsetningu með V [42]. Þetta endurspeglast nákvæmlega af gnægð afrita af staku integrin undireiningunum. Hækkuð umritun á 3 í viðloðandi frumum er einnig í góðu samræmi við hærra merkið fyrir integrin v 3 í mótefnalitunartilraunum. Á hinn bóginn endurspeglaðist sá munur sem sást á ITGB3 og ITGB8 mRNA gildum milli BHK-2P og BHK-InV ekki í yfirborðslituninni. Við gátum ekki skorið úr um hvort þetta væri eingöngu vegna ólíkrar næmis milli mRNA og próteinmælingaraðferða eða vísbending um blokkun próteintjáningar eftir umritun eða yfirborðsframsetningu [43]. Í heildina tjáðu sviflausnarfrumulínurnar BHK-2P og BHK-InV marktækt minna af ITGB1, ITGB3 og ITGB6 mRNA samanborið við viðloðandi frumulínuna.

5. ÁlyktanirÍ

Að lokum er það afar mikilvægt við undirbúning sviffrumna að nota frumuklón með vel þekktum eiginleikum og að skima frumustofninn sem myndast vandlega meðan á aðlögunarferlinu stendur til að tryggja að frumulínan haldi nauðsynlegum eiginleikum, í þessu tilviki. , næmi fyrir FMDV. Að auki ætti að nota nútímalegar aðferðir eins og FACS greiningu og umritunarfræði til frekari lýsingar á framleiðslufrumulínum.

cistanche getur nært nýru og bætt nýrnastarfsemi

Viðurkenningar

Við þökkum Patrick Zitzow fyrir framúrskarandi tæknilega aðstoð.

Framlög höfunda

Hugmyndafræði:Veronika Dill og Michael Eschbaumer.

Formleg greining:Veronika Dill og Florian Pfaff.

Fjáröflun:Aline Zimmer og Martin Beer.

Rannsókn:Veronika Dill.

Aðferðafræði:Veronika Dill, Florian Pfaff og Michael Eschbaumer.

Verkefnastjórn:Martin Beer.Resources: Aline Zimmer.

Eftirlit:Michael Eschbaumer.

Visualization:Veronika Dill, Florian Pfaff og Michael Eschbaumer.

Ritun – frumdrög:Veronika Dill.

Ritun - endurskoðun og klipping:Veronika Dill, Florian Pfaff, Aline Zimmer, Martin Beer, Michael Eschbaumer.

Heimildir

1. Merten OW. Framfarir í frumurækt: festingarfíkn. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci.2015; 370(1661):20140040.

2. Dingermann T. Raðbrigða meðferðarprótein: framleiðsluvettvangar og áskoranir. Líftækni J.2008; 3(1):90–7.

3. Hernandez R, Brown DT. Vöxtur og viðhald barnahamstra nýrna (BHK) frumna. Curr ProtocMicrobiol. 2010; Kafli 4:Viðauki 4H. mca04hs17 PMID: 20440683

4. Cruz HJ, Moreira JL, Stacey G, Dias EM, Hayes K, Looby D, o.fl. Aðlögun BHK frumna sem framleiða raðbrigða prótein að sermilausum miðli og próteinlausum miðli. Frumutækni. 1998; 26(1):59–64.

5. Guskey LE, Jenkin HM. Aðlögun BHK-21 frumna að vexti í hristararækt og síðari áskorun af völdum japanskrar heilabólguveiru. Appl Microbiol. 1975; 30(3):433–8. https://doi.org/10.1128/am. 30.3.433-438.1975 PMID: 1237269

6. Walther CG, Whitfield R, James DC. Mikilvægi milliverkunar á milli integrins og aktíns frumubeinagrinds við aðlögun CHO frumna í sviflausn. Appl Biochem Biotechnol. 2016; 178(7):1286–302.

7. Kluge S, Benndorf D, Genzel Y, Scharfenberg K, Rapp E, Reichl U. Fylgst með breytingum á próteómi við aðlögun MDCK frumulínu í skrefum frá viðloðun til vaxtar í sviflausn. Bóluefni. 2015; 33(35):4269–80.

8. Costa AR, Withers J, Rodrigues ME, McLoughlin N, Henriques M, Oliveira R, o.fl. Áhrif frumuaðlögunar að sermilausum aðstæðum á glýkósýleringarsnið einstofna mótefnis framleitt af eggjastokkafrumum kínverskra hamstra. N Líftækni. 2013; 30(5):563–72. https://doi.org/10.1016/j.nbt.2012.12. 002 PMID:23247406

9. Bolwell C, Brown AL, Barnett PV, Campbell RO, Clarke BE, Parry NR, o.fl. Hýsilfrumuval mótefnavaka afbrigði gin- og klaufaveiru. J Gen Virol. 1989; 70 (Pt 1):45–57.

10. Wiesner S, Legate KR, Fassler R. Integrin-actin interactions. Cell Mol Life Sci. 2005; 62(10):1081–99.

11. O'Donnell V, Pacheco JM, Gregg D, Baxt B. Greining á tjáningu gin- og klaufaveiru integrínviðtaka í vefjum frá barnalegum og sýktum nautgripum. J Comp Pathol. 2009; 141(2–3):98–112. PMID: 19515380

12. Dill V, Hoffmann B, Zimmer A, Beer M, Eschbaumer M. Aðlögun FMDV Asíu-1 að svifræktarrækt: frumuþol er yfirunnið með breytingum á vírushylki. Veirur. 2017; 9(8). https://doi.org/10. 3390/v9080231 PMID:28820470

13. Macpherson I, Stoker M. Polyoma umbreytingu hamstra frumuklóna-rannsókn á erfðafræðilegum þáttum sem hafa áhrif á hæfni frumna. Veirufræði. 1962; 16:147–51.

14. Rourou S, van der Ark A, van der Velden T, Kallel H. Örberafrumuræktunarferli til að fjölga hundaæðisveiru í Vero frumum sem ræktaðar eru í hrærðum lífreactor við algjörlega dýrahlutalausar aðstæður. Bóluefni. 2007; 25(19):3879–89.

15. Martin M. Cutadapt fjarlægir millistykki raðir úr aflestri raðgreiningar með miklum afköstum. EMBnetjournal. 2011; 17:10–2.

16. Patro R, Duggal G, Love MI, Irizarry RA, Kingsford C. Salmon veitir hraða og hlutdræga magngreiningu á tjáningu afrita. Nat aðferðir. 2017; 14(4):417–9.

17. Srivastava A, Malik L, Sarkar H, Zakeri M, Almodaresi F, Soneson C, et al. Aðferðafræði jöfnunar og kortlagningar hefur áhrif á magn afrita. Erfðamengi Biol. 2020; 21(1):239.

18. Love MI, Huber W, Anders S. Miðlað mat á fold breytingu og dreifingu fyrir RNA-seq gögn með DESeq2. Erfðamengi Biol. 2014; 15(12):550.

19. Zhu A, Ibrahim JG, Love MI. Þunga hala fyrri dreifingar fyrir raðtalningargögn: fjarlægir hávaðann og varðveitir mikinn mun. Lífupplýsingafræði. 2019; 35(12):2084–92.

20. Clarke JB, Spier RE. Breytileiki í næmi BHK stofna og einræktaðra frumulína fyrir þremur stofnum gin- og klaufaveiru. Arch Virol. 1980; 63(1):1–9.