Virk umskipti á ótta minnisfasa frá endurþéttingu til útrýmingar með ERK-miðluðum forvörnum gegn endurþéttingu

Tengiliður: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Netfang:audrey.hu@wecistanche.com

Theendurheimt óttaminniframkallar tvö andstæð minnisferli, þ.e. endurþéttingu og útrýmingu. Stutt endurheimt veldur endurþéttingu til að viðhalda eðaauka ótta minni,á meðan langvarandi endurheimt slokknar á þessari minningu. Þótt aðferðir við endurþéttingu og útrýmingu hafi verið rannsakaðar, er enn óþekkt hvernig hræðsluminnisstigum er skipt úr endurþéttingu í útrýmingu meðan á minnisheimsókn stendur. Hér sýnum við að utanfrumumerkjastýrt kínasa (ERK) háð minnisbreytingarferli eftir endurheimt stjórnar breytingum á minnisfasa frá endurþéttingu til útrýmingar með því að koma í veg fyrir framkalla endurþéttingar í hamlandi forðast (IA) verkefni í karlkyns músum. Í fyrsta lagi var breytingaminnisfasinn, sem dregur úr framköllun endurþéttingar, en er ófullnægjandi fyrir öflun útrýmingar, auðkenndur eftir endurþéttingu, en fyrir útrýmingarfasa. Í öðru lagi sýndu endurþéttingar-, umskipti- og útrýmingarfasar eftir endurheimt minnis mismunandi sameinda- og frumueinkenni með cAMP-svarandi frumefnisbindandi próteini (CREB) og ERK fosfórýleringu í amygdala, hippocampus og miðlæga forfrontal heilaberki (mPFC). Endurþéttingarfasinn sýndi aukna CREB fosfórun, en útrýmingarfasinn sýndi nokkra taugahópa með ýmsum samsetningum CREB og/eða ERK fosfórunar, á þessum heilasvæðum. Athyglisvert er að minnisfasarnir þrír, þar með talið umbreytingarfasinn, sýndu tímabundna ERK virkjun strax eftir endurheimt. Mikilvægast er að blokkun ERK í amygdala, hippocampus eða mPFC í umskiptaminnisfasa hindraði endurþéttingu af völdum aukningar á IA minni. Þessar athuganir benda til þess að ERK-merkjaferillinn stjórni virkan umskipti á minnisfasa frá endurþéttingu til útrýmingar og þetta ferli virkar sem rofi sem hættir við endurþéttingu ótta.minni.

Lykilorð: ERK; útrýming;ótta minni; endurþétting; umskipti

1Lífvísindadeild, Lífvísindadeild, Landbúnaðarháskólinn í Tókýó, Tókýó 156-8502, Japan og

2Graduate School of Agriculture and Life Sciences, Háskólinn í Tókýó, Tókýó 113-8657, Japan

Mikilvægisyfirlýsing

Sækja hræðslu minniframkallar tvö andstæð minnisferli; endursamþjöppun og útrýming. Endurþétting viðheldur/eykur óttaminni, á meðan útrýming veikir óttaminni. Það er enn óþekkt hvernig minnisstigum er skipt frá endurþéttingu til útrýmingar meðan á endurheimt stendur. Hér bentum við á virkt minnisbreytingarferli sem virkar sem rofi sem hindrar endurþéttingu. Þessi minnisbreytingarfasi sýndi tímabundna aukningu á utanfrumumerkjastýrðri kínasa (ERK) fosfórýleringu í amygdala, hippocampus og miðlæga forfrontal heilaberki (mPFC). Athyglisvert er að hömlun á ERK á þessum svæðum á umbreytingarfasanum hindraði endurþéttingu-miðlaða aukningu á hamlandi forðast (IA) minni. Þessar niðurstöður benda til þess að umbreytingarminnisferlið stjórni virkan breytingu á óttaminnisfasa óttaminnis með því að koma í veg fyrir framkalla endurþéttingar með því að virkja ERK-merkjaferilinn.

Kynning

Minnisleiter ekki óvirkt ferli heldur er það frekar kraftmikið ferli sem gerir kleift að viðhalda, styrkja, veikja eða breyta/uppfæra upprunalegu minni (Misanin o.fl., 1968; Schneider og Sherman, 1968; Lewis, 1979; Mactutus o.fl. , 1979; Gordon, 1981; Nader o.fl., 2000; Nader og Hardt, 2009; Dudai, 2012; Fukushima o.fl., 2014). Mikilvægt er að endurheimt skilyrt óttaminni með stuttri endurútsetningu fyrir skilyrta áreiti (CS) verður óhæft og krefst endurþéttingar háð genatjáningu til að viðhalda því eða auka (Nader o.fl., 2000; Dudai, 2002; Kida o.fl., 2002; Suzuki o.fl., 2004; Tronel o.fl., 2005; Fukushima o.fl., 2014). Aftur á móti veldur stöðug eða endurtekin endurútsetning fyrir CS minnisútrýmingu, sem veikir óttaminni (Pavlov, 1927; Rescorla, 2001; Myers og Davis, 2002). Þannig erendurheimt óttaminniframkallar tvö andstæð minnisferli, þ.e. endurþéttingu og útrýmingu, þó að báðir ferlarnir séu framkallaðir af endurútsetningu á eins CS, en eru mismunandi eftir lengd endurútsetningar fyrir CS.

Sameiginlegur og mikilvægur lífefnafræðilegur eiginleiki endurþéttingar og útrýmingar er krafan um cAMP-viðkvæmt frumefnisbindandi prótein (CREB)-miðlaða genatjáningu (Mamiya o.fl., 2009). Athyglisvert er að við höfum sýnt andstæður sameinda-, líffæra- og hegðunareinkenni milli endurþéttingar- og útrýmingarfasa samhengisminnis (Suzuki o.fl., 2004; Mamiya o.fl., 2009). Að hindra nýmyndun próteina í endurþéttingarfasanum truflar upprunalega óttaminnið, en að hindra nýmyndun próteina í útrýmingarfasanum tekst ekki, þó að samhengisminnið hafi verið virkjað aftur. Krafan um heilasvæði sem sýna virkjun CREB-miðlaðrar genatjáningar er mismunandi á milli endurþéttingar og útrýmingar; endurþétting fer eftir amygdala og hippocampus, en útrýming reiðir sig á amygdala og mediaal prefrontal cortex (mPFC). Hins vegar er tímaferill amygdaloid CREB virkjunar mismunandi á milli endurþéttingar- og útrýmingarminnisfasa. Þessar athuganir bentu til þess að endurþéttingar- og útrýmingarfasar séu ekki óháðir, heldur hafi samskipti sín á milli. Athyglisvert er að nýlegar rannsóknir hafa bent á tímaglugga (umskiptafasa) sem sýnir enga utanfrumumerkjastýrða kínasa (ERK) virkjun í amygdala eftir endurþéttingu, heldur fyrir útrýmingarfasa eftir endurheimt heyrnarhræðsluminni (Merlo o.fl., 2018 ). Samanlagt benda þessar niðurstöður til mögulegra leiða þar sem minnisstigum er skipt úr endurþéttingu til útrýmingar meðan áendurheimt óttaminni. Með öðrum orðum, það er mögulegt að minnisbreytingarferlið stjórni þessu rofi virkan.

Í verkefni með hamlandi forðast (IA) fá mýs rafmagnsfótstuð eftir að þær fara inn í dimmt hólf úr ljósu hólfi og myndastminnitil að forðast myrka hólfið. Áður, með því að nota þetta verkefni, sýndum við að hægt er að greina á milli endurþéttingar- og útrýmingarfasa á þeim tímapunkti þegar mús fer inn í dimmt hólf úr ljósu hólfi meðan á endurútsetningu stendur (Fukushima o.fl., 2014). Þess vegna gerir þetta verkefni okkur kleift að einkenna sjónarhorn sameindaeinkenni endurþéttingar- og útrýmingarfasanna, öfugt við klassíska samhengisbundna óttaskilyrðingaminni þar sem endurvirkjun skilyrts óttaminnis með endurútsetningu fyrir CS hrindir af stað bæði endurþéttingu og útrýmingu; stutt (3 mín) endurútsetning fyrir skilyrtu samhenginu veldur endurþéttingu, en löng (30 mín) eða endurtekin endurútsetning fyrir þessu samhengi veldur útrýmingu (Eisenberg o.fl., 2003; Pedreira og Maldonado, 2003; Suzuki o.fl., 2004; Lee o.fl., 2008; Mamiya o.fl., 2009). Ennfremur komumst við að því að endurheimt IA minni er aukið með endurþéttingu minnis í þessu verkefni (Fukushima o.fl., 2014).

Til að skilja gangverkið fyrir umskipti frá endurþéttingu til útrýmingar á meðan áendurheimt óttaminni, við ætluðum að bera kennsl á og einkenna sameinda-, frumu- og hegðunareinkenni endurþéttingar-, umskipta- og útrýmingarfasa IA minni. Við greindum virkjun CREB og ERK í amygdala, hippocampus og mPFC í endurþéttingar-, umbreytingar- og útrýmingarstigum og skoðuðum hlutverk ERK virkjunar í þessum minnisferlum.

Efni og aðferðir

Mýs Allar tilraunir voru gerðar samkvæmt leiðbeiningum um umhirðu og notkun tilraunadýra (Japan Neuroscience Society og Tokyo University of Agriculture). Allar dýratilraunir sem gerðar voru í þessari rannsókn voru samþykktar af dýraumönnunar- og notkunarnefnd Landbúnaðarháskólans í Tókýó (heimild #280037). Allar skurðaðgerðir voru gerðar undir Nembutal svæfingu og reynt var að lágmarka þjáningar. Karlkyns C57BL/6N mýs voru fengnar frá Charles River. Mýsnar voru geymdar í fimm eða sex manna búrum, haldið á 12/12 klst ljós/myrkri hringrás og leyft að fá aðgang að mat og vatni að vild. Mýsnar voru að minnsta kosti átta vikna gamlar þegar þær voru prófaðar. Prófanir voru gerðar á ljósfasa lotunnar. Allar tilraunir voru gerðar blindar fyrir meðferðarástand músanna.

IA próf. Í gegnum IA tækið (OHARA Pharmaceutical) samanstóð af kassa með aðskildum ljósum og dökkum hólfum (bæði 15,5 12,5 11,5 cm). Ljósahólfið var lýst upp með flúrljósi (2500 lux; Fukushima o.fl., 2008, 2014; Zhang o.fl., 2011; Ishikawa o.fl., 2016). Áður en IA þjálfun hófst voru mýsnar meðhöndlaðar hver fyrir sig í 2 mínútur á hverjum degi í eina viku. Meðan á þjálfuninni stóð var hver mús leyft að venjast ljósa hólfinu í 30 sekúndur, og giljahurðin var hækkuð til að leyfa aðgang að dimma hólfinu. Seinkun til að komast inn í myrka hólfið var talin mælikvarði á yfirtöku. Um leið og músin var komin inn í dimmt hólfið var giljahurðinni lokað. Eftir 5 sekúndur kom fótstuð (0,2 mA) í samtals 2 sekúndur (þjálfun). 24 klst. eftir æfinguna var músin sett aftur í ljósa hólfið þar til hún fór inn í dimma hólfið (meðaltal 459 6 15.49 s). Strax eftir að músin var komin inn í myrka hólfið var gjóskuhurðinni lokað og músin dvaldi í dökku hólfinu í mislangan tíma (0, 1 eða 10 mín) án fótstuðs (endurvirkjun). Minni var metið 48 klst. síðar [eftirendurvirkjunar langtímaminni (PR-LTM) próf] sem víxlleynd fyrir músina til að fara inn í myrka hólfið þegar hún er sett í ljósa hólfið, eins og í endurvirkjun.

Fyrir fyrstu tilraunina skoðuðum við áhrif hömlunar á próteinmyndun eftir endurvirkjun (endurútsetning fyrir myrka hólfinu í 0, 1 eða 10 mín; mynd 1). Próteinmyndunarhemill anisomycin (ANI; Wako) var leystur upp í saltvatni (pH stillt á 7,0–7,4 með NaOH). Mýsnar voru þjálfaðar eins og lýst er hér að ofan og 24 klukkustundum síðar fengu þær ökutæki (VEH) eða ANI (150 mg/kg, ip) strax eftir endurútsetningu fyrir dimma hólfinu í 0, 1 eða 10 mínútur án fótalosts. (endurvirkjun). Við þennan skammt hamlar ANI 0,90 prósent af próteinmyndun í heila á fyrstu 2 klst. (Flood o.fl., 1973). 48 klst. eftir endurvirkjunarlotuna voru einstakar mýs enn og aftur settar í ljósahólfið og skiptingartíminn metinn.

Fyrir seinni tilraunina [fosfórýleruð CREB (pCREB) og fosfórýleruð ERK (pERK) ónæmisvefjaefnafræði; Fíkjur. 2–5], skoðuðum við heilasvæðin sem voru virkjuð eftir endurútsetningu fyrir ljósi (þar til mýsnar fóru inn í myrka hólfið, endurútsetningu fyrir dimma hólfinu í 0 mín.) eða dimmt hólf (endur- útsetning fyrir dökku hólfinu í 1 eða 10 mín.). Músunum var skipt í fjórar Fukushima o.fl. · Transition of Fear Memory Phases after Retrieval J. Neurosci., February 10, 2021, • 41(6):1288–1300 • 1289groups. Eftir 24 klst. eftir þjálfun voru einstakar mýs endurútsettar fyrir ljósa hólfinu og voru síðan í myrka hólfinu eftir að þær komu inn úr myrka hólfinu [endurvirkjun: 0 mín í myrka hólfinu, reconsolidation (Recon) hópur; 1 mín, umskipti (Tran) hópur; 10 mín, útrýmingarhópur (Ext)]. Annar hópur músa var ekki settur aftur í ljós/dökkt hólf [óendurvirkjaður (NR) hópur]. Mýsnar voru síðan svæfðar með Nembutal (750 mg/kg, ip) 5, 15 eða 30 mínútum eftir endurvirkjun.

Fyrir þriðju tilraunina (örinnrennsli U{{20}}126; myndir 6,7) skoðuðum við áhrif ERK hömlunar í amygdala, hippocampus eða mPFC á endurþéttingu/aukningu minni, umskipti, og útrýmingarhættu. MEK hemill U0126 (Sigma-Aldrich) var leystur upp í gervi heila- og mænuvökva sem innihélt þrjá dropa af Tween 80 (Sigma) í 2,5 ml af 7,5 prósent dímetýlsúlfoxíði (Wako) og stilltur á pH 7,4 með NaOH. Mýsnar voru þjálfaðar eins og lýst er hér að ofan og 24 klst síðar voru þær settar aftur í ljósahólfið (endurvirkjun). Mýsnar voru gefin með U0126 (1 mg) eða VEH í hin ýmsu heilasvæði strax eftir (Mynd. 6A, C, E-H, 7A-C) eða 30 mín eftir (Mynd. 6B, D) endurvirkjun. 48 klst. eftir endurvirkjun voru einstakar mýs enn og aftur settar í ljósahólfið og víxlleynd var metin (PR LTM). Örinnrennsli í hippocampus og mPFC (0,5 ml) var gert á hraðanum 0,25 ml/mín. Örinnrennsli í amygdala (0,2 ml) var gert á hraðanum 0,1 ml/mín. Inndælingarholan var látin standa á sínum stað í 2 mínútur eftir örinnrennsli og músunum var síðan skilað aftur í búr sín. MEK hemillinn SL327 (Santa Cruz líftækni) var leystur upp í dímetýlsúlfoxíði og þynntur með saltvatni. Mýsnar voru þjálfaðar eins og lýst er hér að ofan og 24 klst síðar voru einstakar mýs settar aftur í ljósahólfið (endurvirkjun). Mýsnar voru sprautaðar með SL327 (10 eða 20 mg/kg) eða VEH strax eftir endurvirkjun (mynd 7D-F). 48 klst. eftir endurvirkjun voru einstakar mýs enn og aftur settar í ljóshólfið og víxlunartíminn metinn (PR-LTM).

Ónæmisvefjaefnafræði var framkvæmd eins og áður hefur verið lýst (Mamiya o.fl., 2009; Suzuki o.fl., 2011; Zhang o.fl., 2011; Fukushima o.fl., 2014; Ishikawa o.fl., 2016; Hasegawa o.fl., 2019). Eftir svæfingu voru allar mýsnar blandaðar með 4 prósent paraformaldehýði. Heilinn var fjarlægður, festur yfir nótt, færður yfir í 30 prósent súkrósa og geymdur við 4 gráður. Krónuhlutar (30 mm) voru skornir í frystistilli.

Fyrir pCREB og pERK litun voru lausa fljótandi hlutar meðhöndlaðir með 1 prósent H2O2 og ræktaðir yfir nótt með kanínu fjölstofna and-fosfó-CREB (serín 133; S133) mótefni (1:1000; #{{10 }}, Millipore) og/eða kanínu einstofna and-fosfó-ERK1/2 (T202/Y204) mótefni (1:300; #4370; Cell Signaling Technology) í lokunarlausn (fosfat-jafnað saltvatn auk 1 prósents geitasermisalbúmíns, 1 mg/ml albúmín í sermi nautgripa og 0,05 prósent Triton X-100). Hlutarnir voru skolaðir með fosfat-bufferuðu saltvatni og ræktaðir með piparrótarperoxidasa-tengdu asna-anti-kanínu-IgG (1:500; Jackson ImmunoResearch) fyrir pCREB eða piparrót-peroxidasa-conjugered geita-anti-kanínu-IgG fyrir pERK í 1 klst við stofuhita. pCREB merki voru mögnuð upp með bíótíntýramíði og sýnd með því að nota Alexa Fluor-tengd streptavidin (Invitrogen). pERK merki voru magnuð upp með TSA-FCM (Invitrogen). Hlutarnir voru settir á rennibrautir og settir yfir með festingarmiðli (Millipore).

Magngreining var framkvæmd eins og áður hefur verið lýst (Frankland o.fl., 2006; Fukushima o.fl., 2014; Mamiya o.fl., 2009; Zhang o.fl., 2011; Suzuki o.fl., 2008). Mannvirki voru skilgreind líffærafræðilega samkvæmt atlas Franklin og Paxinos (1997). Allar ónæmisvirkar taugafrumur voru taldar af tilraunamanni sem var blindur fyrir meðferðarástandið

Niðurstöður

Einkenni minnisfasa eftir endurheimt í IA verkefninu

IA verkefnið gerir okkur kleift að greina á milli endurþéttingar- og útrýmingarfasa á þeim tímapunkti þegar mús fer inn í dimmt hólf úr ljósu hólfi (Fukushima o.fl., 2014). Til að skilja gangverkið sem liggur að baki breytingum á minnisfasa frá endurþéttingu til útrýmingar, einkenndum við IA minnisfasa eftir minnisheimsókn með því að skoða áhrif þess að hindra próteinmyndun sem er nauðsynleg til að endurþétta og eyða IA minni (Fukushima o.fl., 2014). Músunum var fyrst komið fyrir í ljósahólfinu. 5 sekúndum eftir að þeir fóru inn í myrka hólfið fékkst stutt rafmagnsfótstuð (þjálfun). Mýsnar voru endurútsettar fyrir ljósa hólfið 24 klst. eftir þjálfunina (endurvirkjunarlotu; mynd 1A) og víxlunartími þeirra til að komast inn í dimma hólfið var metin (mynd 1B). Mýsnar voru settar aftur inn í búr heima hjá sér strax eftir að þær fóru inn í myrka hólfið frá ljósa hólfinu (0-mín endurútsetning fyrir dimma hólfinu; endurþéttingarfasi) eða dvöldu í myrka hólfinu í 1, 3, eða 10 mín án þess að fá fótlost (útrýmingarfasi; mynd 1C–E). Strax eftir endurvirkjunarlotuna fengu mýsnar almenna inndælingu af VEH eða próteinmyndunarhemlinum ANI. 48 klst. síðar var víxlunartími metinn PR-LTM.

Í samræmi við fyrri rannsókn okkar (Fukushima o.fl., 2014), olli endurútsetning fyrir ljóshólfinu (0 mín hópur) endurþéttingu og aukningu á IA minni. Tvíhliða ANOVA leiddi í ljós marktæk áhrif tíma (F(1,24)=10.433, p=0.{{20}}036), lyf (F(1) ,24)=23.197, p , 0,0001) og tíma lyfjamilliverkun (F(1,24)=25.022, p , 0,0001; mynd 1B). Post hoc próf Bonferroni og pöruð t-próf ​​leiddu í ljós að VEH og ANI hóparnir sýndu marktækt aukna eða minnkaða, í sömu röð, víxlunarleynd við PR-LTM samanborið við endurvirkjunarlotuna (ps , 0,05; VEH, t(6) {{28 }} 5.134, p=0.0021, ANI, t(6)=4.804, p=0.003; mynd 1B). Þessar athuganir benda til þess að IA minnisheimsókn í ljósahólfinu hafi aukið minnið, en hömlun á próteinmyndun truflaði endurheimt minni, sem staðfestir fyrri athugunina að IA minnissókn eykur minnið með endurþéttingu á próteinmyndun háðan hátt.

Aftur á móti olli endurútsetning fyrir dimma hólfinu langtíma útrýmingu [tvíhliða ANOVA, tími (Mynd 1C, F(1,28)=9.575, p=0.{ {50}}04; mynd 1D, F(1,36)=11.699, bls=0.0016), lyf (Mynd 1C, F(1,28)=4.674, p=0.039; mynd 1D, F(1,36)=12.285, p {{29 }}.0012), tíma lyfjamilliverkun (mynd 1C, F(1,28)=7.916, bls=0.009; mynd 1D, F(1,36) {{41 }}.915, bls=0.0079)], eins og áður hefur komið fram (Fukushima o.fl., 2014). VEH hóparnir sem dvöldu í myrku hólfinu í 3 eða 10 mínútur sýndu marktækt minnkaða víxlunarleynd við PR-LTM samanborið við endurvirkjunarlotuna, en ANI hóparnir sýndu sambærilega víxlunartíðni við PR-LTM samanborið við endurvirkjunarlotuna og VEH hópar (post hoc Bonferroni próf, ps , 0,05; parað t próf, mynd 1C, VEH, t(7)=4.976, p=0.0016, ANI, t(7) { {59}}.796, bls 0.05; mynd 1D, VEH, t(9)=10.211, p , 0.0001, ANI, t(9)=1.02, bls. 0.05 ). Þessar athuganir benda til þess að endurútsetning á myrka hólfinu í 3 eða 10 mínútur hafi slökkt á IA minni og að hömlun á próteinmyndun hafi hindrað langtímaútrýmingu. Þannig slekkur IA minnisheimsókn í myrka hólfinu IA minni á genatjáningarháðan hátt.

Mikilvægt er að VEH hópurinn sýndi sambærilega víxlunarleynd við PR-LTM samanborið við endurvirkjunarlotuna og við ANI hópinn þegar þeir dvöldu í myrku hólfinu í 1 mín [tvíhliða ANOVA, tími (F(1,36) {{ 5}}.03, bls. 0.05), lyf (F(1,36)=0.019, bls. 0.05), tími lyfjasamskipta (F(1,36)=0.011, bls. 0.05); post hoc próf Bonferroni, ps. 0,05; parað t-próf, VEH, t(9)=0.091, bls. 0,05, ANI, t(9)=0.328, bls. 0,05; mynd 1E]. Þessar athuganir benda til þess að VEH hópurinn sýndi hvorki aukningu né útrýmingu á IA minni og að ANI hópurinn sýndi enga truflun á IA minni. Þess vegna hindraði endurútsetning fyrir myrka hólfinu í 1 mín bæði aukningu og truflun af völdum ANI á endurvirkjaða IA minni, en ekki slökkti IA minni, sem bendir til þess að þessi 1-mín endurútsetning hætti við framkallun endurþéttingar , en er ófullnægjandi til að slökkva IA minni.

Í stuttu máli gáfu þessar niðurstöður til kynna að endurútsetning fyrir ljósa hólfinu veldur endurþéttingarfasanum, en lengri endurútsetning fyrir dimma hólfinu (3 eða 10 mín) veldur útrýmingarfasanum. Meira um vert, að vera í 1 mínútu í myrku rýminu veldur umbreytingarfasa frá endurþéttingu til útrýmingar, sem hindrar endurþéttingu óttaminni án þess að valda útrýmingu.

Sameindamerki endurþéttingar, umbreytingar og útrýmingarfasa í amygdala, hippocampus og mPFC eftir IA minnisheimsókn

Endurþétting og útrýming samhengisminnis sýnir aukningu á CREB fosfórun við S133, merki um virkjun genatjáningar sem þarf til endurþéttingar og langtímaútrýmingar, en sýnir áberandi gangverki CREB fosfórunar (Mamiya o.fl., 2009 ). Athyglisvert er að nýlegar rannsóknir hafa sýnt að engin aukning er á fosfórun ERK, andstreymis eftirlitsaðila CREB (Impey o.fl., 1998; Wu o.fl., 2001), á basolateral svæði amygdala við umskipti frá endurþéttingu til útrýmingar hræðsluminnis, þó að þessi fosfórun aukist í basolateral svæðinu þegar bent óttaminni er endurþétt og slokknað (Merlo o.fl., 2014, 2018). Önnur rannsókn benti til þess að ERK í hippocampus sé aðeins virkjað þegar samhengisminni er slökkt, en ekki endurþétt (Tronson o.fl., 2009). Þessar niðurstöður benda til þess að endurþéttingar-, umbreytingar- og útrýmingarfasar sýna mismunandi sameinda- og frumumerki. Þess vegna mældum við og bárum saman magn pCREB og pERK í endurþéttingar-, umbreytingar- og útrýmingarfasa með því að nota ónæmisvefjafræði. Við gerðum svipaðar tilraunaáætlanir og á mynd 1B, D, E með því að nota fjóra tilraunahópa. Mýsnar voru endurútsettar fyrir ljósa hólfinu 24 klst. eftir þjálfunina og voru síðan í myrka hólfinu [endurvirkjun: 0 mín í myrka hólfinu, endurþéttingarhópur (Recon); 1 mín, umskipti (Tran) hópur; 10 mín, útrýmingarhópur (Ext)]. Annar hópur músa var ekki settur aftur í ljósa/dökka hólfið (ekki endurvirkjað, NR hópur). Við töldum pCREB-jákvæðar (pCREB1) taugafrumur, pERK-jákvæðar (pERK1) taugafrumur og tvöfaldar jákvæðar (pCREB1/pERK1) taugafrumur í amygdala, hippocampus og mPFC 30 mínútum eftir endurvirkjunarlotuna.

Amygdala (hliðarsvæði) CREB var virkjað í útrýmingar- og endurþéttingarfasa, en ERK var aðeins virkjað í útrýmingarfasa (Mynd 2A-C). Einstefnu ANOVA leiddi í ljós marktæk áhrif hóps (Mynd 2B, F(3,29)=14.85, p , 0.0001). Svipað og fyrri niðurstöður (Mamiya o.fl., 2009) leiddi post hoc Newman–Keuls prófið í ljós að Recon og Ext hóparnir sýndu marktækt fleiri pCREB1 taugafrumur en hinir hóparnir (bls, 0,05). Þessar athuganir gáfu til kynna að svipað og athuganir á hegðunarstigum (mynd 1), útsetning fyrir dimma hólfinu í 1 mín (umskiptafasa) hættir við að „kveikja“ á CREB fosfórun sem myndi aukast í endurþéttingarfasanum. Aftur á móti sáust marktækt fleiri pERK1 taugafrumur í Ext hópnum en í hinum hópunum, þó að það væru mun færri pERK1 taugafrumur en pCREB1 taugafrumur í Ext hópnum (F(3,29)=3.793, p { {23}}.0207; mynd 2C).

Stöðugt sáust marktækt fleiri tvöfaldar jákvæðar taugafrumur (pCREB1/pERK1) í Ext hópnum (F(3,29)=6.698, p=0.00 14; mynd 2D), en marktækt fleiri pCREB1/pERK– (pCREB stakar jákvæðar) taugafrumur sáust í Recon og Ext hópunum (F(3,29)=13.689, p , 0 .0001; mynd 2E). Þannig sýndi endurþéttingarfasinn aðeins einn þýði pCREB1/pERK– taugafrumna. Aftur á móti sýndi útrýmingarfasinn tvo hópa pCREB1/pERK- og pCREB1/pERK1 taugafrumna, sem gefur til kynna að ERK sé aðeins virkjað í undirmengi pCREB1 taugafrumna. Mikilvægt er að svipaðar niðurstöður sáust í basolateral svæði amygdala (mynd 2G, F(3,29)=13.042, p , 0,0001; mynd 2H, F(3,29) {{32} }.824, p=0.0201; mynd 2I, F(3,29)=12.633, p , 0,0001; mynd 2J, F(3,29)=12 .505, bls, 0,0001).

Tvífasa virkjun ERK í útrýmingarfasanum ERK er andstreymisvirkjun CREB og þar með er ERK virkjun nauðsynleg til að styrkja og endurþétta óttaminni (Schafe o.fl., 200{{31 }}; Duvarci o.fl., 2005). Hins vegar, ósamræmi, sást engin ERK virkjun í amygdala, hippocampus eða mPFC í endurþéttingarfasa þegar pERK var mældur 30 mín eftir endurvirkjunarlotuna (myndir 2-4). Þess vegna skoðuðum við tímaskeið ERK og CREB fosfórunar. Við gerðum svipaða tilraun og á myndum 2-4, nema að pCREB og pERK gildi voru mæld 5, 15 og 30 mín eftir endurvirkjunarlotuna (endurútsetning fyrir myrku hólfinu í {{ 66}}, 1 eða 10 mín; mynd 5A). Í samræmi við gögnin sem sýnd eru á myndum 2-4 sást marktæk aukning á pCREB1 taugafrumum eftir 30 mínútur, en ekki eftir 5 mínútur, eftir endurvirkjunarlotuna í Recon (amygdala, mPFC og hippocampus) og Ext (amygdala og mPFC) ) hópa, en ekki Tran hópinn (mynd 5E, einstefnu ANOVA, amygdala, 5 mín, F(3,23)=0.346, bls. 0.05, 30 mín, F(3,23)=15.272, p , 0,0001; mPFC, 5 mín., F(3,23)=1.169, bls. 0.05, 30 mín., F(3,23)=32. 346, bls, 0,0001; hippocampus, 5 mín., F(3,23)=0.154, bls. 0.05, 30 mín., F(3,23)=16.197, bls, 0,0001; óparað t próf, amygdala, endurþétting, 5 á móti 30 mín, t(12)=7.807, p , 0,0001, útrýming, 5 á móti 30 mín, t(12)=5.405, p { {73}}.0002; mPFC, endurþétting, 5 á móti 30 mín., t(12)=5.727, p , 0,0001, útrýming, 5 á móti 30 mín., t(12)=4.188 , p=0.0013; Hippocampal CA1 svæði, endurþétting, 5 á móti 30 mín., t(12)=2.339, p=0.0374).

Athyglisvert er að marktæk aukning á pERK1 taugafrumum sást í amygdala, mPFC og hippocampus í Recon, Tran og Ext hópunum 5 mínútum eftir endurvirkjunarlotuna samanborið við NR hópinn (Mynd 5F, amygdala, F(3,23)=10.961, bls=0.0001; mPFC, F(3,23)=7.525, p { {13}}.0011; hippocampus, F(3,23)=6.924, bls=0.0017). Þessar athuganir gáfu til kynna að ERK sé virkjað strax eftir endurvirkjunarlotuna í öllum minnisstigum. Hins vegar, þessi aukning á fjölda pERK1 taugafrumna fór aftur í grunngildi (sambærilegt við NR hópinn) 15 mínútum eftir endurvirkjunarlotuna (Mynd 5F, amygdala, F(3,20)=2.676, bls. 0,05; mPFC, F(3,23)=0.683, bls. 0.05; hippocampus, F(3,20)=0.74, bls. 0.05). Ennfremur, í samræmi við niðurstöðurnar sem sýndar eru á myndum 2-4, sáust marktækt fleiri pERK1 taugafrumur í amygdala, mPFC og hippocampus 30 mínútum eftir endurvirkjunarlotuna aðeins í Ext hópnum (Mynd 5F, amygdala, F( 3,23)=6.616, p=0.022; mPFC, F(3,23)=8.012, p=0.0008; hippocampus, F( 3,23)=6.206, bls=0.003). Þannig sýna endurþéttingar- og umbreytingarfasarnir tímabundna virkjun ERK aðeins á fyrri tímapunkti (5 mín), en útrýmingarfasinn sýnir tvífasa virkjun ERK snemma (5 mín) og seint (30 mín) tímapunkti eftir endurvirkjun. fundur. Þessar athuganir gáfu til kynna að aðferðir til að stjórna ERK virkjun eru mismunandi í endurþéttingu / umskipti og útrýmingarfasa. Samanlagt sýndu athuganir okkar að endurþéttingar-, umskipti- og útrýmingarfasar sýna mismunandi sameindaeinkenni.

Hlutverk ERK virkjunar í endurþéttingar- og útrýmingarstigum IA minni

Endurþétting/umskipti og útrýmingarfasar sýndu einfasa og tvífasa ERK virkjun, í sömu röð. Næst könnuðum við og bárum saman hlutverk snemma (5 mín) og seint (30 mín) ERK virkjunar í mPFC í endurþéttingar- og útrýmingarstigum með því að skoða áhrif þess að hindra ERK (mynd 6).

Umræða

Í þessari rannsókn könnuðum við aðferðir til að breyta minni frá endurþéttingu yfir í útrýmingarfasa eftir endurheimt IA minni. Við einkenndum fyrst hegðunareinkenni IA minnisfasa eftir endurheimt. Í samræmi við fyrri rannsókn okkar (Fukushima o.fl., 2014), IA minni endurheimt af völdum endurþéttingar og útrýmingar með endurútsetningu fyrir ljósi (0 mín í myrkri hólfi) og myrkri ( 3 eða 10 mín) hólf, í sömu röð. Athyglisvert er að IA minni var hvorki aukið né slökkt og sýndi ónæmi fyrir hömlun á próteinmyndun þegar mýsnar voru aftur útsettar fyrir dimma hólfinu í aðeins 1 mín. Þess vegna benda þessar athuganir til þess að 1-mín. endurútsetning fyrir myrka hólfinu hætti við framkalla endurþéttingar, en sé ófullnægjandi til að slökkva á IA minni. Ennfremur komumst við að því að ERK var virkjuð í amygdala, hippocampus og mPFC snemma (5 mín) eftir endurútsetningu fyrir dimma hólfinu í 0, 1 eða 10 mín. Í samræmi við það kom hömlun á ERK á þessum heilasvæðum í veg fyrir endurþéttingu/aukningu og útrýmingu IA minni. Mikilvægast er að ERK hömlun í amygdala, hippocampus og mPFC eftir 1-mín endurútsetningu í myrka hólfinu hindraði endurþéttingu-miðlaða aukningu á IA minni, sem bendir til þess að ERK virkjun eftir stutta (1 mín) endurútsetningu að myrka hólfið er nauðsynlegt til að hindra endurþéttingu IA minnis. Aftur á móti var 1-mín endurútsetning á myrka hólfinu ófullnægjandi til að slökkva á IA minni, þó að langvarandi endurútsetning á myrka hólfinu (3 eða 10 mín) slökkti á þessu minni. Þess vegna benda niðurstöður okkar til þess að 1-mín. endurútsetning fyrir myrka hólfinu valdi minnisbreytingarferli sem hættir við endurþéttingu/aukningu en kemur ekki af stað útrýmingarnámi. Sameiginlega leggjum við til að minnisbreytingarferlið stuðli að því að skipta minnisfasa frá endurþéttingu til útrýmingar með ERK-miðluðum forvörnum gegn endurþéttingu.

Svipað og núverandi athuganir okkar, sýndi nýleg rannsókn sem notaði heyrnarhræðsluskilyrði að stakar (1) eða langvarandi (10) CS kynningar valda endurþéttingu minnis og útrýmingar, í sömu röð, með aukningu á pERK stigum í basolateral svæði amygdala. Aftur á móti breyta miðlungs (4–7) CS kynningar ekki pERK stigum í basolateral svæðinu í amygdala. Mikilvægt er að ERK hömlun á miðlungs CS kynningum hafði ekki áhrif á óttaminni. Þessi rannsókn gaf til kynna að það væri umskipti á minnisfasa frá endurþéttingu til útrýmingar eftir endurheimt hræðsluminni (Merlo o.fl., 2018). Í þessari rannsókn útvíkkuðum við þessa niðurstöðu og lögðum til að umbreytingarfasinn skipti á virkan hátt minnisfasa frá endurþéttingu til útrýmingar með því að virkja ERK merkjaflutningsferilinn. Öfugt við fyrri niðurstöður (Merlo o.fl., 2018), komumst við að því að umbreytingarfasinn felur í sér ERK fosfórun í amygdala, hippocampus og mPFC. Þetta misræmi kann að vera vegna mismunar tímapunkta sem skoða ERK fosfórun; fyrri rannsóknin mældi pERK gildi við;12 mín eftir CS kynningu (Merlo o.fl., 2018), á meðan rannsóknin okkar sýndi að aukin pERK gildi fóru aftur í grunngildi um þetta leyti (15 mín eftir endurútsetningu). Að auki er mikilvægt að hafa í huga að IA verkefnið gerir kleift að fylgjast með aukningu á IA minni með endurþéttingu, sem leiðir til þess að við komumst að því að hömlun á ERK á umskiptafasa hamlar aukningu IA minni.

Fyrri rannsóknir hafa sýnt að ERK fosfórun er aukin í basolateral svæði amygdala á 20–60 mínútum eftir útrýmingarnám á kenndu óttaminni (Herry o.fl., 2006; Merlo o.fl., 2014, 2018), en hippocampus sýnir þessi virkjun á 1 klst. eftir útrýmingarnám á samhengis óttaminni (Fischer o.fl., 2007; Tronson o.fl., 2009). Í þessari rannsókn fengum við svipaðar athuganir að pERK eykst 30 mínútum eftir endurvirkjunarlotuna í útrýmingarfasanum. Þessar niðurstöður benda til þess að ERK fosfórun sé algeng sameindamerki seint útrýmingarfasans (20-60 mín).

Ennfremur sáum við að ERK virkjun á sér stað tvífasa snemma og seint (5 og 30 mín) eftir endurvirkjunarlotuna í útrýmingarfasanum, en þessi virkjun á sér stað einfasa á fyrri tímapunkti endurþéttingarstigsins (mynd 5). . Stöðugt, hindra ERK í heilasvæðum á þessum tímapunktum endurþéttingar- og útrýmingarfasa hindraði endurþéttingu/aukningu og langtímaútrýmingu, í sömu röð (mynd 6A, C-H). Þessar athuganir benda til þess að einfasa og tvífasa ERK virkjun sé nauðsynleg fyrir endurþéttingu-miðlaða aukningu og útrýmingu IA minni, í sömu röð. Það er mikilvægt að hafa í huga að ERK virkar sem andstreymis eftirlitsaðili CREB fosfórunar. Þess vegna getur tímabundin virkjun ERK í fyrstu minnisfasanum, að minnsta kosti að hluta, stuðlað að þessari fosfórun á CREB, sem virkjar tjáningu gena sem þarf til endurþéttingar og langtímaútrýmingar.

Svipað og fyrri niðurstöður okkar með því að nota samhengisfræðilega óttaskilyrðingu (Mamiya o.fl., 2009), var CREB virkjað í endurþéttingu (amygdala/hippocampus/mPFC) og útrýmingarfasa (amygdala/mPFC) en ERK var aðeins virkjað í útrýmingarfasanum 30 mín eftir endurvirkjunarlotuna. Í samræmi, aðeins einn íbúa pCREB1 / pERK– taugafrumum sást í endurþéttingu áfanga, en mismunandi taugafrumum íbúar sáust í útrýmingarfasa: pCREB1 / pERK- og pCREB1 / pERK1 taugafrumum í amygdala (mynd 2); pCREB– /pERK1 taugafrumur í hippocampus (mynd 3); og pCREB1/pERK-, pCREB- /pERK1 og pCREB1/pERK1 taugafrumum í mPFC (mynd 4). Þessar athuganir, sérstaklega hin andstæða athugun á pCREB–/pERK1 og pCREB1/pERK– taugafrumum, benda til þess að virkjun CREB og ERK sé stjórnað á mismunandi hátt á hverju heilasvæði þegar minnið er slökkt og að seinfasa virkjun ERK spilar sértækt og áberandi. hlutverk fyrir útrýmingu óttaminni samanborið við önnur minnisferli eins og styrkingu og endurþéttingu eins og fjallað er um hér að neðan. Athyglisvert var að við tókum eftir því að pERK1 taugafrumur voru algengari í mPFC samanborið við hippocampus og amygdala, þar sem mPFC sýndi hærra hlutfall pERK1 taugafruma (útrýmingarfasa) og pCREB1 taugafrumum (endurþéttingarfasa) samanborið við hippocampus og amygdala, sem bendir til þess að virkjun ERK í mPFC gegnir sértækara hlutverki í útrýmingu minni.

Það er enn óljóst hvort sami eða mismunandi hópar taugafrumna eru virkjaðir í endurþéttingu, umbreytingum og útrýmingarminni. Fyrri rannsókn benti á virkjun „ótta taugafrumna“ og „útrýmingartaugafrumna“ í amygdala þegar hræðsluminnið er endurvirkjað eða slökkt í sömu röð (Herry o.fl., 2008). Þess vegna er mögulegt að ERK og CREB séu virkjuð í mismunandi hópum taugafrumna með mismunandi tímasnið (þ.e. „endurþéttingartaugafrumur“ og útrýmingartaugafrumur). Eins og fjallað er um hér að ofan, geta pCREB1 taugafrumur, þar á meðal pCREB1/pERK1 taugafrumur, stjórnað endurþéttingu og langtímaútrýmingu IA minni með því að virkja tjáningu gena sem endurþéttingar- og útrýmingartaugafrumur, í sömu röð. Hins vegar getur ERK virkjun í pCREB- /pERK1 taugafrumum stuðlað að því að hætta við CREB-miðlaða umritunarvirkjun sem þyrfti til að endurþétta þar sem þessi ERK virkjun sést sérstaklega í seint útrýmingarfasa; ERK hefur virkjað í endurþéttingartaugafrumum til að hætta við virkjun genatjáningar í útrýmingarfasanum. Athyglisvert er að fyrri rannsókn sýndi að virkjun ERK í hippocampus hindrar framköllun c-fos þegar samhengis óttaminni er slökkt (Guedea o.fl., 2011), sem eykur möguleikann á að þessi ERK virkjun komi í veg fyrir CREB-merkjaferilinn. Það er mikilvægt að bera kennsl á taugafrumuhópana sem stjórna endurþéttingu, umskiptum og útrýmingu og að rannsaka sameindaeinkenni og starfræna þýðingu þessara taugafrumna. Að auki eru samskipti milli taugahópa sem greinst hafa í þessari rannsókn óþekkt. Hugsanlegt er að „útrýmingar- (umskipti) taugafrumur“ stýri virkni endurþéttingartaugafrumna til að hætta við að koma í veg fyrir endurþéttingu með samskiptum þeirra á milli (Eisenberg o.fl., 2003; Merlo o.fl., 2014). Þess vegna er einnig mikilvægt að skoða þessar milliverkanir í og ​​meðal amygdala, mPFC og hippocampus.

Áður sýndum við fram á að hippocampus sýnir enga breytingu á CREB fosfórun og Arc tjáningu í kjölfar útrýmingarnáms á samhengisótta, og stöðugt tekst hömlun á próteinmyndun í hippocampus í útrýmingarfasanum ekki að hindra langtímaútrýmingu (Mamiya o.fl. , 2009). Þessar athuganir hafa vakið upp þann möguleika að hippocampus sé ekki nauðsynleg til langtímaútrýmingar. Hins vegar sýndum við fram á að ERK er virkjað í hippocampus eftir útrýmingarnám á IA minni og stöðugt hindrar það að hindra ERK virkjun í hippocampus langtímaútrýmingu. Þess vegna benda núverandi athuganir okkar til mikilvægra hlutverka fyrir hippocampus í útrýmingu minni. Saman við fyrri niðurstöður okkar, leggjum við til að hippocampus sé nauðsynlegt fyrir minnisútrýmingu en ekki fyrir sameiningarlíkt ferli til að koma á stöðugleika í "útrýmingarminni" með því að virkja tjáningu gena.