Fyrsti hluti Acteoside bæld Microglia M1 skautun með hindruðum NF-KB boðleiðum og AMPK miðlaðri endurheimt hvatbera.
Mar 03, 2022
fyrir frekari upplýsingar:ali.ma@wecistanche.com
HLUTI 1 Hvernig auka Cistanche Acteosides heilafrumuþrótt og létta Alzheimerssjúkdóm?
Ying-Qi Li Kína lyfjaháskólinn
Yi Chen Kína lyfjafræðiháskóli
Si-Qi Jiang China Pharmaceutical University
Yuan-Yuan Shi lyfjaháskólinn í Kína
Xiao-Li Jiang Kína lyfjafræðiháskóli
Shan-Shan Wu China Pharmaceutical University
Ping Zhou China Pharmaceutical University
Hui-Ying Wang China Pharmaceutical University
Ping Li China Pharmaceutical University
Leitarorð rannsókna: akteósíð, BV-2 frumur, efnaskipti, RNA-seq, hvatberar, taugabólga
Ágrip
Bakgrunnur: Alzheimerssjúkdómur (AD) er algengasta tegund heilabilunar. Meðanakteósíð(ACT), efnasambandeinangraðfráCistanche tubulosa, býr yfirtaugaverndandi eiginleika. Hins vegar er undirliggjandi aðferðin við að stjórna skautun örvera enn illa útfærð. Aðferðir: Hér var AlCl3-framkallað AD líkan í sebra¦sh lirfum beitt til að afhjúpa meðferðaráhrif ACT. BV-2 frumur voru notaðar til að sýna fram á hlutverk ACT á skautun örgalla. RNA-röð, HPLC-Q-TOF-MS, western blot og sameindatenging voru sameinuð til að staðfesta virkni þess.
Niðurstöður: ACT batnaði verulega á tilraunahreyfingum og taugakerfissjúkdómum í sebra¦sh. Í kjölfarið bældi það M1 skautun og ýtti undir M2 svipgerð í LPS-framkölluðum BV-2 frumum. Við sýndum fyrst fram á að ACT hafði djúpstæð umritunaráhrif, sem fólu í sér stjórnun á lykilboðaleiðum í innblæstri, lífmyndun arginíns, sem og pantótenat og CoA lífmyndun, sem tengist starfsemi hvatbera. ACT meðferð dró úr M1 skautun microglia með því að hindra NF-KB boðleiðina. Og efnaskiptaleiðirnar voru enn frekar staðfestar með HPLC-Q-TOF-MS. Að auki leiðrétti ACT of mikið ROS til að endurheimta virkni hvatbera með AMPK-miðluðu PGC-1 og UCP-2 uppstjórnun, í samræmi við efnaskiptabreytingar. Það er forvitnilegt að ACT gæti tengst beint bæði NF-KB og AMPK, eins og sést af sameindatengingu. Ályktanir: Rannsóknin veitti innrennsliskerfi ACT og sýndi nýtt sjónarhorn sem byggir á truflun á starfsemi hvatbera til að sýna fram á tengsl milli efnaskipta og skautunar á örverum.
Bakgrunnur
Alzheimerssjúkdómur (AD) er algengur taugahrörnunarsjúkdómur sem fylgir vitrænni skerðingu og hreyfitruflunum[1]. Það einkennist af alvarlegu tapi á taugafrumum, senile skellum og tauga-¦brillary-flækjum[2]. Meingerð AD er fjölvídd og tengd taugabólga. Neuroin§ bræðsla er knúin áfram af virkjun glial frumna, nátengd þróun AD[3, 4]. Meðan á framgangi og versnun taugabólga stendur, er microglia talin lykilþátturinn. Microglia eru aðal ónæmisfrumurnar í miðtaugakerfinu. Það er nátengt hlaupi ferla, sem inniheldur heilaþroska, viðhalda hlutlausu umhverfi, auk þess að bregðast við meiðslum og viðgerðum[1]. Þar að auki er hægt að örva microglia í M1 svipgerð og tjáning pro-in§amatory cýtókína eykst þegar taugabólga-tengdir sjúkdómar eins og AD komu fram[5]. Rannsóknir sýna einnig að skautun í M1 svipgerð fylgir oft efnaskiptasjúkdómum [6], sem veldur ójafnvægi í orkuefnaskiptum og truflun á starfsemi hvatbera[7]. Þessar skaðlegu breytingar eru fengnar af taugahrörnun, jafnvel AD.
Akteósíð(ACT), fenýletanóíð glýkósíð, er fyrst og fremst unnið úrCistanchetubulosa. Vaxandi vísbendingar hafa bent til þessFRAMKVÆMAbjó yfir fjölmörgum lyfjafræðilegumstarfsemi, þar á meðal taugaverndandi [8], bólgueyðandi [9] og andoxunarefni [10] áhrif. Sérstaklega hefur verið greint frá því að ACT bætir náms- og minnisskerðingu ásamt því að stjórna orkuefnaskiptum í streptósótósín-völdum rottum [11]. Einnig hefur verið stungið upp á því að hindra frumudauða taugafrumu og hvatberaskemmda í tilraunamúsum með sjálfsofnæmisheilabólgu [12]. Hins vegar hafa færri rannsóknir beinst að áhrifum ACT á M1/M2 skautun microglia. Sérstaklega hafa ýmsar aðferðir, svo sem viðgerðir á starfsemi hvatbera og stjórnun á efnaskiptum frumna, ekki verið framkvæmd. Að auki, vélbúnaður afFRAMKVÆMAstuðlað að microglia M1/M2 skautun hefur verið órannsökuð. Þessari skýrslu var ætlað að kanna lækningalega virkni ACT sem og undirliggjandi sameindakerfiFRAMKVÆMAinnAD. Hérna,FRAMKVÆMAsýndi marktæk taugavarnaráhrif í AlCl3-framkalluðum AD sebrafiskalirfum. Að auki hamlaði ACT M1 skautun á áhrifaríkan hátt og stuðlaði að M2 svipgerðinni í BV-2 frumum af völdum LPS. RNA-sequencing (RNA-Seq) samþætt við metabolomics aðferð til að skilja betur undirliggjandi fyrirkomulag ACT við að stjórna microglia skautun. Könnuð var víxlræðing á milli efnaskipta og skautunar á örverum með tilliti til starfsemi hvatbera. Þessi rannsókn mun veita nýja virðingu fyrir frekari rannsókn á ACT sem hugsanlegu lækningaefni til að meðhöndla AD.
Aðferðir
Dýr og módelflokkur
Villigerð sebra¦sh (AB-stofn, 4 mánaða gamall) var valinn í þessari rannsókn (Nanjing Qi Wu Biotechnology Co., Ltd.). Þeim var haldið undir 14/10 klst. ljós/myrkri hringrás við 28 gráður, samkvæmt fyrri aðferð[13]. Náttúrulegur áburður og eðlilega þróuð fósturvísa voru mynduð og ræktuð í 3 daga eftir frjóvgun (pdf) í lýsingu útungunarvél. Allar tilraunir með sebrafiska voru gerðar undir eftirliti dýrasiðanefndar Kína lyfjaháskólans. Sebrafiskalirfur voru skipt í sex hópa og meðhöndlaðir frá 3 pdf til 7 pdf: samanburðarhópur, líkanhópur, líkan plús dónepezílhýdróklóríð (DPZ) hópur, líkan plús ACT hópar. Viðmiðunarhópnum var haldið í miðlinum með 0,2 prósent DMSO og líkanhópurinn var meðhöndlaður með 150 μM AlCl3 (pH 5,8). Líkanið ásamt DPZ hópnum var meðhöndlað með AlCl3 og 8 μM DPZ. Líkanið ásamt ACT hópum var meðhöndlað með AlCl3 og mismunandi styrkleika ACT (200, 100, 50 μM). ACT (HPLC hreinleiki meiri en eða jafnt og 98 prósent) var fengin frá Baoji Herbest Bio-Tech Co., Ltd. (Baoji, Kína). AlCl3·6H2O og DPZ voru keypt frá Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co., LTD. (Shanghai, Kína).
Atferlisgreining Bls. 3/34 Hreyfingar sebrafiska lirfa voru skráðar með ViewPoint atferlisgreiningartæki (Zebralab 2018, ViewPoint Life Sciences Co., Ltd.) við 28 gráður. Í stuttu máli, hegðunarbreytur og úrvinnsla niðurstaðna voru í samræmi við aðferðina sem við stofnuðum áðan[13]. Hér voru meðalhraði (AS), hraðabreyting (ΔS), batahraði hreyfitruflana (DRR) og svörunarvirkni (RE, prósent ) valin til að meta bata á hreyfitruflunum í sebrafiskum.
Ákvörðun á virkni asetýlkólínesterasa (AChE) og kólínasetýltransferasa (ChAT)
Eftir meðferð frá 3 pdf til 7 pdf var sebrafiskalirfum safnað til að mæla AChE og ChAT virkni.
Byggt á samskiptareglum framleiðandans var virknin greind með ensímtengdum ónæmissogandi prófun (ELISA) settum (MLBIO biotechnology Co. Ltd., Shanghai, Kína). Og próteinstyrkur mismunandi sýna var ákvarðaður með BCA aðferðinni
Frumuræktun og meðferðir
BV-2 frumulína (ódauðleg múslímfrumulína) var keypt frá American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, Bandaríkjunum). Þau voru ræktuð í DMEM (KeyGen Biotech Co., Ltd, Nanjing, Kína). Miðillinn var bætt við 10 prósent FBS (Gibco, Grand Island, NY, Bandaríkjunum), 100 U/mL penicillíni, auk 100 mg/ml streptomycin, með 95 prósent lofti/5 prósent CO2 við 37 gráður. BV-2 frumur voru ræktaðar með ACT (50, 25, 12,5 μM) eða örvaðar með Lipopolysaccharide (LPS, 1 ug/mL; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) í 24 klst. Að lokum var öllum frumum eða floti safnað fyrir hinar ýmsu greiningar.
Frumulífvænleikapróf
Frumutalningarsett-8 (CCK-8) próf (JianCheng Bioengineering Institute, Nanjing, Kína) var notað til að meta lífvænleika BV-2 frumna. Frumunum var sáð í 96-brunnsplötu (1×104 frumur/brunn, Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd.). Í stuttu máli var miðillinn fjarlægður í lok meðferðar og 100 μL af sermifríu miðli sem innihélt CCK-8 lausn var bætt við hvern brunn í 2 klst við 37 gráður. Gleypið var mælt við 450 nm með örplötulesara (Bio-Tek Instrument, Winooski, VT, Bandaríkjunum). Frumulífvænleiki er gefinn upp sem hlutfall af samanburðarhópnum. Tilraunin var endurtekin þrisvar sinnum.
Nituroxíð (NO) framleiðslupróf
NO var ákvarðað með því að mæla nítrítmagn í BV-2 ræktunarfljótandi vökva með því að nota Griess hvarfefni. Í stuttu máli, í lok meðferðar, var miðillinn (100 μL) fluttur yfir á nýja 96-brunnsplötu. Sama rúmmáli af Griess hvarfefni var bætt við hvern brunn og hvarf í 15 mínútur í myrkri. Frásogið við 540 nm var ákvarðað með Microplate Reader.
Magn bólgusýtókína í flotinu
Styrkur TNF-, IL-1 og IL-10 í BV-2 frumu floti var ákvarðaður með ELISA settum samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda (MLBIO biotechnology Co. Ltd., Shanghai, Kína ).
Athugun á formgerð frumna
Til að ákvarða áhrif ACT á M1/M2 skautun BV-2 frumna voru frumurnar settar í 6-brunnsskál og skoðaðar undir öfugum smásjá (Nikon ECLIPSE Ti2, Japan).
Ákvörðun frumuefnaskipta með HPLC-Q-TOF-MS greiningu
BV{{0}} frumum var sáð í 6-brunnsskál sérstaklega (n=6/hópur). Eftir meðferð var miðillinn fjarlægður og frumurnar þvegnar þrisvar sinnum með köldu PBS. Síðan strax útsett fyrir fljótandi köfnunarefni til að bæla umbrot frumna. Frumurnar voru safnaðar með köldu 80 prósenta metanóli (1 ml/brunn) og sviflausnin var flutt yfir í 2 ml Eppendorf rör. Til að auðvelda útfellingu próteina, hringið kröftuglega í 1 mín og skilið við 13,000 snúninga á mínútu í 15 mínútur við 4 gráður. Frumusviflausnin var flutt yfir í nýtt 2 ml Eppendorf rör og þurrkuð undir köfnunarefnisstraumi og geymd við -80 gráðu þar til greiningar. Þurrkuðu leifin var blönduð í 15{{40}} μL af forkældu 25 prósenta asetónítríl. Til að tryggja stöðugleika og nákvæmni raðgreiningarinnar var jafnt rúmmál (10 μL) af hverju frumusýni sameinað sem gæðaeftirlitssýni (QC). Við greiningu umbrotsefna voru þessi sýni sprautuð eftir sex frumusýni til að staðfesta stöðugleika þeirra. 1 μL skammtur var sprautaður fyrir HPLC-Q-TOF-MS. HPLC-Q-TOF-MS greining var gerð á Agilent 1290 HPLC kerfi sem var tengt við Agilent 6530 Quadrupole Time-of-Flight (Q-TOF) massarófsmæli (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, Bandaríkjunum). Aðskilnaðurinn var framkvæmdur á ACQUITY UPLC BEH C18 súlu (2,1×100 mm, 1,7 μm). Hreyfanlegur fasi var samsettur úr 0,1 prósent maurasýru-vatni (v/v; A) og asetónítríl (B). §hraðinn var stilltur á 0,4 ml/mín með eftirfarandi ákjósanlega halla skolunarskilyrði: 0 til 2 mínútur, 5 prósent B; 2 til 20 mínútur, 5 prósent til 95 prósent B (jákvæð jónastilling); 0 til 2 mín., 5 prósent B; 2 til 20 mínútur, 5 prósent til 95 prósent B (neikvæð jónastilling). Rekstrarfæribreytur massarófsmælisins voru stilltar sem hér segir: gashiti, 320 gráður; þurrkunargas, 10 l/mín; úðabrúsa, 35 psi; VCap, 4000 V; brot, 120 V. Hrágögnin voru rekin undir MassHunter Workstation Software útgáfu B.07.00 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, Bandaríkjunum). Hrá gögnin voru fyrirfram unnin af XCMS pallinum. Aðalhlutagreining (PCA) og aðgreining minnstu ferninga að hluta (PLS-DA) á staðlaðu gögnunum voru gerðar með MetaboAnalyst (https://www.metaboanalyst.ca). Ásamt bókmenntum voru mismunandi umbrotsefni (VIP > 1, T-próf P < 0,05)="" auðkennd="" á="" hmdb="" (https://hmdb.ca).="" að="" lokum="" var="" ferilgreining="" gerð="" með="">
Mæling á hvatberahimnugetu (MMP)
MMP var greint með því að nota §ljósmyndandi rannsaka JC-1 (Beyotime, Kína) í samræmi við leiðbeiningar framleiðanda. Í stuttu máli voru frumur úr mismunandi hópum skolaðar með PBS og ræktaðar með JC-1 litunarlausn í 20 mínútur við 37 gráður. Eftir litun voru frumur þvegnar tvisvar með litunarbuffi. Síðan voru flúrljómunarmerki greind með frumuflæðismælingu (BD Accuri C6).
Mæling á hvatbera adenósíni 5'-þrífosfati (ATP)
ATP styrkur í hvatberum var greindur með ATP prófunarbúnaði (Beyotime, Kína) í samræmi við leiðbeiningar framleiðanda. Í stuttu máli var ræktunarmiðli BV-2 frumna úr mismunandi hópum hent og frumur voru einsleitar með lýsisbuffi á ís. Yfirvatnið sem fékkst eftir skilvindu (12,000 g, 5 mín) var notað til að ákvarða ATP styrkinn. Lýsingin (lúsiferasa-hvatað §uorescein hvarf) var greint með EnVision Multimode Microplate Reader (PerkinElmer).
Mæling á magni innanfrumu viðbragðs súrefnistegunda (ROS).
ROS prófunarsett (Beyotime, Kína) var notað til að mæla ROS stig. Frumurnar úr mismunandi hópum voru ræktaðar með DCFH-DA (10 μM) í 20 mínútur við 37 gráður. Eftir hleðslu rannsakanda voru frumur þvegnar þrisvar sinnum með DMEM. Síðan greindust birtumerki með frumuflæðismælingu (BD Accuri C6)
Sendingar rafeindasmásjá (TEM)
BV-2 frumum var sáð í 6-brunnsskál. Miðillinn var fjarlægður og 1 ml af 2,5% glútaraldehýði var bætt í hvern brunn hratt. Síðan voru frumurnar fluttar yfir í 1,5 ml Eppendorf túpu og skilið í skilvindu við 1000 rpm í 3 mín. Frumurnar voru festar yfir nótt með nýju 2,5 prósent glútaraldehýði við 4 gráður. Eftir ¦xation, þurrkun og innfellingu var fylgst með frumunum með HT7800 rafeindasmásjá (Hitachi, Tokyo, Japan).
RNA-seq og lífupplýsingagagnagreining
Heildar-RNA frá BV-2 frumum (n=3/hópur) voru dregin út með því að nota Trizol hvarfefni (Vazyme Biotech, Kína) samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda hvarfefna. Öll greiningarsýni voru send til Majorbio (Shanghai Majorbio Bio-pharm Technology Co., Ltd.) til að framkvæma RNA raðgreininguna. Gögnin voru greind á ókeypis netvettvangi Majorbio Cloud Platform. Færibreytur fyrir mismunatjáningargreiningu voruP-stilla < 0.05 og |log2FC|Stærri en eða jöfn1. Upprunalegu raðgögnin hafa verið send í gagnagrunn NCBI Sequence Read Archive (SRA).
Magnbundin rauntíma pólýmerasa keðjuverkun (qRT-PCR)
Heildar-RNA af BV-2 frumum í hverjum hópi var safnað með því að nota 500 μL RNA-easyTM einangrunarhvarf (Vazyme Biotech, Kína), og öfug umritunarviðbrögð voru framkvæmd með FastKing-RT SuperMix (TIANGEN Biotech, Kína) . Viðbrögð voru framkvæmd í samræmi við samskiptareglur framleiðanda. cDNA var gert með qRT-PCR prófum með sérstökum grunnum og TransStart TOP Green qPCR SuperMix (TransGen Biotech, Kína). Grunnarnir eru skráðir í töflu S1 (sjá viðbótarskrá 1) og -aktín var notað sem innra eftirlit. 2-ΔΔCT aðferðin var notuð fyrir megindlega greiningu.
Western blot greining
BV-2 frumur voru ljósaðar með RIPA lýsisbuffi (KeyGen Biotech Co., Ltd, Nanjing, Kína) sem innihélt 1 prósent próteasahemlakokteil (Thermo Fisher) til að fá heildarprótein. 10 prósent SDS-PAGE var framkvæmd til að aðskilja próteinin, sem voru flutt yfir á NC himnur. Eftir blokkun með 5 prósenta undanrennu/BSA í 2 klst, voru himnurnar ræktaðar með AMPK (Proteintech), p-AMPK (A¨nity Biosciences), PGC-1 (Proteintech), NF-κB (Proteintech), p-NF-κB (ABclonal), eða GAPDH (ABclonal) mótefni í 5 prósent TBST við 4 gráður yfir nótt. Himnurnar voru ræktaðar með öðru piparrótarperoxídasa-tengdu mótefni (ABclonal) í 1 klst við stofuhita. High-sig ECL western blotting hvarfefnið (Tanon, Kína), hlaupmyndakerfi (Tanon, Kína) og ImageJ hugbúnaður voru notaðir til að sýna og magngreina.
Sameindabryggju
Sameindatengingargreiningar voru gerðar með Autodock hugbúnaði (útgáfa 4.2). Sæknin milli ACT og próteina kom fram með AutodockTools hugbúnaðinum. Þrívíddar (3D) próteinbyggingar AMPK (PDB ID: 5g5j) og NF-κB (PDB ID: 4q3j) voru sóttar úr próteingagnabankanum
tölfræðigreining
Öll gögn eru gefin upp sem meðaltal ± staðalfrávik (SD). Munurinn á mismunandi hópum var greindur með einhliða dreifigreiningu (ANOVA) og síðan Tukey's margfeldi.
Niðurstöður
ACT létti hreyfitruflun og bætti kólínvirka kerfisvirkni í sebrafiskalirfum
AlCl3-framkallað AD líkan í sebrafiskalirfum var notað til að sýna fram á áhrif ACT á AD. Í fyrsta lagi var fylgst með hreyfingu sebrafiskalirfa innan ljóss/myrkurs hringrásar og sundslóðir þeirra skráðar (mynd 1a, 1b). AS og ΔS hreyfingar sebrafiska framkallað af AlCl3 á samsvarandi tíma eftir gjöf voru reiknuð. Niðurstöðurnar sýndu að mismunandi skammtar af ACT jukust á áhrifaríkan hátt AS og ΔS sebrafiska (mynd 1c). DRR og RE afhjúpuðu meira leiðandi samanburð á ACT og DPZ (mynd 1d). Í samræmi við það léttir ACT hreyfitruflun og sýndi svipuð áhrif og DPZ. Það er almennt sammála um að kólínvirka kerfið gegnir mikilvægu hlutverki í náms- og minnisferlum. Þannig var starfsemi AChE og ChAT notuð til að sýna fram á áhrif ACT. AlCl3 útsetning í sebrafiskum sem sýnd eru með kólínvirkri breytingu í heila (mynd 1e). Það var áberandi að ACT meðferð bældi virkni AChE. Að auki sýndi virkni ChAT minnkun eftir ACT meðferð. Í stuttu máli, ACT sýndi mikil áhrif á kólínvirka kerfisvirkni í AlCl3-framkölluðum AD sebrafiskalirfum.
ACT bældi M1 skautun og stuðlaði að M2 skautun í LPS-framkölluðum BV-2 frumum
Áhrif ACT á skautun örvera voru rannsökuðin vitromeð BV-2 örfrumum. LPS minnkaði verulega lífvænleika BV-2 frumna eftir að hafa verið meðhöndluð í 24 klst. Sem betur fer jók ACT frumulífvænleika BV-2 frumna af völdum LPS (mynd 2a). Að auki sást formgerð BV-2 frumna. Eftir 24 klst af LPS örvun sýndi það að BV-2 frumur fóru í M1 skautunarástand. Og formfræðilegar breytingar voru komið í veg fyrir með ACT sammeðferð (mynd 2b). Þar að auki bentu niðurstöðurnar til þess að ólíkt BV-2 frumum örvuðum af LPS, sýndu BV-2 frumur sem voru meðhöndlaðar með ACT verulega bælt TNF- (mynd 2c), IL-1 ( Mynd 2d), og NO (Mynd 2f) tjáning í frumu ofanvatni. Þetta eru klassísk frumudrepandi frumudrep sem vísbendingar um skautun M1 míkrógljáa. Svipað og niðurstöður ELISA komust niðurstöður qPCR í ljós að TNF-, nituroxíðsyntasa (iNOS), IL-1 og CD86 mRNA tjáning var marktæk.hindrað með ACT meðferð samanborið við LPS hópinn (mynd 3a). Ennfremur mældum við M2 microglia skautun með ELISA (Mynd 2e) og qPCR (Mynd 3b), niðurstöður þeirra gáfu til kynna að ACT jók marktækt M2 microglia-tengd tjáningu merkja (IL-10, CD206 , TGF- og Arg-1). Samanlagt sýndu þessar niðurstöður að ACT bældi M1 míkrógljáskautun og stuðlaði að M2 svipgerðinni.
ACT stjórnaði M1/M2 skautun með hömlun á NF-KB boðleiðum í BV-2 frumum af völdum LPS
Uppskriftargreiningin var framkvæmd með RNA-seq til að skilja virkni ACT í BV-2 frumum frá heildarstigi. PCA sýndi að vel væri hægt að greina á milli stjórna, LPS og ACT hópa (mynd 4a). Það leiddi í ljós 899 mismunandi gena (DEG) á milli viðmiðunarhópsins og LPS hópsins, en 49 gráður voru á milli LPS hópsins og ACT hópsins (mynd 4b). Samkvæmt, Gene Ontology (GO) auðgunargreining (Mynd. 4c) og Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) auðgunargreining (Mynd. 4d) afhjúpaði að áhrif ACT var þátt í NF-KB merkjaleiðinni. Gengið sem tengist NF-KB boðleiðinni var staðfest enn frekar og LPS hafði vissulega áhrif á samstöðu þeirra. Eins og búist var við hafði ACT veruleg áhrif á tjáningu þeirra (mynd 4e). NF-κB merkjaleið er klassísk leið til að stjórna framgangi sýkingar, sem að lokum leiðir til losunar bólgueyðandi þátta. Til að öðlast vélrænan stuðning var lykilprótein í NF-KB merkjaleiðinni metið með Western blot greiningu. LPS örvun leiddi til virkjunar NF-KB, sem tengist því að stuðla að M1 skautun. Í samræmi við RNA-seq greiningu hamlaði ACT LPS-örvaða NF-KB fosfórun (mynd 4f). Þess vegna lét ACT af LPS-framkallaðri M1 skautun í gegnum NF-KB boðleiðina í BV-2 frumum.
ACT skerti lífmyndun arginíns sem og pantótenat- og CoA-lífmyndun í BV-2 frumum af völdum LPS
RNA-seq sýndi fram á að leiðirnar sem hafa áhrif á ACT innihéldu einnig myndun arginíns (Arg) sem og pantótenat og CoA lífmyndun (mynd 4d). Og það hefur verið gefið til kynna að LPS örvun valdi efnaskiptatruflunum í BV-2 frumum sem tengjast M1 skautun[14]. Þannig var ómarkmið frumuumbrot með HPLC-Q-TOF-MS notað til að bera kennsl á áhrif ACT á umbrot frumna. PCA (mynd 5a) og PLS-DA (mynd 5b) sýndu að hægt væri að greina vel á milli stjórnunar-, LPS- og ACT-hópanna út frá umbrotsefnum innanfrumu. Magn ýmissa umbrotsefna í BV-2 frumum af völdum LPS var breytt eftir ACT meðferð (mynd 5c). Í samanburði við samanburðarhópinn voru 11 umbrotsefni sem breyttust verulega í LPS hópnum (tafla S2, sjá viðbótarlið 2). Þar sem 14 umbrotsefni voru greinilega breytt eftir meðhöndlun á ACT (tafla S3, sjá viðbótarlið 3), sem tóku þátt í 11 efnaskiptaferlum (mynd 5d). Áhrif ACT fólust aðallega í því að stjórna umbrotum amínósýra (lífmyndun fenýlalaníns, týrósíns og tryptófans, umbrots D-glútamíns og D-glútamats, nýmyndunar Arg, umbrots fenýlalaníns), núkleótíðumbrota (umbrot púríns, umbrots pýrimídíns), orkuefnaskipta (nitrogen). umbrot), sem og umbrot samþátta og vítamína (pantóþenat og CoA lífmyndun). Athyglisvert er að efnaskiptaferlar sem fengust með umbrotsefni voru í samræmi við RNA-seq, þar á meðal Arg lífmyndun sem og pantótenat og CoA lífmyndun. Ofangreint sýndi að ACT gæti stjórnað Arg lífmyndun sem og pantótenat og CoA lífmyndun í LPS-örvuðum BV-2 frumum.
Acta milded Lps-induced Bv-2 Vanstarfsemi hvatbera
Hvatberar eru kjarninn í efnaskiptaferlum. Vísbendingar eru að þróast um að hvatberar séu lykilaðilar í M1/M2 skautun örvera. Fyrri rannsóknir sýndu að LPS gæti valdið truflun á starfsemi hvatbera. Yfirlit yfir stöðu hvatbera í formgerð og frumudreifingu var metið með TEM. Eftir LPS örvun sýndu BV-2 frumur þéttingu kjarna litninga, minnkað umfrymi, auk færri hvatbera (mynd 6a). Að auki var hvatberakrista LPS hópsins óraðað eða jafnvel horfið, sem sýndi að hluta kristolýsu, minni stærð og hringlaga formgerð. Athyglisvert er að ACT meðferð gæti dregið úr LPS-völdum formfræðilegum breytingum í hvatberum. Til skiptis skoðuðum við starfsemi hvatbera LPS-meðhöndlaðra BV-2 frumna, þar á meðal MMP, og ATP framleiðslu hvatbera. MMP (mynd 6b, 6c) og ATP framleiðsla í hvatberum (mynd 6d) var verulega bætt í frumum sem voru meðhöndlaðar með ACT samanborið við þær í LPS hópnum. Truflun á starfsemi hvatbera getur tengst auknu magni ROS í frumunni. Flæðifrumugreining leiddi í ljós að innihald ROS var ofhleðsla í LPS hópnum (mynd 6e, 6f). Sem betur fer útrýmdi ACT óhóflega ROS. Það bendir til þess að ACT geti endurheimt starfsemi hvatbera með því að hreinsa ROS.
ACT endurheimti starfsemi hvatbera með uppstjórnun PGC-1 og UCP-2
Peroxisome proliferative activated receptor-co-activator-1 (PGC-1) gegnir mikilvægu hlutverki í lífmyndun hvatbera[15]. Örvun LPS dró úr tjáningu PGC-1, sem sýndi truflun á starfsemi hvatbera. Merkilegt nokk, PGC-1 gena mRNA og prótein tjáning var verulega snúið við með ACT meðferð í LPS meðhöndluðum BV-2 frumum (Mynd 7a). Einnig var vitað að hvatberapróteinið-2 (UCP-2) stjórnar starfsemi hvatbera. Sem downstream prótein PGC-1 getur það stjórnað LPS-framkallaðri MMP afskautun og ROS framleiðslu. Nýlegar skýrslur benda til þess að það sé miðlægt í ferli örvunar örvunar, með gagnstæða stjórnun á M1 og M2 skautun[16]. Western blot niðurstöður sýndu að UCP-2 próteinmagn var lækkað eftir LPS örvun. Samhliða meðferð á LPS og ACT gæti aukið tjáningu UCP-2 samanborið við LPS meðferðina. MRNA tjáningarstig UCP-2 sýndi einnig svipaðar breytingar (mynd 7b). Samanlagt endurheimti ACT starfsemi hvatbera með uppstjórnun PGC-1 og UCP-2.
ACT bældi microglia M1 skautun með endurheimt hvatberavirkni með AMPK virkjun
AMP-virkjaður próteinkínasi (AMPK), sem lykilorkuskynjari frumunnar, gegnir mikilvægu hlutverki við að viðhalda jafnvægi í efnaskiptum frumna. Á sama tíma er PGC-1 downstream prótein AMPK. Niðurstöður leiddu í ljós að LPS hamlaði virkjun AMPK, sem leiddi til efnaskiptatruflana í frumum og truflun á starfsemi hvatbera. Það er athyglisvert að ACT gæti skammtaháð aukið próteintjáningu p-AMPK (mynd 8a). Lagt er til að ACT gæti aukið tjáningu PGC-1 og endurheimt starfsemi hvatbera með því að virkja AMPK boðferilinn. Í þessari rannsókn, til að kanna hvort virkjun AMPK stuðlaði að stjórnunaráhrifum ACT á M1/M2 skautun, var efnasamband C (CC) notað til að hindra áhrif AMPK. Öfugt við niðurstýrða NO stigið í ACT meðferðarhópnum, hindraði CC að hluta til áhrif ACT á NO stigið (mynd 8d). Byggt á þessum niðurstöðum gæti ACT stjórnað M1/M2 skautun BV-2 frumna með því að virkja AMPK.
ACT tengi við og hamlaði NF-KB sem og virkjað AMPK
Sameindatenging var beitt til að staðfesta hvort ACT binst NF-KB og AMPK próteinum. Niðurstöður sýndu að bindingarorka ACT og NF-kB var - 8,4 kcal/mól, hvor af ACT og AMPK var - 10,8 kcal/mól. Mikilvægir aðilar staðfestu að ACT sé beint bundið við NF-κB og AMPK (mynd 9). Í kjölfarið voru mögulegir bindingarhættir og milliverkanir innan amínósýruvasans kannaðar frekar, þar á meðal Phe A146, Pro A147, Asn A240, Leu A236, Arg A232, His A183, Arg A239, Glu A179, Cys A149 og Tyr A227 af NF -κB (mynd 9c) auk Phe A213, Gly A481, Ala A370, Leu A482, Arg A212, Ile A369, Arg A106, Phe A215, Phe A108, Thr A309, Ser A119, og Thr A22ig4 . 9f). Þessar niðurstöður bentu til þess að ACT gæti haft bein áhrif á NF-KB og AMPK til að draga úr BV-2 míkróglia M1 skautun og stuðla að M2 svipgerðinni.
