Akteósíð úr Cistanche bætir beinþynningu af völdum sykurstera með því að virkja PI3K/AKT/mTOR leið

Ágrip

Hlutlæg

Sykursterar eru mikið notaðir í klínískri starfsemi; þó geta þau valdið aukaverkunum, svo sembeinþynningu. Akteósíð(ACT) frá Cistanche hefur verið notað til að berjast gegn ýmsum sjúkdómum. Rannsóknin var gerð til að meta virkni ACT hjá sykurstera af völdum sykursterabeinþynningu(GIOP) og hugsanleg kerfi þess.

Aðferðir
Dexametasón (Dex) var sprautað í vöðva til að örvabeinþynninguí rottulíkani og ACT var gefið munnlega. ACT var bætt við in vivo í Dex-örvuðumbeinþynningarMC3T3-E1 frumur. RT-qPCR var framkvæmt til að meta mRNA magn afbeinmyndun(Runx2, CoL1A1), og beinupptöku (OPG og RANKL). ELISA setti í sölu var notað til að meta sermisþéttni OC og CTX. Western blot var gert til að meta próteinmagn í PI3K/AKT/mTOR boðleiðinni. CCK-8 greining og frumuflæðisgreining voru framkvæmd til að meta lífvænleika beinfrumuefna og frumudauða.

Smelltu hér til að fá Cistanche Acteoside til að meðhöndla Dex-örvaða beinþynningu

Niðurstöður
ACT minnkaði skerðingu beina af völdum Dex, jók þéttni OC í sermi og minnkaði þéttni CTX (P< 0.05). In the MC3T3-E1 cells, Dex inhibited cell viability and stuðlað að frumudauða; Hins vegar voru þessi áhrif mjög dregin af ACT (P< 0.05). Concurrently, ACT reversed the reduction in Runx2, osterix, CoL1A1, and OPG mRNA levels, ALP activity, and the promotion of RANKL by Dex. Additionally, ACT attenuated Dex-induced inhibition of p-AKT/AKT, p-mTOR/mTOR, and p-PI3K/PI3K protein levels by Dex (P < 0.05), while the PI3K/AKT/mTOR pathway inhibitor LY294002 diminished the potential effect of ACT (P < 0.05).

Niðurstaða
ACT fráCistanchegetur haft beinverndandi áhrif með því að virkja PI3K/AKT/mTOR boðleiðina til að draga úr beinþynningu af völdum Dex.

Leitarorð:Akteósíð Cistancheaf völdum sykursterabeinþynningu

Kynning
Beinþynning (OP) er almennur beinagrindarsjúkdómur sem einkennist af lágum beinmassa, eyðileggingu á örbyggingu beinvefs og ójafnvægi í jafnvægi í beinum [1]. OP veldur meira en 8,9 milljónum beinbrota á ári og beinþynningarbrot eiga sér stað næstum á 3 sekúndna fresti, sem leiðir til ævilangrar fötlunar eða dauða [2]. Sykursterar (GCs) eru almennt gefnir til að meðhöndla bólgusjúkdóma sem ekki eru smitandi (svo sem astma og bólgusjúkdómar) sem og sjálfsofnæmissjúkdóma [3]. Hins vegar, langvarandi GC notkun hefur tilhneigingu til meira en 30 prósent OP tilfella og meira en 10 prósent beindreps tilfella [4]. GCs hamla beint útbreiðslu og aðgreiningu beinfrumuefna [5], draga úr þroska og virkni og framkalla frumufrumu beinþynningar, sem aftur leiðir til þróunar sykurstera-framkallaðrar beinþynningar (GIOP) [6]. Þar að auki benda vaxandi vísbendingar til þess að truflun á beinþynningum sé helsta orsök beinataps. Þess vegna virðist aukning á fjölda og virkni beinþynningar vera helsta aðferðin til að koma í veg fyrir OP, sérstaklega GIOP.

Jurtalyf, sérstaklega þau sem eru byggð á náttúrulegum efnasamböndum, hafa verið notuð í þúsundir ára til að meðhöndla ýmsa sjúkdóma [7]. Cistanche er dýrmæt jurt skráð í kínversku lyfjaskránni sem vex í suðurhluta Xinjiang Uygur sjálfstjórnarsvæðisins og er þekkt sem eyðimerkurginseng [8]. Sýnt hefur verið fram á að Cistanche hefur ýmis áhrif, svo sem ónæmisaukning, nýrnavörn, öldrun, andoxunarefni, bólgueyðandi og taugaverndandi áhrif [9].Akteósíð(ACT) er fenýl etanól glúkósíð í Cistanche, sem hefur líffræðilega virkni, svo sem hömlun á frumudauða taugafrumu [10], léttir á lifrarskemmdum [11], bólgueyðandi [12], andoxun [13] , forvarnir gegn sykursýki [14] og offitu [15], sem og hrörnun liðbrjósks [16]. Jafnframt hafa nokkrar rannsóknir greint frá lyfjahvörfum ACT og staðfest að lækningaáhrifin eru til staðar jafnvel þótt notkun til inntöku sé aðeins 0,12 prósent. ACT er talið forlyf með virk umbrotsefni in vivo [17].

Zhang o.fl. sýndi fram á hugsanleg verndandi áhrif ACT á beinþynningu af völdum eggjastokka í rottum [18]. ACT mótar IGF-1/PI3K/mTOR merkjaleiðina til að koma í veg fyrir beinmissi hjá rottum með sykursýki [19]. Greint hefur verið frá því að PI3K/AKT/mTOR ferillinn gegni mikilvægu stjórnunarhlutverki í ýmsum sjúkdómum, þar á meðal GIOP [20]. Naringin dregur úr GIOP með því að stjórna PI3K/AKT/mTOR merkjaleiðinni [21]. Að auki stjórnar þessi boðleið aðgreining beinfrumuefna [22], beinmyndun [23] og beinbrotalækninga [24]. Hins vegar er hugsanlegt hlutverk ACT á GIOP og hvort það sé stjórnað af mótun PI3K/AKT/mTOR merkjaleiðarinnar óþekkt.

Þessi rannsókn miðar að því að skilja verndandi áhrif ACT í GIOP rottulíkani og beinfrumur in vitro og að skýra undirliggjandi sameindakerfi.

efni og aðferðir
Tilraunadýr
Fjörutíu 8-vikugamlar Sprague-Dawley (SD) karlkyns rottur sem vógu 280–340 g voru fengnar frá Shanghai Laboratory Animal Center (CAS, Shanghai, Kína). Umönnunaraðferðir tilraunadýranna voru framkvæmdar í samræmi við siðareglur sem samþykktar voru af þriðja tengda sjúkrahúsinu í Qiqihar Medical University dýrasiðanefnd. Og rannsóknin var gerð í samræmi við ARRIVE leiðbeiningarnar. Dýr voru geymd í dýrastöðvum laus við sýkla, 24 ± 2 gráður, 12 klst ljós og myrkur hringrás, 50 ± 5 prósent rakastig og með frjálsan aðgang að mat og vatni.

GIOP módel smíði
Eftir 7 daga aðlögunarfóðrun var rottum skipt af handahófi í samanburðar- og módelhópa með því að nota slembitölutöfluaðferðina, Dexamethasone (Dex, Sigma-Aldrich St. Louis, MO, USA) 5 mg/kg tvisvar í viku í 6 vikur var sprautað. í vöðva til að framkalla OP hjá rottum í líkanahópnum [25]. Rottum í samanburðarhópnum (n = 10) var sprautað með jöfnu magni af saltvatni. Engar marktækar breytingar á líkamsþyngd sáust hjá rottum í báðum hópum eftir 6 vikur. Í kjölfarið var rottunum í líkanahópnum skipt í líkanahópinn, ACT lágskammtahópinn (Model plus ACT-L) hópinn og ACT háskammtahópinn (Model plus ACT-H) hópinn. ACT (HPLC 98 prósent) var fengin frá Baoji Herbest Bio-tech., Ltd. (Baoji, Kína), og meðhöndluð með vatnskenndri leysisviflausn. Skammtur upp á 50 mg/kg/d og 100 mg/kg/d ACT var gefinn til inntöku handa rottum í lágskammta og stóra skammtahópnum (8 rottur í hverjum hópi), í sömu röð og var haldið áfram í 8 vikur. Meðal þeirra var úrtaksstærð reiknuð út frá fyrri rannsókn [26]. Miðað við tvíhliða marktektarstig upp á 0,05 [95 prósent öryggisbil (= 0.05)], 80 prósent afl og áhrifastærð 0,5, áætlaði kraftgreining nauðsynlega úrtaksstærð upp á 6 dýr í hverjum hópi að því gefnu að viðeigandi áhrifastig upp á 30 prósent beinþynningu. Ennfremur, með brottfall upp á 20 prósent, voru 8 dýr í hverjum hópi (samtals 32 rottur) talin tilvalin.

Sermi sýni úr rottum
Eftir 8 vikur voru rottur svæfðar með 10 prósent klóralhýdrati (400 mg/kg, í kviðarhol, Solarbio, Peking Kína), blóði var safnað úr kviðarholi, storknað við stofuhita og skilið í skilvindu við 3500 rpm/mín í 10 mínútur. Serumið var geymt í 1,5 ml skilvinduglösum þar til frekari notkun.

Mat á beinþéttni
Beinþéttleiki (BMD) var notaður með DAX beinþéttnimæli fyrir smádýr (Ranzhe Instrument Equipment Co., Shanghai, Kína). Í stuttu máli voru rotturnar settar í liggjandi stöðu og afturútlimir settir út. Hægra lærlegg rottanna var skannað samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda og BMD gildi skráð [27].

Greining á beinformi
Í lok tilraunarinnar voru rotturnar aflífaðar með inndælingu í kviðarholi af umfram klóralhýdrati og lærleggirnir festir í 70 prósent etanóli. Í kjölfarið voru gerðar skannanir á VivaCT 40μCT kerfi eins og lýst er í fyrri rannsókn og beinrúmmál/heildarrúmmál (BV/TV), beinslóðafjöldi (Tb.N), þykkt beinslóða (Tb.Tn) og aðskilnaður beina. (Tb.Sp) voru metnar [28]. Fyrir líknardráp voru SD rottur svæfðar eftir beinformunargreiningu með inndælingu í kviðarhol með 10 prósent klóralhýdrati (350 mg/kg).

Ensímtengd ónæmissogandi prófun (ELISA)
Viðskiptasett ELISA sett voru notuð til að greina magn osteókalsíns (OC, E-EL-R0243c, Elabscience) og C-enda telopeptíðs (CTX, E-EL-R1405c, Elabscience) í sermi rotta. Í stuttu máli voru hvarfefnin fjarlægð við 18-25 gráðu til að koma jafnvægi á og undirbúa lausnina fyrir þvott og staðlaða vinnu. Ensímplötur Plötur voru settar upp með stöðluðum, auða og sýnisholum. Um það bil 100 μL sýnisþynningarlausn var bætt við brunnana, ræktuð í 90 mínútur við 37 gráður, og skipt út fyrir bíótínýlerað mótefni í 60 mínútur við 37 gráður. Eftir þvott var ensímbindandi vinnulausninni bætt við og hún ræktuð í 30 mín. Hvarfefnislausninni (90 μL) var bætt við og ræktuð í 15 mínútur með vörn gegn ljósi. Þegar blái hallinn birtist í stöðluðu holunum var 50 μL af stöðvunarlausninni bætt við og breytingin á OD450 greind.

Rauntíma PCR (RT-qPCR) í rauntíma umritun
TRlzol LS hvarfefni var bætt við sermi rotta og ACT-meðhöndlaðar MC3T3-E1 frumur og heildar-RNA var dregið út með ræktun við stofuhita og síðan bætt við klóróformi. RNA styrkur og hreinleiki voru staðfestir með því að mæla A260/280 gleypni í Nanodrop ND-1000 litrófsmæli. SuperScript II Reverse Transcriptase Kit var notað fyrir öfuga umritun RNA í cDNA. Í kjölfarið var cDNA sett á sem sniðmát, grunni var bætt við og SYBR-Green PCR master mix Kit var blandað og bætt við ddH2O í 20 μL og PCR mögnunarviðbrögðin voru framkvæmd með Applied biosystems AMI7500 Fast Real-time PCR kerfi (ABI, CA, Bandaríkin). GAPDH var notað sem innri viðmiðun til að staðla, og hlutfallsleg tjáningarstig voru reiknuð með 2−ΔΔCt aðferð og framkvæmd í þrígangi. Grunnröð fyrir Runt-tengdan umritunarþátt 2 (Runx2), kollagen tegund I 1 (CoL1A1), viðtakavirkja kjarnaþáttar-KB bindil (RANKL), osterix og osteoprotegerin (OPG) er sýnd í töflu 1.

Western-blot greining
RIPA lýsati sem innihélt 1 prósent próteasahemli var bætt við frumurnar og heildarprótein úr hverjum hópi var safnað eftir leysingu frumanna með því að hrista í 5 mínútur við 4 gráður. BCA prófunarsett var notað til að mæla styrk próteina í hverjum hópi. Í kjölfarið var próteinsýnunum blandað saman við 10 prósent natríumdódecýlsúlfat (SDS) jafnalausn í jöfnu rúmmáli og soðin í vatnsbaði við 95 gráður í 5 mínútur fyrir próteinafvæðingu. 12 prósenta SDS-pólýakrýlamíð lóðrétt hlaup var útbúið og eftir að hlaupið storknaði var tekið sýni af 30 ug af próteini fyrir 120 mA 90 mínútna hlaup rafdrætti aðskilnað. Próteinið var síðan flutt yfir á PVDF himnuna við 90 V í 120 mín. Eftir lokun með 5 prósenta sermi albúmíni úr nautgripum var PVDF himnan skorin á grundvelli mólþunga merkisins og markpróteinbandsins og ræktuð með samsvarandi aðalmótefni yfir nótt við 4 gráður. Kanínu fjölstofna mótefni gegn p-AKT, p-mTOR og p-PI3K voru þynnt í hlutfallinu 1:1000 (Proteintech, Wuhan, Kína). TBST var þvegið í 30 mínútur og ræktað með samsvarandi piparrótarperoxíðasa-merktu aukamótefni við stofuhita í 1 klst. Bletturinn var sýndur með því að nota aukið efnaljómandi hvarfefni. Þéttleiki próteinbanda var magngreindur með mynd J. GAPDH var notað sem viðmiðun til að reikna hlutfallslegt próteinmagn.

Frumuræktun og flokkun
Músafor-beinþynningar MC3T3-E1 voru keyptir frá Chinese Tissue Culture Collections (CTCC, Kína) og ræktaðir í -MEM sem innihélt 10 prósent nautgripafóstursermi og 100 einingar/ml penicillín og 100 mg/ml streptomycin í rakt útungunarvél við 37 gráður og 5 prósent CO2. Fyrir beinaðgreiningarræktun var beinframleiðandi miðill framleiddur með því að blanda 10 mM- -glýserófosfati og 50 mg/ml af askorbínsýru (Sigma-Aldrich) við -MEM og bætt við MC3T3-E1 frumurnar til að örva aðgreining þeirra. Skipt var um miðil eftir 3 daga. Ræktanir í 14 daga voru notaðar fyrir lífvænleika alkalísks fosfatasa (ALP). Ennfremur voru frumur formeðhöndlaðar með PI3K hemlinum LY294002 (10 μM) í 30 mínútur, fylgt eftir með meðferð með Dex og ACT.

Frumulífvænleikapróf
Frumutalningarsett-8 (CCK-8) prófið var gert til að meta lífvænleika beinfrumuefna sem voru meðhöndlaðir með ACT. MC3T3-E1 frumurnar voru sáðar inn í 96 brunna plötur með 5 × 103 frumum/holu. Magn upp á 1 μM af Dex var talið byggt á fyrri rannsóknum [29] og samtímis ræktað með hallastyrk ACT (10-8, 10-7, 10-6 og 10-5 M). Ræktunarmiðlinum í 96-brunnsplötunum var skipt út eftir að blöndunarmiðli og CCK-8 hvarfefni var bætt við í 10:1 hlutfalli. Eftir áframhaldandi ræktun í 1 klst við 37 gráður var breytingin á OD450 metin.

Uppgötvun beinfrumufrumufjölda
MC3T3-E1 frumurnar sem voru gerðar í mismunandi meðferðum voru meltar með EDTA-fríu trypsíni og safnað með skilvindu. Eftir þvott með 1 × bindibuffi var 5 μL Annexin V-FITC bætt við og ræktað við stofuhita í 5 mínútur, bætt við 5 μL PI og farið í gegnum 200-möskva nylonnet. Sýnin voru greind með FACScan flæðifrumumælingarkerfi.

ALP virkniprófun
MC3T3-E1 frumurnar voru sáðar í 24-brunnsplötur og ACT og Dex var bætt við eftir gifsun. Frumræktunarmiðlinum var skipt út fyrir beinséraðgreiningarmiðil fyrir ræktun. Eftir að hafa notað leysingu frumna með frumulýsilausn (P0012J, Beyotime Biotechnology), var flotinu safnað með skilvindu og staðalferillinn teiknaður upp. ALP sett (P0132S, Beyotime líftækni) var notað til að meta ALP virkni og OD450 var reiknað út.

tölfræðigreining
Eftir að hafa framkvæmt þrjár sjálfstæðar tilraunir í þríriti voru gögnin greind með GraphPad Prism 6.0 hugbúnaði og gefin upp sem meðaltal ± staðalfrávik. ANOVA var notað til að bera saman tölfræðilegan mun milli margra hópa. P-gildi < 0.05 var talið tölfræðilega ólíkt.