Erfðabreytt líkan sýnir hlutverk Klotho í þróun briskrabbameins og ryður brautina fyrir nýja meðferð sem byggir á Klotho

Vinsamlegast smelltuoscar.xiao@wecistanche.comfyrir meiri upplýsingar

Einföld samantekt:Við stefndum að því að rannsaka hlutverk öldrunarpróteinsins klotho og seytt ísóformi þess, Bretlandi, í briskrabbameini. Þrjú in vivo líkön, þar á meðal nýtt erfðafræðilegt músamódel og lífupplýsingagreiningar, gáfu til kynna að klótó væri æxlisbælingur í kirtilkrabbameini í brisi og afhjúpuðu einstakt klótó DNA ofmetýleringarmynstur í brisæxlum. Þessar niðurstöður hafa umtalsvert forspárgildi og benda ennfremur til þess að hún gæti þjónað sem meðferðarefni fyrir kirtilkrabbamein í brisi.

Vinsamlegast smelltu hér til að vita meira

Ágrip: Klotho er prótein gegn öldrun, sem getur losnað og getur virkað sem hormón. Uppsöfnuð gögn benda til þess að klotho sé æxlisbæli í fjölmörgum illkynja sjúkdómum og tilgreina undirlénið KL1 sem virka svæði próteinsins fyrir þessa virkni. Markmið okkar var að rannsaka hlutverk klotho sem æxlisbælandi lyfs í kirtilkrabbameini í brisi (PDAC). Lífupplýsingagreiningar á gagnasöfnum The Cancer Genome Atlas (TCGA) leiddu í ljós fylgni milli lifun PDAC sjúklinga, magns klótótjáningar og DNA metýleringar, og sýndu einstakt ofmetýleringarmynstur klótó í brisæxlum. In vivo áhrif klotho og KL1 voru skoðuð með þremur múslíkönum. Með því að nota nýtt erfðafræðilegt líkan, sem sameinaði klótóhækkun briskirtils og stökkbreytingu í Kras, stuðlaði skortur á klotho að PDAC-myndun og minnkaði lifun músa. Í xenograft líkani hamlaði gjöf veiruagna sem báru himinn, splædda klótó ísóform sem inniheldur KL1 lénið, brisæxli.kaupa cistancheAð lokum, meðhöndlun með leysanlegum himni lengir lifun Pdx1-Cre; KrasG12D/ plús ; Trp53R172H/ plus (KPC) mýs, þekkt er líkan sem endurspeglar PDAC úr mönnum.lífflavonoids,Að lokum gefur þessi rannsókn vísbendingar um að klotho sé æxlisbæli í PDAC. Ennfremur benda þessi gögn til þess að magn klótó tjáningar og DNA metýleringar gæti haft forspárgildi hjá PDAC sjúklingum og að gjöf utanaðkomandi sKL gæti þjónað sem ný lækningaaðferð til að meðhöndla PDAC.

Leitarorð:klótó; KL1; sKL; æxlisbæli; krabbamein í brisi; PDAC

1. Inngangur

Krabbamein í brisi er meðal árásargjarnasta krabbameina, með 5-árs lifun er 9 prósent. Nýgengi og dánartíðni fer hækkandi, en búist er við 60.430 nýjum tilfellum og 48.220 dauðsföllum árið 2021 í Bandaríkjunum einum [1]. Briskirtilkrabbamein (PDAC) er 85-90 prósent af öllum illkynja æxlum í brisi. Núverandi líkön benda til þróunar þess frá góðkynja æxli í brisi (PanlN)1-3 til ífarandi krabbameins, ásamt öflun erfðastökkbreytinga. Virkjun Kras er talið fyrsta skrefið í átt að illkynja sjúkdómi [2] og í múslíkönum leiðir það til þróunar PanIN eftir 9 mánuði [3]. Þó augljóst PDAC í þessum músum sé sjaldgæft, í KPC líkaninu, sem sameinar Kras stökkbreytingu með tapi á æxlisbælandi p53 [4], þróast PDAC venjulega við 3-6 mánaða aldur [5].

Cistanche getur gegn öldrun

Klotho (hér notað sem klotho) er tegund I yfirhimnuprótein sem tekur þátt í stjórnun öldrunar [6]. Hjá músum leiðir klótóskortur til heilkennis sem líkist hraðari öldrun, en oftjáning klótó lengir líftíma [7,8]. Klótó utanfrumusvæðið er samsett úr tveimur einsleitum lénum, ​​KL1 og KL2, sem hægt er að kljúfa frá himnunni og verka sem hormón í blóðrásinni [9-11]. Annað klótó ísóform sem er tvískipt er seytt (Bretland). Himinninn er eins og KL1, auk 15 amínósýrur til viðbótar í C-endanum. Mismunandi virkni klotho hefur verið lýst, þar á meðal virkjun á fibroblast growth factor (FGF)23 boðefni [12,13], stjórnun á skammvinnum viðtaka hugsanlegri katjónarás undirfjölskyldu V meðlims (TRPV)5 kalsíumgöng [14,15] og hömlun á insúlín og insúlínlíkur vaxtarþáttur (IGF)-1 ferlar [8,16,17].

Klotho er aðallega tjáð í nýrum og heila, en einnig í ýmsum vefjum, þar á meðal útkirtla og innkirtla brisi [7,17-20]. Lífeðlisfræðileg virkni þess í brisi hefur enn ekki verið ákveðin; þó eru vísbendingar um þátttöku þess í stjórnun glúkósajafnvægis. Klotho örvar insúlínframleiðslu og -seytingu in vitro og in vivo, dregur úr insúlínnæmi í músum og tæmist í briseyjum sjúklinga með sykursýki af tegund 2 (T2DM) [8,19-22]. Klotho er öflugur æxlisbæli í fjölmörgum illkynja sjúkdómum, þar á meðal krabbameinum í meltingarvegi [16,17,23-30]. Það er þaggað niður í krabbameini og bæði klotho og Karl draga úr vexti krabbameinsfrumna in vitro og in vivo [16,17,23,25,26,28,31-33]. Í krabbameini í brisi er niðurstýring klothos í tengslum við lifun sjúklinga. In vitro, klotho dregur úr vexti briskrabbameinsfrumna og hindrar IGF-I og bFGF ferla [17,34].

Í þessari rannsókn var stefnt að því að ráða hlutverk klotho sem æxlisbæla í PDAC með því að nota þrjú in vivo líkön. Með því að nota nýtt erfðafræðilegt líkan sýndum við að klotho niðurbrot í brisi stuðlaði að þróun PDAC og minnkaði lifun Kras stökkbreyttra músa. Í öðru líkani sýndum við fram á að gjöf veiruagna sem báru sKL hamlaði brisæxli í xenograft líkani. Að lokum, meðhöndlun með leysanlegum raðbrigða himni lengir lifun KPC músa. Þessar niðurstöður sýna hlutverk koto sem mikilvægan þátttakanda í þróun PDAC og benda til klotho sem meðferðaraðferð til að meðhöndla PDAC sjúklinga.

2. Efni og aðferðir

2.1. TCGA greining með UCSC Xena vafra

Genatjáning RNAseg (IlluminaHiSeq) og DNA metýleringu (Methylation450k) gagnasett fyrir The Cancer Genome Atlas (TCGA) Pancreatic Cancer (PAAD) hópnum voru rannsökuð með því að nota University of California Santa Cruz (UCSC) Xena Browser (http://xena.ucscedu/, skoðaður 19. júlí 2020)[35].cistanchMeð því að nota Xena vafrann var heildarlifun og framfaralaust bil briskrabbameinssjúklinga greind í samræmi við annað hvort klotho tjáningu eða KLOTHO DNA metýleringu og Kaplan-Meier plots voru búnar til. Tvítekið einstaklingsgögn voru fjarlægð með síun eingöngu fyrir frumæxli. Genatjáningargögnum, gefin í log2(x plús 1)einingum, var skipt í tvo hópa eftir miðgildi; DNA metýleringargögnum var skipt í tvo hópa eftir neðri og efri fjórðungsmörkum.

Fyrir staðsértæka KLOTHO DNA metýleringu voru sýni með lágt eða mikið magn af klótó tjáningu, eins og skilgreint er með neðri eða efri fjórðungum, í sömu röð, greind frekar. Gildin 36] fyrir hvern metýleringarstað voru reiknuð út og fylgni við klótó tjáningu í samsvarandi sýni var skoðuð með Pearson fylgnistuðli (r).

2.2. Efni, mótefni og byggingarefni

Efni sem notuð voru í þessari rannsókn voru meðal annars leysanlegt skeytiafbrigði klotho úr mönnum, sem samanstendur af amínósýrum34-549(skíðaléni; aðgangsnúmer BAA24941.1), með 15-amínósýru einstaka röð í C-enda({ {6}}; PeproTech Inc, Rocky Hill, NJ, Bandaríkjunum); glúkósa (Floris, Misgav, Ísrael), mannainsúlín (Actrapid; Novo Nordisk A/S, Bagsværd, Danmörku), og luciferin (122799; PerkinElmer, Waltham, MA, Bandaríkjunum).

Mótefni sem notuð voru í þessari rannsókn voru meðal annars rotta IgG2a samsætustjórnun (02-9688; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) og and- -aktín (A5441; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Bandaríkjunum) . And-klotho mótefni beint gegn KL1 léninu (KM2076) voru góð gjöf frá Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd., Tókýó, Japan.

2.3.AAV vektorframleiðsla og hreinsun

AAV9 vektorar, núll tómur vektor og himinn (sem innihalda seytt klotho splice afbrigði ísóform, aðgangsnúmer BAA24941.1) voru framleiddir og hreinsaðir í líföryggisstigi 2 aðstöðu United Mixta UAB-VHIR og Vector Production Unit(VPU) í stuttu máli. , voru vektorar búnir til með því að nota þrefalda transfection kerfið í HEK293 frumum. Eftir 48 klst voru AAV ferjur safnað, meðhöndlaðir með bensónasa, hreinsaðir í jodixanól halla og títraðir með PicoGreen [37]. Tjáning transgena var knúin áfram af CMV hvata, eins og áður hefur verið lýst [37].

2.4. Dýraviðhald

Músaviðhald og tilraunir voru gerðar í Sourasky læknastöðinni (Tel Aviv, Ísrael) og í samræmi við reglur og staðla Sourasky læknastofu dýraverndar- og notkunarnefndar.

Músastofnar sem notaðir voru fyrir erfðabreytt líkön voru allir á blönduðum C57BL/6 og JVB/NJ bakgrunni. Pdx1-Cre, LSL-KrasG12D/ plus og LSL-Trp53R172H/ plus t mýs voru góðar gjafir frá Dr. Ziv Gil (Technion-Israel Institute of Technology í Rambam, Haifa, Ísrael).

2.5. Brissértæk KLOTHO Knockdowm músalíkön

Til þess að miða að niðurfellingu KLOTHO í brisi í músum voru mýs sem báru floxaðar KLOTHO samsætur (KLlox) myndaðar, eins og áður hefur verið lýst [38].cistanche ÁstralíuKeflex/flox mýs voru blandaðar með Pdx1-Cre músum, sem tjáðu Cre recombinasa sem stjórnað var af hvatamanni Pdxl, og fengu þannig Pdx1-Cre; KL-/-mýs. KLOTHO niðurbrot í brisi var staðfest með ónæmisvefjaefnafræði og mRNA gildum, eins og lýst er hér á eftir.

Til að búa til mýs sem geyma Pdxl-stýrða KLOTHO knockdown og stökkbreytta Kras tjáningu, voru LSL-KrasG12D/plús mýs [3], sem báru Lox-Stop-Lox röð á eftir stökkbreyttri Kras samsætu, blandað með KLflox/flox músum. Þessar mýs voru ræktaðar frekar með Pdx1-Cre músum, sem gaf Pdx1-Cre; KL-/-; KrasG12D/ plús mýs. LSL-KrasG12D/ plus var einnig blandað með Pdx1-Cre músum sérstaklega og þessum Pdx1-Cre; KrasG12D/plús mýs voru notaðar sem viðmið. Mýs voru skoðaðar daglega með tilliti til einkenna um þjáningar, þar á meðal erfiða öndun, miklar þyngdarbreytingar og stór æxli (meira en 1 cm) og þeim sem uppfylltu skilyrði siðanefndarinnar var fórnað. Fylgst var með músum til að lifa af, með dauði skilgreindur annaðhvort af sjálfu sér eða með einkennum sem krefjast fórnar. Vegna hraðrar meltingar brisvefs með vökva í brisi gátum við aðeins rannsakað bris músa sem hafði verið fórnað. Vefjum var safnað og haldið í formaldehýði í 24 klst, sem síðan var skipt út fyrir 70 prósent etanól.

2.6. Mýs æxli Xenograft rannsóknir

Naktar kvenkyns mýs (BALB/c bakgrunnur), {{0}} vikna gamlar, voru keyptar frá Envigo RMS (Jerúsalem, Ísrael). Músum var hýst og þeim haldið í lagskiptum flæðiskápum við sérstakar aðstæður án sjúkdómsvalda. Á fyrsta degi tilraunarinnar voru MIA PaCa-2 frumur sem tjá stöðugt m-kirsuber/lúsiferasa sáð undir húð (sc) í hliðar þeirra （n=21, 1 × 10 gráðu frumur í 100 μL af 5 prósent FCS DMEM miðill）. Tíu dögum eftir æxlisbólusetningu var stórum skammti (5× 1011 GC/ml, n=7) eða lágum skammti (5× 1010GC/ml,n=6) af manna AAV-hún sprautað í vöðva (im).AAV-null þjónaði sem stjórn (5×1010 GC/mL, n=8). Æxli voru mæld með stafrænu mælistiku þrisvar í viku og rúmmálið var reiknað með reikniformúlu sporbaugmagns (0,5×lengd × breidd2). Á 20. degi tilraunarinnar voru æxli metin in vivo með því að fylgjast með lúsiferasavirkni MIA PaCa-2 frumunnar með inndælingu 150 ug/mL lúsiferíns í kviðarhol og styrkleiki lúsiferasa var mældur með Biospase.

Sama dag lauk tilrauninni og mýsnar voru aflífaðar. Æxli voru fjarlægð, vigtuð og mæld með stafrænu mælistiku. Blóði var safnað fyrir aflífun og magn klótós úr mönnum var mælt í sermi með ELISA (IBL, Minneapolis, MN, Bandaríkjunum). Fimmtíu míkrólítrar af sermi í hverju sýni (í tvítekjum) voru notaðir fyrir ELISA og greiningin var framkvæmd samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. Fylgni milli þyngdar æxla og klotho blóðþéttni manna var könnuð með Pearson fylgnistuðli.

2.7. KPC músarlíkön

Myndun KPC músa var gerð með því að blanda LSL-Trp53R172H/ plús músum [5] sem báru Lox-Stop-Lox röð, fylgt eftir með punktstökkbreyttri p53 samsætu sem virkar sem núllstökkbreyting, með LSL-KrasG12D/ plús t músum. Þessar voru blandaðar frekar með Pdx1-Cre músum, sem leiddi til Pdx1-Cre; KrasG12D/ plús ; Trp53R172H/ plús mýs. Mýsnar voru lagðar saman eftir kyni, aldri og þyngd og þeim var úthlutað af handahófi til að fá meðferð með inndælingum í kviðarhol (ip) af leysanlegri húð manna (15 mg/kg, tvisvar í viku) eða burðarefnisstýringu (n =6 fyrir himinmeðhöndlaður hópur; n =7 fyrir viðmiðunarhópinn). Meðferð hélt áfram í allt að 30 vikur. Mýs voru skoðaðar daglega með tilliti til einkenna um þjáningar, þar á meðal erfiða öndun, miklar þyngdarbreytingar og stór æxli (meira en 1 cm) og þeim sem uppfylltu skilyrði siðanefndarinnar var fórnað. Fylgst var með músum til að lifa af, með dauði skilgreindur annaðhvort af sjálfu sér eða með einkennum sem krefjast fórnar.

2.8. Arfgerð

Músahalar voru teknir við 3 vikna aldur til arfgerðargreiningar. DNA var dregið út með því að rækta hala í basískri lýsislausn, sem samanstóð af 250 μM NaOH og 2 μM tvínatríum EDTA (pH 12.0), í 30-60 mín. við 95 gráður , fylgt eftir með hlutleysingu með 0,4 mM Tris HCL (pH 5,0). DNA fór síðan í gegnum PCR mögnun fyrir mismunandi arfgerðir með því að nota REDTaq ReadyMix PCR viðbragðsblöndu (Sigma-Aldrich, Rehovot, Ísrael). Primers voru í 1000 nM lokastyrk. PCR lotur og frumur eru útskýrðar í töflu S1. Afurðir voru rafskornar á 1,5 prósent agarósa hlaupum og litaðar með etídíumbrómíði.

2.9. Ónæmisvefjaefnafræði (IHC) greining

Vefur var festur í 4 prósent paraformaldehýði og innfelldir vefir voru raðskurðir. Hlutar voru annað hvort litaðir með hematoxýlíni og eósíni (H&E) og skoðaðir í smásjá af reyndum meinafræðingi eða litaðir með IHC, eins og lýst er. Fyrir klotho IHC voru formalínfastir og paraffín-innfelldir hlutar, 4 um þykkir, afvaxaðir í xýleni og endurvökvaðir. Mótefnavaka endurheimt var framkvæmd með því að nota heitt bað (95 gráður) í 20 mínútur í sítratbuffi pH6.0. Eftir kælingu í 30 mínútur voru skyggnurnar skolaðar í TBS-tríton (TBS-T) jafnalausn.cistanche bæturÍ kjölfarið var innræn peroxidasa blokk framkvæmd í 10 mínútur í 3 prósent H, O/metanóli. Eftir skolun í TBS-T voru hlutar lokaðir í 30 mínútur með því að nota 5 prósent BSA í TBS-T og síðar ræktaðir yfir nótt með klótó frummótefni við 4 gráður. Greining var framkvæmd með ZytoChem Plus(HRP) One-Step Polymer andstæðingur-mús/kanínu/rottu (ZUC053; Zytomed Systems, Berlín, Þýskalandi). Rotta IgG2a þjónaði sem samsætustjórnun.

2.10. Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)

Pancreata frá fórnuðu Pdxl-Cre; KL-/- og KLflox/flox viðmiðunarmýs voru skornar út, frystar í fljótandi köfnunarefni og geymdar við -80 gráðu. Eftir einsleitni brissins var heildar-RNA útbúið með því að nota RNA einangrunarbúnaðinn (Sigma), og öfugt umritað með JScript cDNA SuperMix (Quanta BioSciences, Gaithersburg, MD, Bandaríkjunum). cDNA var magnað upp fyrir klótó og -aktín (sem hleðslustýring) með því að nota REDTaq ReadyMix PCR viðbragðsblöndu (Sigma). PCR var fínstillt við 94 gráður í 5 mínútur, fylgt eftir með 30 sekúndum við 94 gráður, 90 sekúndur við 52,5 gráður og 20 s við 72 gráður (45 lotur fyrir klótó, 25 lotur fyrir -aktín) og 10 mínútur við 72 gráður. 72 gráður fyrir framlengingu, með því að nota 12,5 pmol klotho primers (F,5-ACGTTCAAGTGGACACTCT-3'og R,5'-TTCTTIGGCTACAACCCCGTC-3') og 5 pmol -actin primers (F,5') -TGTTACCAACTGGGACGACA-3'og R,5'-GGGGTGTTGA AGGTCTCAAA-3). Afurðir voru rafskornar á 1,5 prósent agarósa gelum litaðar með etídíumbrómíði. Magngreining var gerð með ImageJ hugbúnaði, National Institute of Health, Bethesda, MD, Bandaríkjunum.

2.11.Tölfræðigreining

Niðurstöður eru settar fram sem meðaltal ± SD eða SEM, eins og getið er. Samfelldar breytur voru bornar saman með t-prófi nema annað sé tekið fram. Öll marktektarpróf voru tvíhliða og p-gildi Minna en eða jafnt og 0.05 var talið tölfræðilega marktækt. Fylgnin var metin með Pearson's fylgnistuðli (r). Lifunargreining var gerð með því að nota log-rank prófið.

3. Úrslit

3.1.Stig Klotho tjáningar og DNA metýleringar í brisæxlum eru í samræmi við lifun krabbameinssjúklinga

The Cancer Genome Browser (TCGA) Briskrabbamein (PAAD) hópur var skoðaður með því að nota University of California Santa Cruz (UCSC) Xena Browser[35]. Genatjáningargreiningar leiddu í ljós minnkaða heildarlifun (OS) og framvindufrítt bil (PFI) fyrir briskrabbameinssjúklinga með lágt klótó-tjáandi æxli, samanborið við hátt (n=89 fyrir hvern hóp; mynd 1A, B). Athugun á metýleringargögnum sýndi samhæfða tilhneigingu til hamlaðrar OS og PFI hjá sjúklingum sem voru með æxli með hátt KLOTHO DNA metýleringargildi, samanborið við lágt (n=45 og n=46, í sömu röð; mynd 2A, B) .

Further analyses of gene expression and methylation data (Table S2) revealed three specific sites, evaluated by probes cg23282559, cg02441765, and cg25650964, which were hypermethylated(IDelta βI>0.15)and negatively correlated to klotho expression(Irl>0.3) í briskrabbameini í mönnum (Mynd 2C-E).

3.2. Kynslóð briskirtils KLOTHO knockdown músa

Óskilyrtar KLOTHO útsláttarmýs deyja um 8-9 vikna aldur [7], þess vegna geta þær ekki þjónað sem fyrirmyndir fyrir þróun krabbameins. Þess vegna stefndum við að því að miða KLOTHO niðurbrot á brisi í músum. Í þessu markmiði voru Pdx1-Cre mýs ræktaðar með músum sem báru floxaðar KLOTHO samsætur, KLlox/lox [38], og fengu þannig Pdx1-Cre; KL-/- mýs (Mynd 3A, B). RNA- og próteinmagn staðfestu niðurbrot klótó í brisi (Mynd 3C-E). Pdx1-Cre; KL-77mýs sýndu lítilsháttar þyngdaraukningu með tímanum, samanborið við samanburðarhópinn (Mynd 3F), en enginn munur á glúkósa í sermi eða insúlíni og glúkósaþoli (Mynd S1).

Mynd 3. Myndun af KLOTHO knockdown músum í brisi. (A) Skýringarmynd af KLflox samsætu: LoxP staðir hliðar exon 2 af KLOTHO, sem leiðir til markvissrar niðurbrots þess í brisi á Pdx1-Cre; KL-/-mýs. Efsta spjaldið sýnir floxed allele, neðra spjaldið sýnir væntanlegar niðurstöður Cre endurröðunar. (B) Fulltrúi hlaup sem sýnir PCR afurðir úr KLOTHO arfgerð músa: KL plús/plús (WT;370 bp), KLl/plús (470 og 370 bp) og KLflox/flox (470 bp). (C,D) RNA í brisi var dregið úr Pdx1-Cre; KL-/-(n=7) og stjórnamýs(n=4). Magn Klotho mRNA var ákvarðað með hálf-megindlegum RT-PCR og magngreind. Dæmandi hlaupið er sýnt (upprunaleg óklippt blett er fáanleg á mynd S2). (E) Fullkomin ónæmisvefjaefnafræðileg klótó-litun á brisi sem er skorið úr Pdx1-Cre; KL-/- og viðmiðunarmýs. Stækkun: X20. V/O, án. (F) Þyngd músa í báðum hópum (n=5á hvern hóp). Greint með endurteknum aðgerðum ANOVA.p=0.01. Gögn eru sett fram sem meðaltal ± SEM. Control, KLflox/flox mýs. Mýs sem geymdu KLOTHO niðurbrot í brisi og stökkbreytt Kras tjáningu voru búnar til með því að rækta Pdx1-Cre með LSL-KrasG12D/ plús [3] músum (Pdx1-Cre; KrasG12D/ plús músum) og rækta þær frekar með KLflox/lox mýs (Pdx1-Cre; KL-/-; KrasG12D/ plús mýs). Greiningar voru gerðar með karlkyns músum. Kvenkyns mýs voru útilokaðar, vegna mikils tíðni endaþarmsskemmda í bæði Pdx1-Cre; KrasG12D/ plus og Pdx1-Cre; KL-/-; KrasG12D/ plús músum, sem er í samræmi við fyrri skýrslur um papillomas í slímhúð í slíkum músum [3].

3.3. Tap á brisi Klotho stuðlar að minni lifun í músum

Það var enginn munur á lifun Pdx1-Cre; KL-/- mýs, samanborið við viðmiðið). Við héldum áfram að rannsaka áhrif samsettrar KLOTHO-knúningar í brisi og Kras-stökkbreytingar á lifun með því að fylgjast með músunum í 65 vikur. Dauðinn átti sér stað annaðhvort af sjálfu sér eða með líknardrápi þegar merki um alvarlegar þjáningar, eða æxlisbyrði sem kröfðust fórna, hófust. Lifun Pdx1-Cre; KL-/-;KrasG12D/ plús músum (n =21) ​​minnkaði, samanborið við viðmiðunarpdx1-Cre; KrasG12D/ plús mýs (n=18;p= 0.02; mynd 4A). Þannig, við 22 vikna aldur, 100 prósent (18/18) af Pdx1-Cre; KrasGi2D/ plús mýs voru á lífi, samanborið við 71 prósent (15/21) af Pdx1-Cre; KL-/-; KrasG12D/ plús mýs. Engar marktækar breytingar á þyngd komu fram á milli hópanna (Mynd 4B).

Mynd 4. KLOTHO niðurbrot í brisi stuðlar að minni lifun og framkallar PDAC in vivo. (A) Kaplan-Meier ferlar af Pdx1-Cre; KL-/-;KrasGi2D/ plús (n=21) samanborið við stjórn Pdx1-Cre;KrasGi2D/ plús (n=18)mýs.p=0.02.( B) Þyngd músa í báðum hópum(n=19 á hóp). (CE) Bris voru skorin úr Pdx1-Cre; KL-/-; KrasG12D/ plús (n=7, meðalaldur 36 vikur)og stjórn Pdx1-Cre; KrasGi2D/ plus (n=8, meðalaldur 49 vikur) músum við fórn. (C) Samanburður á milli meinafræðilegs mats á H&E lituðu brisi beggja hópa. (D) Fulltrúi H&E litun á brisi sem var safnað úr 24-vikukömlum músum.Pdx1-Cre; KL-/-; KrasG12D/ plús (hægri): algjört tap á frumuskautun, veruleg kjarnaatýpía og frumuþyrpingar í holrýminu ásamt mikilli bandvefsmyndun og keratíni. Stjórna Pdx1-Cre; KrasG12D/ plús (til vinstri): engar skemmdir. Stækkun: ×10.(E) Fulltrúar PanIN sár beggja hópa. Stækkun: ×10.

3.4. Klotho vinnur saman að þróun PDAC In Vioo

Byggt á fyrri rannsóknum sem sýndu þróun PDAC í músum sem hafa bæði Kras stökkbreytingu og tap á æxlisbælandi virkni [4], skoðuðum við Pdx1-Cre; KL-/-; KrasG12D/ plús brisi í músum fyrir sár. Vegna hröðrar meltingar brisvefs með vökva í brisi gátum við aðeins notað bris músa sem hafði verið fórnað. Sýnishorn af Pdx1-Cre; KL-7-; KrasGi2D/ plús (n =7) ​​og stjórna Pdx1-Cre; KrasGi2D/ plus (n =8) mýs gengust undir meinafræðilegt mat (meðalaldur dauða: 36 vikur og 49 vikur, í sömu röð). PDAC var auðkennt í tveimur Pdx1-Cre; KL-/-; KrasG12D/ plús músum, en í engum Pdx1-Cre; KrasG12D/ plús músum, en PanN2 kom fram í tveimur af Pdx1-Cre; KL-/-; KrasG12D/ plús músum og í fjórum af Pdx1-Cre; KrasG12D/ plús mýs (Mynd 4C). Sýndar myndir eru sýndar (Mynd 4D-E).

3.5. Meðferð með sKL hamlar brisæxli og lengir lifun in vivo

The potential of SQL treatment as a therapeutic strategy for PDAC was studied using two mouse models, a xenograft model treated with a viral skin vector, and the transgenic KPCmodel treated with soluble, recombinant sKL. For the xenograft model, m-Cherry/luciferase-labeled MIA PaCa-2 cells were s.c.inoculated into nude mice. Ten days later, mice were injected with adeno-associated viruses(AAV)encoding sKL(AAV-L) at two doses. Tumor load in mice inoculated with AAV skin was significantly lower compared to the control, reflected by smaller size, weight, and luciferase signals (Figure 5A-E). Importantly, tumor weights negatively correlated with human klotho blood levels in mice (Ir| >0.729; mynd 5F-G).

Annað líkanið sem notað var í þessu markmiði var KPC líkanið. Mýsnar voru samræmdar eftir kyni, aldri og þyngd og meðhöndlaðar með sprautum af leysanlegu sKL úr mönnum eða burðarefnisstýringu í allt að 30 vikur. Dauðinn átti sér stað annaðhvort af sjálfu sér eða með líknardrápi þegar merki um alvarlegar þjáningar, eða æxlisbyrði sem kröfðust fórna, hófust. Lifun músa sem voru meðhöndluð með sKL jókst, samanborið við samanburðarhópinn (p=0.005; mynd 5H).

Mynd 5. sKL meðferð dregur úr staðbundnum æxlisvexti og lengir lifun in vivo.(AG)Athymic naktar BALB/c mýs voru skálaðar með MIA PaCa-2 frumum sem tjá stöðugt m-kirsuber/lúsiferasa (1× 10 gráðu frumur pr. mús). Tíu dögum síðar var músum sprautað með stórum skammti af AAV-sKL(5×1011 GC/mL,n=7), litlum skammti af AAV-sKL (5×1010 GC/mL, n{{13} }), eða stjórna AAV-null(5×1010 GC/mL,n= 8).(A) Æxlisrúmmál var mælt in vivo með stafrænu mælistiku. (B) Fulltrúar myndir af líffræðilegri myndgreiningu á lúsiferasavirkni staðbundinna æxla. (C) Lúsiferasavirkni æxla var mæld með fjölda á mínútu. (D) Fulltrúarmyndir af æxlum sem voru safnað á fórnardegi. (E) Þyngd uppskerðra æxla. (F) Magn klótó í blóði manna. *bls<0.05, was="" calculated="" using="" the="" kruskal-wallis="" test.="" (g)="" correlation="" between="" tumor="" weights="" and="" human="" klotho="" blood=""><0.05.r, pearson's="" correlation="" coefficient.="" (h)kpc="" mice="" were="" matched="" according="" to="" sex,="" age,="" and="" weight,="" and="" randomly="" assigned="" to="" receive="" treatment="" with="" i.p.injections="" of="" soluble="" human="" skin="" (15="" mg/kg,="" twice="" weekly)or="" vehicle="" control(n="6" for="" the="" sky-treated="" group;n="7" for="" the="" control="" group)for="" up="" to="" 30="" weeks.="" kaplan-meier="" curves="" of="" skin-treated="" and="" control="" mice="" are="" presented.p=""><0.05;*><0.005;*** p=""><0.0005 compared="" to="" control.="" error="" bars,="" mean="" ±="">

4. Umræður

Þessi rannsókn staðfestir hlutverk klotho sem æxlisbæla í PDAC. Lífupplýsingagreiningar leiddu í ljós fylgni milli lifun PDAC-sjúklinga og magns klótótjáningar og DNA metýleringar og sýndu einstakt ofmetýleringarmynstur KLOTHO í brisæxlum. Með því að nota nýtt músamódel sýndum við að klótó-knúningar í brisi starfar með Kras stökkbreytingu til að draga úr lifun og mynda PDACin Vivo. Ennfremur hindraði L vöxt æxla sem koma frá brisfrumum í xenograft líkani og lengdi lifun KPC músa.

Klotho er þaggað niður í gegnum erfðafræðilega þaggað með ofmetýleringu hvata í fjölmörgum illkynja sjúkdómum [16,23,25,26,28-31,33,39,40]. Þetta hefur einnig verið greint frá í litlum árgöngum í PDAC, sem og í fylgni milli lifun PDAC-sjúklinga og magns klotho tjáningar og DNA metýleringar [17,34]. Í samræmi við það sýndi mat okkar á OS, sem og PFI með því að nota gögn sem samanstanda af 178 PDAC sýnum, jákvæð tengsl við klótó tjáningu og samsvarandi neikvæð tengsl við KLOTHO DNA metýleringu. Þessar upplýsingar benda ennfremur til þess að klotó tjáningu gæti verið stjórnað með DNA metýleringu og styrkja þá hugmynd að þessar breytur gætu þjónað til að meta horfur PDAC sjúklinga.

Fyrri rannsóknir á KLOTHO DNA metýleringu í PDAC [17,34] voru byggðar á takmörkuðum undirhópi sjúklinga og in vitro tilraunum og greindu ekki metýlunarmynstur tiltekinna staða innan alls KLOTHO gensins. Núverandi greining, byggð á fyrrnefndu umfangsmiklu gagnasafni, leiddi í ljós að þrír sérstakir staðir, þar af tveir eru staðsettir innan CpGisland í síðasta exon KLOTHO, virka sem neikvæðir eftirlitsaðilar klótótjáningar með ofmetýleringu. Við komumst áður að því að einn af þessum stöðum, cg23282559, er einnig ofmetýleraður í ristilkrabbameini [25]. Enn á eftir að ákvarða hvort þessar síður gegni hlutverki í klotho-reglugerð í öðrum illkynja sjúkdómum.

Vitað er að Klotho kemur fram í brisi; Hins vegar er hlutverk þess í eðlilegum brisþroska og starfsemi enn óþekkt. Þó að mýs með klótóskorti sýna minnkaða insúlínframleiðslu, ásamt stórkostlegri aukningu á insúlínnæmi [22], leiðir oftjáning klótó í músum til aukinnar fastandi insúlíns í blóði, ásamt insúlínviðnámi [8]. Það kemur á óvart að músalíkanið sem kynnt var í þessari rannsókn, sem hýsir klótóhækkun á brisi, sýndi ekki augljósa svipgerð sykursýki eða breytt næmi fyrir insúlíni. Ennfremur voru engin áhrif á formgerð briskirtils, æxlismyndun eða lifun. Þessar niðurstöður benda til þess að tap á brisi klotho gæti verið bætt upp með útlægum áhrifum af systemic klotho eða með öðrum aðferðum. Þar að auki er þróun sykursýki flókið ferli sem veltur ekki aðeins á brisi, heldur einnig á lifur, vöðvum og fituvef. Eins og í líkaninu okkar var klotho aðallega í brisi, það gæti útskýrt skort á sykursýki í þessu múslíkani.

Í samræmi við klínískar niðurstöður kynntar, Pdx1-Cre; KL-/-; KrasG12D/ plus mýs höfðu stytt líftíma samanborið við viðmiðunarpdx1-Cre; KrasGi2D/ plús mýs (48 á móti 60 vikum, í sömu röð). Þrátt fyrir að við gátum ekki skoðað alla briskirtil músanna með sjúklegum hætti, sást hærra hlutfall augljósrar PDAC í Pdx1-Cre; KL-7-; KrasG12D/ plús mýs, samanborið við viðmiðunarpdx1-Cre; KrasG2D/ plús mýs. Þessar niðurstöður sýna fram á mikilvægi klotho í þróun illkynja sjúkdóma í brisi og lifun in vivo. Svipgerð Pdx1-Cre; KL-/-:KrasGl2D/ plús mýs eru minna áberandi, samanborið við líkön sem sameina tap á öðrum æxlisbælingum með Kras stökkbreytingum. Sem dæmi hafa KPC mýs miðgildi lifunar aðeins 5 mánuðir[5]. Hugsanlegt er að þetta sé vegna bóta að hluta vegna taps á staðbundnum klótó með því að dreifa klotho. Að öðrum kosti gæti afgangstjáning klotho í brisi hafa haft áhrif á svipgerðina. Með því að ná algjörri markvissri þöggun á klótó í framtíðarrannsóknum myndi það gera betur vanmetið hlutverk þess í mismunandi vefjum, sem og mótvægi milli staðbundinna og almennra áhrifa klótó.

Við kynntum tvö líkön sem sýna fram á meðferðarmöguleika klotho. Í xenograft músarlíkani voru briskrabbameinssprautur með veiruhúðferju mjög áhrifaríkar, ekki aðeins til að hindra æxlisvöxt heldur einnig til að minnka stærð æxla. Meðferð hófst þegar æxli voru þegar sýnileg og stofnuð, sem líktist þeim tíma þegar meðferð hófst hjá flestum sjúklingum. Niðurstöðurnar benda til þess að hægt sé að nota hana til genameðferðar og komast þannig framhjá helstu hindrunum fyrir stöðugleika og skilvirkri afhendingu próteina- og peptíðbundinna lyfja. Þar að auki kom fram neikvæð fylgni á milli æxlisþyngdar og klotho blóðþéttni manna. Frekari rannsóknir á blóðþéttni klotho með tilliti til áhrifa þess geta hjálpað til við að spá fyrir um hver myndi hagnast á meðferð með klotho eða SQL, sem og við að halda magni innan meðferðargluggans.

Þróun meðferðarúrræða sem byggir á klótó er markmið sem margir rannsóknarhópar leitast við, auk lyfjafyrirtækja. Með tilliti til krabbameinsmeðferðar eru nokkrar leiðir sem eru skoðaðar. Hægt er að auka innrænt magn klotho með því að nýta sér epigenetic kerfi sem sýnt er að hafa áhrif á klotho tjáningu. Greint hefur verið frá því að klótóforritið sé mjög metýlerað í mörgum krabbameinum og er einnig aldursfall. Þannig gætu efnasambönd sem hindra DNA metýltransferasa orðið lækningalegt markmið til að auka klótó tjáningu. Á hinn bóginn er hægt að auka magnið með því að bæta klótó við utanaðkomandi, til dæmis með því að nota genameðferð eða afhendingu raðbrigða klótó próteins. Hér greindum við frá kynningu á virka svæði klotho (L) með því að nota AAVexpression kerfið, sem leiddi til meðferðaráhrifa í líkani af krabbameini í brisi.

Næst sýndum við fram á að meðferð með leysanlegum himni lengiði lifun KPC músa, líkan sem vitað er að endurspeglar PDAC úr mönnum. Þetta sýndi áhrif himinsins í ónæmishæfum hýsil og innfæddu æxlisumhverfi, sem styður enn frekar hugsanlega notkun SSL í klínískum aðstæðum.

5. Ályktanir

Að lokum benti þessi rannsókn á klotho sem öflugan æxlisbæling í PDAC. Núverandi meðferðaráætlun fyrir PDAC er ekki nægjanleg og gjöf utanaðkomandi sKL getur þjónað sem ný aðferð til að meðhöndla PDAC.

Þessi grein er dregin út úr Cancers 2021, 13, 6297. https://doi.org/10.3390/cancers13246297 https://www.mdpi.com/journal/cancers