Nýtt netrín-1-afleitt peptíð eykur vernd gegn taugadauða og dregur úr heilablæðingum í músum 2. hluti

Ennfremur komumst við að því að peptíð E1 virkjaði sérstaklega FAK og SFK boðleiðina. Þess vegna getur peptíð E1 haft mjög sértæk áhrif og verið áhrifarík í bataferlinu eftir ICH.

Það er samband á milli mikillar sértækni og minnis. Mikil sérhæfni vísar til sterkari virkni á tilteknum svæðum heilans þegar fólk er að framkvæma verkefni. Minni vísar til getu fólks til að læra og muna upplýsingar. Þegar við lærum að nota mikla sérstöðu til að framkvæma verkefni mun minni okkar einnig aukast.

Rannsóknir sýna að þegar við höfum sérhæfða færni og reynslu í verkefni mun heilinn smám saman byggja upp sérhæfðar taugarásir og minnismynstur. Þessar hringrásir og mynstur munu hafa ákveðin áhrif á viðbrögð við verkefninu og bæta þar með skilvirkni verkefnisins. Á sama tíma, þegar svipuð verkefni eru framkvæmt í framtíðinni, verða þessi hringrás og mynstur einnig virkjuð til að hjálpa okkur að muna betur og framkvæma verkefnið.

Verkefni með mikla sérstöðu eru tónlist, tungumál, íþróttir o.s.frv., og að læra þessa færni getur aukið minni okkar. Til dæmis, þegar píanóleikari æfir sig, mun heilinn læra sérstaka færni píanósins og halda áfram að styrkja þessar hringrásir meðan á æfingaferlinu stendur. Stofnun og styrking þessara hringrása mun einnig bæta skilning og minni píanóleikarans á tónlistinni.

Þess vegna er jákvætt samband á milli mikillar sértækni og minnis. Að læra ákveðna færni og reynslu getur ekki aðeins bætt framkvæmd skilvirkni okkar heldur einnig styrkt minni okkar, hjálpað okkur að læra og muna ýmsar upplýsingar betur. Það má sjá að við þurfum að bæta minnið og Cistanche getur bætt minnið verulega vegna þess að það hefur andoxunar-, bólgueyðandi og öldrunaráhrif, sem getur hjálpað til við að draga úr oxun og bólguviðbrögðum í heilanum og vernda þannig heilsu heilans. taugakerfi. Að auki getur Cistanche einnig stuðlað að vexti og viðgerð taugafrumna og þar með aukið tengsl og virkni tauganeta. Þessi áhrif geta hjálpað til við að bæta minni, námsgetu og hugsunarhraða og geta einnig komið í veg fyrir vitsmunalegan truflun og taugahrörnunarsjúkdóma.

Smelltu á vita bætiefni til að auka minni

Ólíkt peptíð E1 getur peptíð E2 virkjað ERK boð, sem stuðlar að taugadauða. Þetta getur stafað af Cx(1–2)Cx(3–4)Tx(0 –1)G mótífíni E2 sem getur virkjað ERK merkjaleiðina [28].

Þetta gefur til kynna að mismunandi Netrin-1-afleidd peptíð gegni mismunandi hlutverkum. Helstu viðtakar Netrin-1 eru DCC og meðlimir UNC5 fjölskyldunnar [50]. Hlutverk DCC og UNC5H2 í ICH er enn umdeilt [51,52].

Röð Netrin-1sem við greindum er mikilvæg fyrir samskipti Netrin-1 við DCC [19]. Þessar niðurstöður benda til þess að DCC gæti tekið þátt í Netrin-1-framkallaðri starfrænni bata eftir ICH.

Frekari rannsókna er þörf til að rannsaka undirliggjandi kerfi þessara ferla og tengdar boðleiðir. Í framtíðartilraunum munum við meta líffræðilega eiginleika peptíðs E1 til að kanna eituráhrif þess og helmingunartíma fyrir klíníska notkun.

4. Efni og aðferðir

4.1. Dýr

Rannsóknarstofan var sértæk rannsóknarstofa án sjúkdómsvalda (SPF). Allar mýsnar voru hýstar undir 12-klst ljós-myrkri hringrás með ljósum kveikt frá 6:00 til 18:00 og veittu aðgang að mat að vild. DCC +/- mýs voru búnar til eins og áður hefur verið lýst [53].

Fósturvísar DCC+/− músa voru notaðir til taugaræktunar í heilaberki. Arfgerð var framkvæmd með pólýmerasa keðjuverkun (PCR) eins og áður hefur verið lýst [53]. C57BL/6J mýs voru keyptar frá Beijing Huafukang Bioscience Co., Ltd. (Beijing, Kína).

4.2. Byggir

Tjáningarsmíði sem kóðar DCC úr mönnum (HGNC: 2701), Netrín-1 úr mönnum (HGNC:8029) og UNC5A úr mönnum (HGNC:12567) voru mynduð á rannsóknarstofu okkar [14,32,45].

pcDNA 3.1-hNetrín-1 (∆407–443)-myc-His var búið til með óaðfinnanlegu AssemblyCloning Kit (Clone Smarter, C5891, Bandaríkjunum). cDNA röð hNetríns-1 (∆407–443) sást í viðbótartöflu S2.

cDNA raðir sem samsvara FN5 léni DCC og amínósýrur 407–443 af Netrin-1 voru smíðaðar með bindingu inn í pGEX-5x-1 vektorinn til að framleiða GST samrunaprótein.

4.3. Safn Netrin-1 skilyrt miðlungs

Netrín-1-skilyrða miðlinum var safnað og staðfest eins og lýst er í fyrri skýrslu okkar [13,14]. Í stuttu máli, Myc-His-merkt mannlegt Netrín-1 var tjáð í HEK293Tfrumum.

Eftir 24 klst voru frumurnar þvegnar þrisvar sinnum með Opti-MEM (Invitrogen, 31985070, Carlsbad, CA, USA) og síðan ræktaðar í þrjá daga í sermifríu Opti-MEM.

Miðillinn var auðgaður með miðflótta síun (Millipore, UFC903096, Billerica, MA, Bandaríkjunum) og geymd við -80 ◦C. Auðgað netrín-1 var ónæmisblett með and-His og magnmælt með samanburði við BSA sem hleðslustýringu.

Áhrif Netrin{{0}} voru síðan metin með fosfórun FAK. Venjulega olli 0,1 mg/ml af Netrin-1 á áhrifaríkan hátt FAK fosfórun og þessi styrkur var notaður í rannsóknum okkar. Lengd Netrin-1örvunar var 20 mínútur í öllum tilraunum nema annað sé tekið fram.

4.4. Western Blot greining

Western blotting var framkvæmd eins og áður hefur verið lýst [54]. Sýnin voru greind í lýsisbuffi (1% Nonidet P-40, 0,5% natríumdeoxýkólat, 0,1% SDS, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 150 mM NaCl, 10% glýseról, 1% Triton X-100, 100 mM NaF, 1 mM vanadat og próteasahemlar) til að greina frumur og ferskan heilavef.

Aðal mótefnin sem notuð voru voru: músa and-DCC (1:500, #554223, BD, San Jose, CA, USA), músa and-His(1:1000, TA-02, ZSGB-BIO, Peking, Kína ), mús gegn myc (1:1000, 22E8, Sungene Biotech, Tianjin, Kína), mús gegn Netrín-1 (1:1000, ALX804838, Enzo Life Sciences, Farmingdale, New York, Bandaríkjunum), mús andfáni (1:1000, F3165, Sigma Aldrich, St Louis, MO, USA),kanína and-fosfó-FAK(pTyr861) (1:1000, F9176, Sigma Aldrich, St Louis, MO, Bandaríkin), kanína gegn-FAK (1:200, sc-557, Santa Cruz, Santa Cruz, CA, Bandaríkjunum), kanína gegn fosfóSRC (Tyr418) (1:1000, Invitrogen, Carlsbad, CA, Bandaríkjunum) , kanína gegn SRC fjölskyldu (1:1000,#2123, CST, Danvers, MA, Bandaríkjunum), mús gegn GAPDH (1:5000, TransGene Biotech, Peking, Kína), mús and-beta aktín (1:3000, A5441, Sigma Aldrich, St Louis, MO, Bandaríkjunum), kanína gegn fosfó-ERK(Thr202/Tyr204) (1:1000, #9101, CST, Danvers, MA, Bandaríkjunum), kanínu-ERK (1:1000, # 4695, CST, Danvers, MA, Bandaríkjunum), HRP-tengd aukamótefni gegn músum, geitum eða kanínum voru keyptar frá Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA, Bandaríkjunum).

4.5. Klefi Yfirborð Binding

HEK293 frumur, sem eru húðaðar á hyljara, voru umbreyttar með Flag-DCC plasmíðum með því að nota kalsíumfosfataðferðina eins og áður var lýst [55]. Um það bil 40 klst. eftir flutning voru frumurnar ræktaðar með 100 µg/mL myc-Netrin-1 eða myc-Netrín-1 (∆407–443) í 30 mín áður en það var þvegið í 5 mínútur með HBHA (20 mM HEPES, pH 7,0 og 0,5 mg/mLBSA í HBSS), skolað með 1× PBS og fest í röð með 4% paraformaldehýði í PBS í 10 mínútur. Aðalmótefnin sem notuð voru voru kanínu-anti-myc (1:200, Abcam,ab9106, Cambridge, MA, USA) og músa-fánamótefni (1:100, Sigma Aldrich, F3165).

Auka mótefnin sem voru notuð voru Alexa Fluor 488-conjugated donkeyanti-rabbit (1:1000; Invitrogen, A21206) og Alexa Fluor 546-conjugated goat anti-mouse(1:1000; Invitrogen, A10036) mótefni . Kjarnar voru litaðir með 40,6-díamínó-2-fenýlindóli (DAPI) (Thermo Fisher, Waltham, MA, Bandaríkjunum). Allar myndirnar voru teknar með Zeiss LSM 880 confocal smásjá.

4.6. GST Niðurdráttur

GST-DCC samrunapróteinið var hreinsað með glútaþíon-SepharoseTM 4B perlum (GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, Bretlandi) samkvæmt samskiptareglum framleiðanda.

Um það bil 500 µg af frumulýsi úr HEK293T frumum sem voru sýktar með tilgreindum plasmíðum voru ræktuð með 2–5 µg af GST-DCC-FN5 samrunaprótíni inRIPA jafnalausn við 4 ◦C yfir nótt. Glutathi-one-SepharoseTM 4B perlur voru notaðar til að fanga GST-DCC-FN5 samrunapróteinið og víxlverkandi prótein þess. Bundnu próteinunum var sleppt út í próteinhleðslubuffið með hitaeðlun.

4.7. Aðal Barkur Taugafruma Menning

Aðal taugafrumur í heilaberki voru ræktaðar eins og áður hefur verið lýst [56]. Í stuttu máli voru fósturvísar (E17) fjarlægðir úr svæfðum þunguðum músum. Heilaberkin voru aðskilin og skorin í litla bita.

Eftir ræktun í {{0}}.125% Trypsin Plus með 0,05% DNase í HBSS við 37 ◦C í 20 mínútur, voru frumurnar malaðar með eldslípuðum Pasteur pípettum úr gleri og síaðar með 40 µm síu.

Aðskildar frumur voru stöðvaðar í DMEM með 10% FBS og húðaðar á pólý-D-lýsínhúðuðum diskum eða glerlokum við 37 ◦C í 5% CO2 andrúmslofti. Eftir 4 klst var skipt út fyrir miðilinn fyrir taugagrunnmiðil sem bætt var við B27 og GlutaMAX.

4.8. NLT frumuræktun og meðferðarreglur

Mús GnRH-tjáandi taugafrumum (NLT) var viðhaldið af rannsóknarstofu okkar. NLT frumur voru ræktaðar í DMEM (Sigma Aldrich, St Louis, MO, Bandaríkjunum) sem innihélt 10% FBS (BiologicalIndustries, Kibbutz Beit Haemek, Ísrael) og 1% penicillín/streptomycin (Thermo FisherScientific, Waltham, MA, USA) við 37 ◦C undir rakt andrúmsloft 95% lofts og 5% CO2.

Til að ákvarða taugaeiturhrif hemíns var ýmsum styrkjum (0, 10, 30, 60, 90 og 120 µM) af hemíni (Sigma-Aldrich) bætt við NLT frumur og meðhöndlaðar í 6 klst. Af þessum styrk var 60 µM (LD50) valinn og notaður í síðari tilraunum.

Viðmiðunarhópar voru eingöngu meðhöndlaðir með burðarefni (DMSO). Frumulífvænleiki og lifandi/dauðalitun voru framkvæmd 6 klst. eftir meðferð. Þrír holur voru notaðir fyrir hvern hóp. Tilraunir voru endurteknar að minnsta kosti 3 sinnum.

4.9. In Vitro líkan af frumudauða af völdum hemíns

Frumudauði var framkallaður í frum taugafrumum í heilaberki og NLT frumum með meðferð með 50µM og 60 µM hemíni, í sömu röð, eins og áður hefur verið lýst [57,58]. Hemin var leyst upp í 0,1 M NaOH til að mynda stofnlausn. Fyrir taugavarnarannsóknirnar voru frumur meðhöndlaðar með hemíni í 6 klst. í viðurvist tilnefndra efna eða natríumselenít uppleysts, tvíeimuðu vatni.

4.10. CCK-8 prófun

Lífvænleiki frumna var mældur með CCK-8 greiningu (CK04, Dojindo, Kumamoto, Japan) eins og áður hefur verið lýst [59]. Í stuttu máli var Neuronal sáð í 96-brunnsplötur með þéttleika upp á 6000 frumur/brunn í 100 µL ræktunarmiðli og gefið í hitakassa yfir nótt.

Frumur voru meðhöndlaðar með Hemin í 6 klst. Taugafrumurnar voru þvegnar í forhituðu PBS (37 ◦C) og CCK-8 hvarfefni (10 µL á 100 µL miðli) í hverri brunn.

Eftir það ræktuðum við plöturnar í 2 klst í 5% CO2 andrúmslofti og gleypni við 450 nm var mæld með því að nota amíkróplatalesara. Frumulífvænleiki var táknaður sem prósenta af viðmiðunarhópnum (ómeðhöndlaðar frumur).

4.11. Lifandi/dauð litun

Hæfni CCK-8 prófunar til að mæla lífvænleika var sannreynd með litun með calceinAM/PI í PBS (Live/Dead Assay, KeyGEN BioTECH, Nanjing, Kína) samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda.

Litunarlausnin samanstóð af 2 µM kalsín AM hvarfefni og 8 µM PI hvarfefni blandað í PBS. Sýni voru ræktuð í 30 mínútur og mynduð með 20xobjective linsu af flúrljómunarsmásjá (Olympus FSX100, Tokyo, Japan). A.m.k. 3 sjálfstæðar frumuræktanir voru notaðar fyrir in vitro líkanið af frumudauða af völdum hemíns.

4.12. Peptíðmyndun og gjöf

Pep Ctrl (NH2-TPCCGKTDVGI-CONH2), Pep E1 (NH2- HPVGAAGKTCNQTTGQ-CONH2), Pep E2 (NH2- CPCKDGVTGIT-CONH2), Tat (NH{{11} }YGRKKRRQRRR-CONH2),TE1 (NH2- YGRK-KRRQRRR-HPVGAAGKTCNQTTGQ-CONH2), FITC merkt TE1 (NH2-YGRK-KRRQRRR-HPVGAAGKTCNQTTGQ-CONH2),{{FITC merkt (PFT3) 27}}HPVGAAGKTCNQTTGQCPCKDGVTGITCNRCAKGYQQ-CONH2), Fáni merktur Pep Ctrl(NH2-DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK-GGGGS-TPCRCGKTYDVGI-CONH2), Fáni merktur Pep E1HDKGDDDY{NHDDKDDY{NHKKDGGDDY} HPVGAAGKTCNQTTGQ-CONH2) og fánamerkt Pep E2 (NH2- DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK-GGGGGSCPCKDGVTGIT-CONH2) peptíð með 99% hreinleika voru keypt af Shanghai GL Biochem (Shanghai, Kína) fyrirtæki og Wuhan Bioyeargene Biosciences (Wuhan, Kína).

For more information:1950477648nn@gmail.com