Skáldsaga, ataxísk múslíkan af Ataxia Telangiectasia af völdum klínískt viðeigandi bull stökkbreytinga (Hluti 2)

Til að fá frekari upplýsingar vinsamlegast hafðu sambanddavid.wan@wecistanche.com

3.0 Umræður

Með því að auka erfðaeiturálag á streitu með því að bæta öðru höggi við DDR brautina, bjuggum við til nýtt músarlíkan sem sýnir umfangsmesta mengi AT einkenna af hvaða gerð sem er til þessa. Þetta felur í sér alvarlega og versnandi ataxíu sem tengist rýrnun í heila og truflunum á PN-eiginleikum ásamt hárri tíðni krabbameins og galla í þróun ónæmisfrumna. Saman ná þessar fylgisjúkdómar yfir þrjár helstu orsakir ótímabærs dauða íAT—hver leggur sitt af mörkumtil um það bil þriðjungs dauðsfalla. Af þeim eru óvirk áhrif ataxíu hvað mest ígengni og er greint frá því af sjúklingum og umönnunaraðilum að þau hafi mest áhrif á lífsgæði þeirra. Af þessum sökum er nærvera hreyfingarleysis og rýrnunar í heila í þessu nýja músarlíkani afar mikilvæg, þar sem það veitir í fyrsta skipti úrræði til að skýra ekki aðeins fyrirkomulag taugatruflana, heldur einnig nauðsynlegt in vivo líkan til að Prófaðu alvarlega þörf á AT meðferð, svo sem gegnumlesningarsamböndin sem við lýsum hér. Við fundum nokkur líkindi á milli heildarframvindu ataxíu í Atm3535; Aptx mýs ogAT sjúklingar. Í klínískri AT sjást hreyfibrestir um það bil 2 ára þegar foreldrar og læknar greina skerta getu til að skipta frá smábarni yfir í slétt, viðbragðssamhæft hlið - því miður er lítið vitað um hreyfigalla á fyrri stigum vegna sjúkdómanna lágt algengi og núverandi skortur á snemma greiningarprófum (Rothblum-Oviatt o.fl. 2016). Sjúklingar læra venjulega að ganga án aðstoðar og taugafræðileg einkenni hafa tilhneigingu til að haldast stöðug fyrstu 4 til 5 ár ævinnar (Rothblum-Oviatt o.fl. 2016). Við fundum svipaða snemma framvindu hreyfibilunar í Atm735×R3x; Aptx^' mýs, sem greina snemma væga hreyfibilun við P8 (réttur viðbragðsbrestur) fylgt eftir af hlutfallslegum stöðugleika, áður en framsækin og alvarleg ataxía þróaðist eftir p210 sem innihélt breytingar á göngulagi, skelfingarviðbragði, skjálfta og hreyfigetu. starfsemi. Nokkrar mikilvægar spurningar vakna út frá þessum niðurstöðum, þar á meðal hvort ATM og/eða APTX hafi taugaþroskahlutverk í

litla heila. Framtíðarrannsóknir sem beinast að fyrstu stigum truflunarinnar munu skipta sköpum til að skilja hvort heilinn þróast eðlilega fyrir truflun á starfseminni eða hvort þroskagallar séu upphafsorsök. Við komumst líka að því, svipað og AT-sjúklingar, að alvarleiki seint-þróaða ataxíunnar var breytilegur, þar sem sumar mýs fóru á göngu með klaufalegt, hátt stigið afturhlið (myndband 3) og aðrar hreyfðust nánast eingöngu með beygingu í afturbolnum ( Mynd.1E og myndband 4)(Rothblum-Oviatt o.fl. 2016; Levy og Lang 2018; Boder og Sedgwick 1958). Á heildina litið komumst við að því að Atm?35×xR35×; Aptx mýs þróuðu sjónrænt djúpt og mælanlegt stigvaxandi tap í hreyfisamhæfingu svipað því sem sést hjá AT sjúklingum, sem var bjargað með tjáningu á að minnsta kosti einu eintaki af Atm eða Aptx get he. Tap á hreyfisamhæfingu í AT hefur verið rakið til hrörnunar í heila vegna tiltölulega sértækrar taugasjúkdóma í heilanum og orsakahlutverks í nokkrum mismunandi gerðum ataxíu (Hoche o.fl. 2012). Í samræmi viðAT sjúklingurtaugamyndarannsóknir (Wallis o.fl.2007; Sahama o.fl. 2015; Sahama o.fl. 2014; Dineen o.fl. 2020; Tavani o.fl. 2003; Quarantelli o.fl.2013), við finnum að stærð heilans í Atm735×R3× ; Aptx' mýs eru í upphafi eðlilegar, en rýrnar smám saman samhliða breytingum á taugastarfsemi. Þó að tap á heilavef hafi verið talin helsta orsök hreyfingarleysis hjá mönnum, er óljóst af klínískum gögnum hvort alvarleiki hreyfingarleysis sé góður spádómur um umfang heilahrörnunar sem fannst eftir slátrun (Aguilar o.fl. 1968b: Crawford o.fl., 2006) : Dineen o.fl.2020). Í hraðbanka?35×R35×; Aptx^ mýs, finnum við skýra rýrnun sem tengist þynningu á Purkinje taugafrumu dendrite laginu sem kemur á undan seint, alvarlegum hegðunarbrestum. Vefjafræðilegar athuganir okkar í Atm?35xR35×; Aptx'mices benda til þess að breytingar á heilastarfseminni sjálfri, frekar en djúpstæðu tapi á heilafrumum, nægi til að valda ataxískri svipgerð, í samræmi við athugun á hegðunargöllum fyrir marktækt PN tap í nokkrum SCAs (Shakkottai o.fl. 2011: Lorenzetti o.fl. 2000; Clark o.fl. 1997; Jayabal o.fl. 2016). Ástæðan fyrir því að ATM og APTX skortur er nauðsynlegur til að mynda hreyfingarleysi í músum þegar tap á hvoru tveggja er nægjanlegt til að valda hreyfingarleysi hjá mönnum er enn óljós. Einn möguleiki er sá að nagdýrsheilinn noti á sveigjanlegri hátt jöfnunarferla eða óþarfa prótein á meðan hann bregst við 10-20k DNA skemmdum sem hafa áhrif á frumur á hverjum degi (Lindahl og Barnes 2000). Nokkrar gerðir af DNA-viðgerðum eru til til að mæta þessari áskorun, þar á meðal basaúrskurðarviðgerð (BER), nukleótíðúrskurðarviðgerðir (NER),

Smelltu hér til að læra meira um Cistanche

sem og einsleit og ósamstæð endatenging (HEJ og NHEJ, í sömu röð), sem ATM og APTX hafa verið tengdir við (Chou o.fl.2015; Caglayan o.fl. 2017; Wakasugi o.fl. 2014; Tumbale o.fl. 2018; Chatterjee og Walker 2017) Að öðrum kosti getur það verið tilviki að skortur á ATM eða APTX einn og sér hefur ekki nægjanlega áhrif á heilsu frumna á tiltölulega stuttum líftíma músarinnar og því er nauðsynlegt að útrýma báðum próteinum til að ná nægilega uppsöfnun á DNA skemmdum til að koma fram á þessu tímabili. Þessi möguleiki er styrktur af þeirri staðreynd að ATM og APTX hafa sérstaka lífefnafræðilega eiginleika og virknihlutverk í DNA skaðasvöruninni, og því er spáð að skortur á hvoru tveggja valdi víðtækari áhrifum á stöðugleika erfðamengisins (þ.e. aukinni erfðaeiturálagi). Niðurstaða okkar að tvö prótein í erfðamengisstöðugleika feril eru nauðsynleg til að framkalla taugafræðilega galla í músum bendir eindregið til þess að það sé tap á ATM Oriole í DNA viðgerð, frekar en hugsanleg virkni í oxunarálagsboðum, hvatvef eða starfsemi hvatbera sem veldur heilagallanum ( Shiloh 2020). Hins vegar er ekki alveg hægt að útiloka aðra kosti þar sem APTX, eins og ATM, hefur sést innan hvatbera heilafrumna, þar sem talið er að það styðji vinnslu á DNA hvatbera (Meagher og Lightowlers 2014; Sykora o.fl. 2011). Þetta nýja músarlíkan býður upp á nýtt tæki til að kanna þessa möguleika og skilgreina vélrænt hvernig tap á ATM og APTX veldur að lokum truflun á heilastarfsemi. Lífeðlisfræðilegar truflanir sem sjást í PNs skráðum frá AtmR35XR35X; Aptx mýs finnast á sama hátt í nokkrum öðrum múslíkönum af ataxíu. Þetta felur í sér breytingar sem við sáum á PN inntaksviðnám, himnurýmd og AP þröskuld og breidd, sem einnig hefur verið lýst í músalíkönum af SCA eins og 1, 3 og 7 (Stoyas o.fl.2020; Shakkottai o.fl.2011; Dell 'Orco o.fl.2015). Þar að auki, stigvaxandi lækkun á PN aðgerðarmöguleika skottíðni sem við greinum frá, tengist jákvæðu þróuninni á ataxíu í AtrnR35XR35X; Greint er frá Aptx'mýs í miklum fjölda ataxískra músalíkana, þar á meðal SCAs 1, 2, 3,5, 6 og 13 auk nokkurra þáttaforma (sjá umfjöllun (Cook, Fields og Watt 2021)). Með hliðsjón af verulegri skörun í PN truflunum sem sést í mörgum mismunandi ataxíur af völdum mismunandi frumugalla, hefur endurheimt PN AP skottíðni verið talin víðtæk meðferðaraðferð. Hins vegar er enn óljóst hvort minnkað PN-hleypa sé orsakaþáttur ataxíu. Þar að auki benda tilraunagögn til þess að breytingar á PN virkni geti í raun verið almenn svörun til að viðhalda samvægi við áframhaldandi sjúkdómstengda skerðingu á PN lífeðlisfræði (Dell'Orco o.fl. 2015). Þess vegna þarf áframhaldandi viðleitni í öllum heilahreyfingum til að tengja erfða-, sameinda- og frumutruflun af völdum sjúkdóma við sérstakar breytingar á taugaboðum í heila sem á endanum mynda hreyfingarleysið. Mikilvægt í þessu viðleitni mun vera að ákvarða hvort sjúkdómsvaldandi heilagallar valda hjartsláttartruflunum í gegnum heilastarfsemina (td tap á samhæfingarmerkjum meðan á hreyfingu stendur) eða frá ríkjandi neikvæðum áhrifum (td truflun á niðurstraums taugakerfi) hringrásir með óeðlilegt úttaksmynstur tauga). Á endanum, þó að sameiginleg meðferðaraðferð til að takast á við truflun í heila myndi hafa mest áhrif, getur markviss nálgun sem tekur á mismunandi erfðafræðilegum og sameindafræðilegum orsökum truflunar á frumum verið nauðsynleg til að þróa árangursríka meðferð með góðum árangri. Vélræn tengsl milli skorts á DNA stöðugleikaprótein eins og ATM og APTX og PN truflun er langt frá því að vera ljóst. Niðurstöður okkar benda til þess að áhrif ATM og APTX taps á PNs séu eðlislæg, þar sem við finnum ekki breytingar á presynaptic eiginleikum kornfrumna eða vísbendingar um frumutap þeirra (engin breyting á GCL þykkt). Þar að auki, þó að við sjáum mun á skammtímamýktni óæðri inntaks olíufrumna í ATM- og APTX-skorti PNs og villigerð, benda þessar niðurstöður líklega til truflunar á Ca2*-jafnvægi, hugsanlega vegna lækkunar á Inositol 1,4,5- Tjáning þrífosfatviðtaka 1(ltpr1), svipað þeirri sem sést í SCAs 1,2 og 3 múslíkönum sem og ATM-skortum músum (Kim o.fl.2020; Chen o.fl.2008; Demirci o.fl.2009; Shakkottai et al. al.2011). Þó að þetta gefi vænlega leið til framtíðarskoðunar og samanburðar, er enn óljóst, jafnvel fyrir SCAs, hvort breytingar á Ca²* samvægi, sé orsakaþátturinn eða bara annað einkenni eða jafnvel uppbótasvörun sjúkra eða truflaðra PNs (Dell 'Orco o.fl.2015). Í ónæmiskerfinu tengist ATM viðgerð á DNA brotum sem verða náttúrulega við endurröðun gena mótefnavakaviðtaka í B- og T-frumu forverum, fyrirbæri sem er mikilvægt fyrir fjölbreytileika mótefnavakaviðtaka (LG og TCR) þessara frumna. að finna þaðT-frumahlutföll í blóði eru verulega lækkuð er í samræmi við fyrri rannsóknir á mönnum og AT knockout músum (Schubert, Reichenbach og Zielen 2002; Hathcock o.fl. 2013; Chao, Yang og Xu 2000; Barlow o.fl. 1996). Þessi fækkun T-frumna í jaðrinum tengist líklega galla í bæði frumu- og húmorsónæmi. Mikilvægt er að við komumst að því að tjáning á einu eintaki af ATM geninu er nóg til að endurheimta CD4 plús skort í blóði sem gefur til kynna að meðferðir sem geta endurheimt að hluta ATM tjáningu myndu hafa lækningalega virkni. Þó að við höfum ekki metið þróun B-frumna í þessari grein er líklegt að svipaðar niðurstöður ættu við um það ferli miðað við vélræna líkindi þeirra (Marshall o.fl. 2018). Eins og búist var við er fækkun T-frumna í útlægu blóði í tengslum við gallaða þróun skjaldkirtils. Í hóstarkirtli fundum við tvo megingalla. Einn, fyrst og fremst framkallaður af APTX skorti, kemur fram sem galli í DN3 til DN4 umskiptum sem fellur saman við snemmbúna endurröðun á TCR staðinum. Hinn gallinn, sem er fyrst og fremst af völdum ATM skorts, tengist minni framgangi tvíjákvæðra CD4*CD8 í ein jákvæðar frumur, fyrst og fremst CD4' thymocytes. Þó að APTX niðurstaðan hafi komið á óvart, þar sem skortur hennar (AOA 1) er ekki tengdur ónæmisbrestum, er vitað að APTX hefur samskipti við TCR gena endurröðunarprótein, þar á meðal XRCC4 (Clements o.fl. 2004). Framtíðarrannsóknir sem miða að því að skilgreina hlutverk APTX í endatengingaraðferðum við endurröðun TCR gena verða

mikilvægur, og möguleikinn á því að aðrir endatengingaraðferðir, eins og notkun örheimilda, skýri skort á ónæmisbrest í fjarveru þess þarfnast frekari rannsóknar (Bogue o.fl. 1997). Lifunarhæfni Atm?35×/R35×; Aptx'mýs eru talsvert lengri en fyrri AT músarlíkön. Til samanburðar, fyrstaHJÁ KOmúsamódel sem Barlow o.fl. dó úr hóstarkirtli venjulega innan 2-4 mánaða eftir fæðingu (Barlow o.fl. 1996). Minnkuð lifunarhæfni krabbameins í þessu og mörgum öðrum AT múslíkönum er líklega erfðafræðileg, þar sem sýnt hefur verið fram á að bakgrunnsstofninn sem geymir stökkbreytinguna hefur veruleg áhrif á algengi og lifun krabbameins, með A/J og C57BL/6

bakgrunnur sem hefur verulega aukna lifunargetu yfir BALBC og 129S stofnunum (Genik o.fl. 2014). Sú staðreynd að mýsnar okkar sem skortir hraðbanka voru búnar til á C57BL/6 bakgrunni liggur líklega til grundvallar; að Aptx*t mýsnar fái ekki ataxíu, það er tiltölulega langur líftími þeirra. Í ljósi þess að Atm35xR35×; ólíklegt að snemma dauði í AT KO músum komi í veg fyrir athugun á ataxískri svipgerð sem annars myndi þróast í þessum músum. Hins vegar er ekki vitað hvort C57BL/6 bakgrunnur veitir seiglu til að þróa hreyfihömlun, eins og fyrir krabbamein. Að skilgreina erfðafræðilega eða hugsanlega epigenetic þætti sem hafa áhrif á alvarleika sjúkdómsins gæti veitt leið til framtíðar lækningaþróunar. Í ljósi hnattræns eðlis ATM og APTX núllstökkbreytingarinnar í músamódelinu okkar, getum við ekki alveg útilokað að utanheilagallar geti einnig stuðlað að alvarlegri ataxískri svipgerð og þar með framtíðarskoðun utan litla heila í framheila, heilastofni, mænu. , og jafnvel vöðva mun þurfa að fara fram. Innan litla heila, á meðan við fundum einhvern líffærafræðilegan mun á PN-kveikjunareiginleikum innan mismunandi svæðum í litla heila, fundum við ekki svæðisbundinn mun á ML-breidd eða PN-þéttleika. Hins vegar eru áskoranir í því að nota svæðisbundin líffærafræði sem hópþátt í litla heila, þar sem líkamlegir vefjafellingar eru ekki endilega í fylgni við mörk virkni-, sameindatjáningar eða lífeðlisfræðilegra eiginleikasviða sem hefur verið lýst (Apps og Hawkes 2009 ; Tsutsumi o.fl.2015; Gao, van Beugen og De Zeeuw 2012; Zhou o.fl.2014). Tilraunir sem beinast að því að kanna umfang heilagalla innan þessara sviða verða mikilvægar í framtíðarrannsóknum og bornar saman við sögulegar skýrslur um líffærafræðilegan mun á AT sjúklingum (Verhagen o.fl. 2012; De Leon, Grover og Huff 1976; Amromin, Boder, og Teplitz 1979; Monaco o.fl. 1988; Terplan og Krauss 1969; Strich 1966; Solitare 1968; Solitare og Lopez 1967; Aguilar o.fl. 1968a; Paula-Barbosa o.fl. 1983). Þó að við greinum tvö hugsanleg stig í framvindu ataxíu í Atm735wR35x; Aptx mýs, seinna stig alvarlegrar ataxíu þróast á fullorðinsárum hjá músum, samanborið við upphaf barnæsku hjá mönnum. Þetta gæti takmarkað notkun þess í sumum taugaþroskarannsóknum. Einnig verður túlkun framtíðartilrauna að huga vel að þeirri staðreynd að þetta nýja líkan tjáir núllstökkbreytingar í tveimur stöðugleikagenum í erfðamengi á sama tíma, ástand sem hefur ekki greinst hjá mönnum með annaðhvort AT eða AOA1. Að lokum hefur verið áskorun að finna hvar, hvenær og hvernig skortur á hraðbanka veldur meinafræði og hreyfihömlun í heila, þar sem fyrri mýs sem skortir hraðbanka skortir almennt þá einkennandi eiginleika sem þarf til að tengja frumu- og sameindaskort við ataxíska svipgerðina. Margar efnilegar rannsóknarleiðir hafa verið skilgreindar, þar á meðal þær sem beinast að taugafrumum, þar sem ATM tengist oxunarálagsboðum (Chen o.fl. 2003) og taugamótavirkni (Li o.fl. 2009; Vail o.fl. 2016), eins og auk virkni glium, þar sem nýlegar vísbendingar benda til þess að glial meinafræði gæti verið leiðandi þáttur í meinafræði heila (Kaminsky o.fl. 2016; Campbell o.fl. 2016; Petersen, Rimkus og Wassarman 2012; Weyemi o.fl. 2015). Þetta nýja dýralíkan býður upp á nýtt tæki til að prófa vélrænar tilgátur um hvernig hraðbankaskortur veldur meinafræði í heila og hreyfingarleysi. Að auki gæti þetta líkan þjónað mikilvægast sem mikilvægt forklínískt tæki til að prófa áður fyrirhugaða meðferðarframbjóðendur (Browne o.fl. 2004; Chen o.fl. 2003) og okkar eigin SMRT efnasambönd (Du o.fl. 2013). Ekki er hægt að ofmeta þær alvarlegu takmarkanir sem fylgja því að hafa ekki viðeigandi forklínískt líkan fyrir meðferðarpróf, sérstaklega fyrir sjaldgæfa sjúkdóma eins og AT og AOA1.

4.0 Efni og aðferðir

4.1 Siðferðisyfirlýsing

Þessi rannsókn var gerð í ströngu samræmi við ráðleggingar í Leiðbeiningar um umönnun og notkun tilraunadýra frá National Institute of Health. Öll dýrin voru meðhöndluð í samræmi við samþykktar samskiptareglur Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) hjá Lundquist Institute (31374-03,31773-02) og UCLA(ARC-2007-082, ARC{{3} }). Bókunin var samþykkt af nefnd um siðfræði dýratilrauna Lundquist Institute (trygginganúmer: D16-00213). Allt kapp var lagt á að lágmarka sársauka og þjáningu með því að veita stuðning þegar þörf krefur og velja siðferðilega endapunkta.

4.2 Mýs

All mice were group-housed and kept under a 12-h day/night cycle with food and water available ad libitum. Animals were housed within the general mouse house population, and not in specialized pathogen-free rooms. Older animals were made available wetted food or food gel packs on the ground of the cages as ataxia developed. Atm35 and Atm935×mice were created and provided by Dr. Hicks and colleagues at the University of Manitoba. These mice were created to contain the c.103C>T stökkbreyting sem finnst í stórum íbúa Norður-AfríkuATsjúklingum using recombineering Gateway technology and site-directed mutagenesis. A C>T mutation at this position in the mouse Atm gene creates a TAG G stop codon. The same mutation in the human ATM gene produces a TGA G stop codon. In consideration of the use of these models for therapeutic interventions, we chose to create a mouse model for each of the two PTC codons(Fig.1A). A modified Gateway R3-R4-destination vector was used to pull out the desired region of the mouse Atm gene from a Bacterial Artificial Chromosome (BAC) and subsequently mutated to create either a TAG G stop codon at codon 35(M00001, position 103(C>T))or a TGA G stop codon (M00002, position 103 (CAG>TGA), sem endurtekur manninn AT PTC). Erfðasamsæturnar voru síðan klónaðar í breytta útgáfu af NorCOMM spendýramiðunarferjunni með því að nota 3-way Gateway Reaction (Bradley o.fl. 2012). Markmiðsferjurnar sem fengust voru rafporaðar inn í C2 ES frumur (C57BI/6N, fengnar í A. Nagy lab, Toronto, Kanada) og klónar sem miðuðust á með góðum árangri voru auðkenndar með vali með G418 (Gertsenstein o.fl. 2010). Samþætting stökkbreyttu miðunarsnælunnar í Atm genastaðinn var staðfest með Southern blot og með raðgreiningu á PCR vörum til að staðfesta tilvist Atm PTC stökkbreytingarinnar, villulausa miðun inn í Atm staðinn og villulausir virkir þættir

vektor (gögn ekki sýnd). Jákvæðir ES klónar voru notaðir fyrir inndælingu á blastocyst til að fá erfðabreyttu línurnar. Erfðabreytta samsætan innihélt floxaða beta-aktín stuðlar-delta úr mönnumTK1-Ný cassette in the intron upstream of the region containing the mutated exon. This floxed cassette was subsequently excised by crossing with a Cre driver mouse(B6.C-Tg(CMV-are)1Cgn/J) to generate Atm3x+ and AtmM1(103CTMFcc, respectively) mouse lines Atm35×+ (MGI nomenclature: AtmTM1(103CAG>TGA)MFGCc;(Mynd 1A). Arfgerð á Atm línunum tveimur var framkvæmd með því að nota eftirfarandi primera við Tm 62 gráðu gráðu: Atm gen forward (F) primer:5'-CCTTTGAGGCATAAGTTGCAACTTG-3'; og Atm gen öfug(R) primer: 5'-GTACAGTGTATCAGGTTAGGCATGC-3', sem myndar villigerð samsætuafurð upp á 151bp eða marksamsætuafurð upp á 241bp (myndir 1A, 1B). Atmn35~ og Atm035×v voru afturkrossað með C57Bl/6J músum í 9 kynslóðir (99,2 prósent ísógena) fyrir frystingu og síðari endurgerð með C57BI/6J staðgöngumæðrum. Atm735× og Atm?35xog Atm 35×/Q35× voru ræktendur fengnir úr F1 systkinum Atm35 og Atm835X plús músum. AtmR35×k35×: bæði reyndust frjósöm. Aptx knockout (Aptx) mýs voru búnar til og veittar Dr. Mathews sem fósturvísar frá Dr. McKinnon (Ahel o.fl.2006), og síðan endurfengnar með C57Bl/6J staðgöngumæðrum. Aptx' mýs eru á C57Bl/6 og 129 blönduðum bakgrunni. Hraðbanki35k35; Aptx mýs af ýmsum villigerðum, arfblendnum og arfhreinum samsetningum voru búnar til úr Atm35X; Aptxt ræktendur voru búnir til með því að fara yfir Atm?35×R35 og Aptx^ mýs. Einn hópur af tvöföldum stökkbreyttum og samsvarandi viðmiðunarmúsum var notaður í hegðunarrannsókninni á lengd fyrir göngugreiningar og SHERPA próf (Mynd.2,3). Margir hópar til viðbótar af aldurssamsvöruðum tvöföldum stökkbreyttum og viðmiðunarmúsum voru notaðir fyrir raflífeðlisfræðilegar, ónæmisfræðilegar og lóðrétta skautprófanir (myndir 4, 7). Ónæmisfræðilegar og próteintjáningartilraunir voru gerðar með því að nota mús sem ræktaðar voru úr upprunalegu AtmR35× og Atm35×endurafleiddum músum (myndir 5, 6 og 8). Arfgerð var framkvæmd úr eyrnavefssýnum P8-11 músa. Rauntíma PCR aðferðir framkvæmdar af Transnetyx Inc. voru notaðar til að ákvarða arfgerð hvers dýrs. Dýr voru auðkennanleg með tá húðflúr sem gefin voru á sama tíma og eyrnasýni. Einstakir frumrar fyrir Atm35× og Atm35× voru magngreindir og notaðir til að bera kennsl á villigerð, arfblendnar og arfhreinar mýs (taldar upp hér að ofan). Aptx'og Aptx*" primers voru notaðir til að meta arfgerð þeirra.

4.3 Dýraheilbrigði

Dýr voru vigtuð með stafrænum vog á P8, 45, 120,210,400. Dýradauði var skráður sem dagurinn sem fannst dauður, eða á aflífunardegi þegar dýrin náðu mannúðlegum endapunkti (dýr sem gat ekki rétt sig á sjöunda áratugnum, veruleg hármottur sem bendir til skorts á sjálfshirðu eða óhóflegrar vanlíðan eins og dýralæknirinn hefur bent á. starfsfólk). Dýrahræ voru fryst strax við dauða og krufning eftir slátrun gerðar í lotum. Líkleg dánarorsök var ákvörðuð eftir bestu getu í samvinnu við starfsmannadýralækninn (Dr. Catalina Guerra) með sjónrænni skoðun á innri líffærum. Sumar mýs voru mannát eða fargað óvart af vivarium starfsfólki og voru það

því merktar sem "týndar." Mýs með enga sjáanlega sjónræna dánarorsök voru merktar "óákveðanlegar." Mýs sem fundust með brjóstholsmassa nálægt þeim stað þar sem hóstarkirtli myndi venjulega vera hjá ungum músum voru skráðar með "krabbamein í hóstakirtli." Öll önnur auðkennd Líklegar dánarorsakir (td stækkuð lifur, þvagteppa) voru merktar „annað“.

4.4 Hegðun

Áður en hegðunarpróf voru framkvæmd voru mýs aðlagast atferlissvítunni í ~20 mínútur. Mýsnar voru prófaðar á mismunandi tímum sólarhringsins, í takt við daglega hringrás þeirra. Rafhlaða hegðunarprófa var gerð á barnalegum tvöföldum stökkbreyttum músum af tilgreindum arfgerðum á ýmsum tímapunktum eftir hegðun en í sama hópi músa. Rafhlaðan af prófunum innihélt Catwalk göngumatið (P45, 120.210, 400) og undirmengi SmithKline-Beecham Harwell Imperial-College og Royal-London-Hospital Phenotype Assessment(SHERPA) prófunum (P30 og 400). Þessar prófanir voru gerðar af UCLA Behavioral Core. Tvöfaldar stökkbreyttar og viðmiðunarmýs voru að auki skoðaðar á Vertical Pole prófinu. Öll atferlistæki voru þurrkuð niður með etanóli (70 prósent) á milli hvers prófunaraðila.

Gangagreining

Við notuðum Noldus Catwalk göngugreiningarkerfi sem er hannað til að mæla og greina göngulag músa hálfsjálfvirkt við venjulega ferð. Í stuttu máli, hreyfing músa yfir gang með glerbotni er myndbandsupptaka frá miðlægum stað. Paw prints eru auðkennd í myndbandinu vegna ljóss yfir glergöngupallinn. Hvert músarskref í myndbandi er síðan greint með því að nota Catwalk XT (Noldus) á hálfsjálfvirkan hátt. Hlaupa fyrir hverja mús samanstendur af 3 tilraunum með samfelldri ferð yfir eftirlitsvettvanginn. Aðeins samræmdar rannsóknir eru samþykktar og mýs geta tekið allt að 10 tilraunir til að klára 3 samhæfðar rannsóknir í hvora áttina sem er yfir ganginn. Samræmdar tilraunir voru skilgreindar sem þær með hreyfingu yfir pallinn undir 5 s langan og með ekki meira en 60 prósent hraðabreytingu. Þegar þær voru settar á pallinn hlupu mýs yfirleitt fram og til baka án þess að þurfa að biðja um tilraunamenn.

Lóðrétt stöng

Mýsnar eru settar efst á 80 cm háan bolta með nefið niður og afturlappirnar eins nálægt toppnum og hægt er. Músum er strax sleppt og tíminn byrjaði strax við staðsetningu.

Tíminn er stöðvaður þegar fyrsta frampottin snertir yfirborðið fyrir neðan stöngina. Eðlileg áhugi músa er að klifra strax niður stöngina og þær fá allt að 60 sekúndur til að fara yfir stöngina, annars er þeim hjálpað af stönginni. Tilraun sem ekki er lokið fær sjálfkrafa 30 sekúndna tíma þar sem 95 prósent músa sem fóru ekki niður innan 30 sekúndna voru enn á stönginni á 60 s. SHIRPA hegðunarpróf voru framkvæmd af háskólanum í Kaliforníu, Los Angeles hegðunarkjarna á P30

og P400. Allar færibreytur eru skornar til að veita megindlegt mat. sem gerir kleift að bera saman niðurstöður bæði yfir tíma og milli mismunandi rannsóknarstofa. Hver mús var prófuð í röð fyrir alla hegðun innan ~20-mín. tímabils áður en farið var yfir í næstu mús. Tilraunamaðurinn var blindaður fyrir arfgerð dýra. Skjárinn var framkvæmdur eins og áður hefur verið lýst (Rogers o.fl. 1997).

Atferlisathugun

Aðalskjárinn gefur hegðunarathugunarsnið og mat á hverju dýri hefst með því að fylgjast með ótrufluðri hegðun í skoðunarkrukku (10 cm í þvermál) í 5 mín. Til viðbótar við hegðun líkamsstöðu, sjálfsprottna virkni, öndunarhraða og skjálfta, skráir áhorfandinn öll tilvik um furðulega eða staðalmyndaða hegðun og krampa, áráttusleik, sjálfseyðandi bit og afturhvarf (ganga afturábak) og vísbendingar um staðbundna hegðun. stefnuleysi.

Arena hegðun

Eftir það er músin flutt á vettvang (30 cm x 50 cm) til að prófa flutningsörvun og athuga eðlilega hegðun. Völlurinn er merktur í rist af 10 x 10 cm² ferningum til að mæla hreyfivirkni innan 30 s-tímabils. Á meðan músin er virk á vettvangi eru mælingar á skelfingarviðbrögðum, göngulagi, grindarholsupphæð og halaupphæð skráð.

Liggjandi aðhald

Dýrið er haldið í liggjandi stöðu til að skrá sjálfvirka hegðun. Meðan á þessu mati stóð var metinn gripstyrkur, líkamstónn, hálsviðbragð, glæruviðbragð, táklípa, vírhreyfing og hjartsláttur.

Jafnvægi og stefnumörkun

Að lokum voru gerðar nokkrar mælingar á starfsemi vestibular kerfisins. Framkvæmd var réttunarviðbragð, snertiviðbragðspróf og neikvæðar jarðáxlapróf. Í gegnum þessa aðferð var raddsetning, þvaglát og almennur ótti, pirringur eða árásargirni skráð.

Búnaður notaður

1.Glært plexígler leikvangur (áætlað innri mál 55x33 x18 cm). Á gólfi vallarins er plexiglerplata merkt 15 ferningum (11 cm). Stífur láréttur vír (3 mm í þvermál) er festur yfir hægra aftara hornið þannig að dýrin geti ekki snert hliðarnar meðan á vírnum stendur. Rist (40x 20 cm) með 12 mm möskva (u.þ.b.) er fest þvert yfir breidd kassans til að mæla skottfjöðrun og hegðun gripstyrks. 2. Tær plexígler sívalningur (15 x ll cm) var notaður sem útsýniskrukka. 3. Ein ristgólf(40x 20 cm)með 12mm möskva sem útsýniskrukkur standa á.4. Fjórar sívalar burðarrásir úr ryðfríu stáli (3 cm lengd x 2,5 cm í þvermál) til að lyfta ristunum af bekknum. 5. Ein ferningur (13 cm) ryðfrítt stálplata til að flytja dýr á völlinn. 6. Skerið lengdir af 3/0 Mersilki sem haldið er í tönginni fyrir viðbragðspróf á glæru og mænu 7. Plaststöng var skerpt í blýantsodda til að prófa munnvatnslosun og bit.8. Töng til krufningarbúnaðar, bogin með fínum oddum (125 mm töng, Philip Harris Scientific, Cat. No. D46-174), fyrir táklípuna. 9.Skiðklukka.10. IHR Click kassi er notaður til að prófa skelfingarsvörin. Click Box myndar stuttan 20 kHz tón við 90dB SPL þegar haldið er 30 cm fyrir ofan músina. Hafðu samband við prófessor KP Steel, MRC Institute of Hearing Research, University Park, Nottingham NG7 2RD. 11.Stöng.12.30 cm glært plexígler rör með 2,5 cm innra þvermál fyrir snertiréttingarviðbragðið.4.5 Raflífeðlisfræði Undirbúningur bráðrar heila sneiðar sætar parasagittal sneiðar af 300 μm þykkt voru útbúnar úr litla heila tilraunamúsa og viðmiðunargots. með því að fylgja birtum aðferðum (Hansen o.fl., 2013). Í stuttu máli, litla heilinn var fjarlægður fljótt og sökkt í ískalda utanfrumulausn með samsetningu (mM): 119 NaCl, 26 NaHCOg, 11 glúkósa, 2,5 KCl, 2,5 CaCla, 1,3 MgCla og 1 NaHzPOa, pH 7,4 þegar gasaður með 5 prósent CO-/95 prósent O2. Cerebella var skipt í parasagittally með því að nota vibratome (Leica VT-100, Leica Biosystems, Nussloch, Þýskalandi) og upphaflega ræktað við 35 gráður í -30 mín., og síðan jafnvægisstillt og geymt við stofuhita fram að notkun. Utanfrumu raflífeðlisfræði Utanfrumu- og innanfrumuupptökur voru fengnar úr Purkinje-taugafrumum (PNs) í sneiðum sem voru stöðugt gegnsýrðar með karbógen-bólulausri utanfrumulausn og haldið við annað hvort 37 gráður C (utanfrumu) eða 32 gráður (innanfrumu) ± 1 gráðu (sjá hér að ofan). Frumur voru sýndar með DIC ljósfræði og 40× hlutlægu vatni (NA 0,75) með Zeiss Examiner smásjá. Glerpípettur með ~3 MQ viðnám (líkan P-1000, Sutter Instruments, Novato, CA) voru fylltar með utanfrumulausn og staðsettar nálægt PN axon hæðum til að mæla rafrýmd straumstrauma tengda virknimöguleika í spennuklemmuham. með pípettugetu haldið við 0 mV. Fyrir upptökur úr heilfrumu plástraklemmu voru pípettur fylltar með innanfrumulausn (mM): 140 mánuðir (CH3KO3S), 10 NaCl, 2 MgCl2, 0,2 CaClz, 10 HEPES, 14 Phosphocreatine (tris salt), 1 EGTA, 4 mg -ATP,0,4 Na-GTP.100 μM Picrotoxin (Sigma) var bætt við til að hindra hamlandi GABAegeric taugamótainntak. Gögn voru aflað með því að nota

MultiClamp 700B magnari við 20 eða 100 kHz í spennu- eða straumklemmuham, Digidata 1440 með pClamp10(Molecular Devices, Sunnyvale, CA) og síaður við 2 til 4 kHz. Röð viðnám var venjulega á milli 10 og 15 MQ. Röð mótstöðu var bætt við 80 prósent fyrir skammtíma plastleiki tilraunir eingöngu. Fyrir utanfrumuupptökur voru samtals 20 til 45 PNs skráð frá fyrir hvert dýr í öllum arfgerðum, kynjum og aldurshópum. Upptökum var dreift yfir bæði miðlæga hliðarás og rostrocaudal ás litla heila. Aðeins frumur með „heilbrigðu“ útliti (lítil birtuskil á frumumörkum) og reglulegum, óslitnum skothraða voru skoðaðar. Við greiningu reyndust nokkrar frumur hafa eyður í skotinu sem var meira en 2 sekúndur og þessar frumur voru fjarlægðar úr greiningunni, þar sem þessi tegund af skoti tengist því að vera „óheilbrigð“. Tvöfaldur stökkbreyttur vefur var ekki eðlismunur í framkoma undir DIC smásjá fyrir upptökur, né var fjöldi „óheilbrigðra“ frumna meiri en annarra arfgerða (7 prósent á móti 4 til 11 prósent allra frumna í samanburðararfgerðum við P400). Staðbundinn samanburður á taugavirkni var fenginn með því að skrá úr raðhlutum í flocculus, hliðar (2"d eða 3'), millistigum (6" eða 7.) og miðlægum (11" eða 12t) sneiðum. Lægri sneiðar voru notaðar í yngri aldurshópunum (P45 og 110) til að samsvara nokkurn veginn hlutfallslegri staðsetningu skráninga á milli aldurshópa. 0-3 upptökur voru gerðar úr hverjum hnakka innan hverrar sneiðar, háð gæðum vefja og heilsu. Hver upptaka stóð yfir í {{29} }mínútu 3 til 5 mýs voru notaðar fyrir hvern aldurshóp og tilraunamaðurinn var blindaður fyrir arfgerð, aldri og kyni.

Innanfrumuupptökur voru fengnar úr PNs í annaðhvort lobule IIl eða VIl í miðlæga litla heila (þ.e. vermis); enginn tölfræðilegur munur á eiginleikum kom fram á milli hnúða.

Greiningar

Sjálfvirk aðgerðarmöguleiki milliörvunarbil voru greind og greind með því að nota staðlaðar og sérsniðnar venjur í ClampFit (Molecular Device), GoPro (Wavemetrics) og Excel (Microsoft). Nánar tiltekið voru aðgerðarmöguleikar greindir og tölfræði um hámarksfjölda (þ.e. tíðni og lengd bils) var ákvörðuð með því að nota aðlöguð kerfisreglur (TaroTools; https://sites.google.com/site/tarotoolsregister/). Fráviksstuðull meðaltals milli toppa bils (CV) og miðgildis milli toppa bils (CV2=2 ISIn plús 1-ISInl/(ISIn plús 1 plús ISIn)) voru reiknuð út í Excel með því að nota sérsniðin fjölvi. Staðlaðir himnueiginleikar voru greindir með lgorPro. RM var ákvarðað með því að reikna að meðaltali 3 spennusvörn við -5 mV skrefpúls frá -80 mV stöðvunargetu og mæla straumbeygjuna sem myndast á milli 900 og 1000 ms eftir upphaf. Tímafasti himnunnar var mældur með því að passa einn veldisvísis við upphafsskemmdarfasa frá 90 prósentum til 10 prósent af toppnum. CM var reiknað út með því að deila himnutímafastanum með RM.sEPSC atburðinum sem voru skráðir á 1-mínútu tímabili og greindir og mældir með Neuroexpress (v21.1.13). Samhliða og klifandi trefjaaxon voru örvuð með því að nota þeta-gler rafskaut (WPI) og TTL-stýrðan áreiti einangrunartæki (ISO-Flex, AMPI). Framkölluð EPSC amplitudes og rotnunartímafastar (1 exp. fyrir samhliða og 2 exp. fyrir klifurtrefja) voru greindar með því að nota sérsniðnar venjur í lgorPro. Virkjunarmöguleikar voru skoðaðir sem hluti af 1 sekúndu strauminnsprautun á milli -500 og 2250 pA (250 pA skref) með stöðvunarstraumi sem var stilltur til að viðhalda ~70 mV straumi. Aðgerðarmöguleikabylgjuform voru mæld með því að nota sérsniðna

venjur í lgorPro. Aðgerðargetuþröskuldur var skilgreindur sem fyrsta himnuspennan þar sem fyrsta afleiðan fór yfir 30 mV/ms (Zhu et al.2006).

4.6 Athugun á rýrnun heila

Stærð heila. Strax eftir að heilinn var fjarlægður úr höfuðkúpunni, fékkst mynd af baki í heilu fjalli. Myndir voru síðan unnar með Fiji (NIH). Stærð framheila og heila var metin með því að útlista 2-víddarrými þeirra og reikna síðan út svæðið. Við staðluðum fyrir mögulegum mun á heildarstærð heilans með því að deila niðurstöðum litla heila með framheilastærð til að fá hlutfallslegt hlutfall milli heila og framheila. Tilraunamenn voru blindir á arfgerð dýrsins. Ónæmisvefjaefnafræði Við viðkomandi endapunkta rannsóknarinnar (P45, 120,210,4{{7{{104}}}}0), karlkyns og kvenkyns mýs af öllum arfgerðum fulltrúi í þessari rannsókn var svæfður með ísóflúrani og gekkst undir hjartaflæði með fosfat-bufferuðu saltvatni, fylgt eftir með 4 prósentum (w/v) jafnaða paraformaldehýði (PFA) og síðan krufið til að draga út heilann. Myndir af öllum heilanum voru teknar strax eftir að heilinn var fjarlægður úr höfuðkúpunni og heilinn var síðan kafinn í 4 prósent PFA í 24 klukkustundir og síðan frostverndaður í Tris-buffered saltvatni (TBS) með 0,05 prósent aziði og 30 prósent súkrósa í 72 klukkustundir og geymt við 4 gráður þar til frekari notkun. Litli heilinn var aðskilinn frá framheila og sneiddur í parasagittal með því að nota rennandi míkrótóm （Microm HM 430, Thermo Scientific） stillt á 40 μm þykkt. Litlar heilahlutum var safnað í röð af sex og geymt í TBS-AF (TBS með 30 prósent súkrósa, 0,05 prósent natríumazíð og 30 prósent etýlen glýkól) við 4 gráður eða -20 gráður þar til frekari notkun. Til að sýna ónæmisflúrljómandi Purkinje-taugafrumum, litla hluta af báðum Atm*; Aptx*t og Atm?35×R35×; Aptx^(n=5 fyrir hverja arfgerð) voru þvegin í 5 mínútur í TBS þrisvar sinnum og síðan stífluð í 15 prósent venjulegu geitasermi við stofuhita í 30 mínútur, fylgt eftir með lausu fljótandi ræktun í kanínum eða músum and-calbindin D -28k (1:1000) í 1 klukkustund við stofuhita á hringhristara. Hlutarnir voru síðan þvegnir í 5 mínútur með TBS þrisvar sinnum, fylgt eftir með lausu fljótandi ræktun í geita gegn kanínu eða mús Alexa Fluor 488 (1:1000) í 1 klst. í myrkri við stofuhita á hringrásarhristara. Eftir auka mótefnaræktun voru hlutar þvegnir í 5 mínútur í TBS þrisvar sinnum, síðan settir upp og settir yfir með Fluoromount-G með DAPI. Fyrir suma hluta voru mótefni gegn klofnum Caspase-3(1:200) og and-CD68(1:400) að auki rannsakað samhliða Calbindin með því að nota Alexa Fluor 647 (1:500) aukamótefni. Skyggnur voru skannaðar með því að nota Stereo Investigator (MBF Bioscience, ver.2020) á Zeiss smásjá með ApoTome 2 (Carl Zeiss Microscopy, Axio Imager.M2) með því að nota annað hvort 2,5, 10, 20, 40 eða 63x hlutefni og myndir tekin með Hamamatsu CMOS myndavél (Hamamatsu Photonics, ORCA Flash 4.0 LT plús ).Til að mæla fjölda kalbindínviðbragða frumna í hverri lobule í myndunum sem fengust, notuðum við Stereo Investigator til að teikna af handahófi 2 línur á milli 300 til 500 μm langar í hvern lobule og handvirkt taldi heildarfjölda PNs eftir lengdinni innan 40 um þykkt vefjasneiðarinnar með 40x stækkun. að meðaltali til frekari samanburðar milli hnúða og dýra. Calbindin jákvæð PN dendrite breidd var mæld á fyrirfram skilgreindum stað í lobule VI frá hverju dýri í 25 eða 40 um þykkum vefjaköflum undir 20x stækkun. Dendritic breidd frumgreina og aukagreina var mæld við miðlínu milli PN frumulíkama og brún sameindalagsins. Milli 7 og 13 dendritar mældust á kafla, einn hluti á dýr. Fyrir PN líkamsmælingar var Stereo Investigator notaður til að velja PNs af handahófi sem dreift var yfir allan miðlæga hlutann með 20x stækkun. Meðalbreidd PN á hvert dýr var ákvörðuð með meðaltali niðurstaðna yfir 3 raðhluta (16 til 37 PNs á hluta). PN breidd var mæld hornrétt á PN laginu eða á útgangan dendrit ef skekktur um meira en nokkrar gráður. Breidd sameindalags og kornfrumulags (sjónrænt með Calbindin og DAPI litum, í sömu röð) voru metnar í Stereo Investigator með því að taka að meðaltali tvær breiddarmælingar á fyrirfram ákveðnum stöðum fyrir hvern lobule, um það bil hálfa leið ásamt löngu umfangi hvers lobule undir 2,5x stækkun.CD68 jákvæðni í heilahlutum var magnmæld með því að mæla heildarprósenta flatarmáls CD68 auk jákvæðrar litunar yfir allan miðheilahlutann. 10x saumaðar myndir voru þröskuldar við neikvæða samanburðinn og magngreindar með ImageJ, einn hluta á hvert dýr. Til að mæla hundraðshluta Calbindin-jákvæðra PNs sem voru jákvæðar fyrir klofnum Caspase-3 töldum við PNs yfir allan litla heila með því að nota Stereo Investigator. Skoðaðar voru þrjár saumaðar myndir með 20x stækkun á hvert dýr og meðaltal niðurstöður. Þröskuldurinn fyrir jákvæðni Caspase-3 var ákvarðaður úr samanburðarhlutum sem litaðir voru með aðeins aukamótefnum. Fyrir vefjagreiningu sem ekki er flúrljómandi, 25-um-þykkir, laust fljótandi vefjahlutar á jákvætt hlaðnar glærur og loftþurrkaðir yfir nótt. Vefurinn var þveginn í fosfat-bufferuðu saltvatni (PBS) tvisvar í 5 mínútur, síðan litaður í röð með 0,1 prósent hematoxýlíni í 95 prósent etanóli í ~25 s og 0,5 prósent eósín í 95 prósent etanóli í ~ 3 s og þvegið í tvíeimuðu vatni eftir hvern blett. Vefurinn var síðan þurrkaður í 1 mín í 95 prósent etanóli, 100 prósent etanóli og 100 prósent Xylene þvotti, síðan settur yfir með Permount. Skyggnur voru teknar upp með litamyndavél (Q Imaging, MBF Biosciences) á sömu Zeiss smásjá og MBF öflunarhugbúnaði. Tilraunamenn voru blindaðir á arfgerð músarinnar þar sem hlutar voru skoðaðir og röð rannsóknarinnar var fléttuð inn fyrir allar vefjafræðilegar mælingar.

4.7 Flæðisfrumumælingar

Flæðifrumugreining á blóði og hóstarkirtsfrumum var gerð með því að lita með sérstökum mótefnum gegn músum∶CD4, CD8, CD3, CD44 og CD25. Í stuttu máli voru heilblóðssýni (50 μ) lituð með flúrljómandi merktum mótefnum, síðan voru rauð blóðkorn greind með BD lýsilausn á meðan lifandi hvít blóðkorn voru lituð með lífvænleikalit. Thymi var vélrænt aðskilinn. 1 til 2 milljónir hóstarkirtilsfrumna voru litaðar á svipaðan hátt með því að nota sértæk mótefni fyrir CD4, CD8, CD44 og CD25. Greining á ónæmislituðum hvítum blóðkornum eða hóstarsýnum var gerð með FACS ARIA l og gögn voru greind með FlowJo hugbúnaði eins og áður hefur verið greint frá (Sanghez o.fl. 2017).

4.8 Western BIots

Próteinútdrættir (frumur/vefur) voru einsleitar í geislaónæmisútfellingarprófi (RIPA) lýsisbuffi (150 mM NaCl,1 prósent Nonidet P-40 [NP-40],0 ,5 prósent deoxýkólat,0,1 prósent SDS, 50 mM Tris, pH 8,0) með próteasahemlum (10 ug/ml AEBSF, 10 ug/ml leupeptin, 5 ug/ml pepstatín, 5 ug/ml chymotrypsin, 10g/ml aprótínín). Próteinútdrættirnir voru hljóðbeittir og síðan pelaðir með skilvindu við 13,000 snúninga á mínútu í 15 mínútur við 4C. BCA próteingreining var notuð til að mæla próteinstyrk. Sýni sem innihéldu jafnt magn af próteini 50 til 100 ug á hverri braut voru aðskilin með því að nota 4 til 12 prósent halla TGX forsteypt gel BioRad og síðan flutt með TransBlot Semi-Dry BioRad kerfi með því að nota Nitrocellulose flutningspakka. Fluttar blettir voru litaðir með Ponceau S litun fyrir jafna próteinhleðslu og síðan þvegin og lokuð með 5 prósent fitulausri þurrmjólk í TBST í 60 mínútur við stofuhita. Aðalmótefni voru ræktuð með hristingu yfir nótt við 4 gráður. Blettir voru rannsakaðir með tilliti til eftirfarandi mótefna: ATM (D2E2) Kanínu mAb frumumerki, við 1:1000 þynningu, -Actin (D6A8) Kanínu mAb frumuboð, GAPDH (D16H11) Kanínu mAb frumumerki fylgt eftir með viðeigandi piparrótarperoxídasa-konjugað HRP) secondary Anti-rabbit, Anti-mouse í 2 klukkustundir við stofuhita. Eftir marga þvotta með TBST var próteintjáning greind með Radiance Plus efnaljómunar hvarfefni með því að nota Azure c400 og BioRad ChemiDoc myndgreiningarkerfin. Densitometric greining á hraðbankanum var framkvæmd með því að nota ImageJ. Tilraunir voru gerðar með 2 tæknilegar og 2-3 líffræðilegar endurtekningar eins og tilgreint er.

4.9 Tölfræðilegt mat

Fjöldi dýra sem valinn var fyrir hvern hóp var byggður á fyrirfram aflgreiningum með því að nota GPower v3.1 byggða á stærðinni 0.5, krafti upp á 0.8 og áhrifastærðir áætlaðar út frá bráðabirgðagögnum eða fyrri nám. Við notuðum bæði parametric (1-og 2-way ANOVA) fyrir eðlilega dreifða og óparametric (Kruskal Wallace) tölfræðilegar aðferðir fyrir bilgögn til að prófa mismun á milli hópa, fylgt eftir með pörbundnum samanburðarprófum eins og fram kemur í Textinn. Útlínur fyrir ónæmisgögn í myndum. 6 og 7 voru útilokuð með ROUT-aðferðinni (Q=2 prósent). Sértæku greiningarnar sem notaðar eru fyrir hvert gagnasett eru tilgreindar í hverri myndsögu. Fyrir allar tölur: ns ekki marktækt,*p Minna en eða jafnt og 0.05,** p<0.01,***><0.001,****><0.0001. data="" are="" reported="" as="" mean="" ±="" sem="" and="" box="" and="" whisker="" plots="" indicate="" the="" minimum,="" first="" quartile,="" median,="" third="" quartile,="" and="" maximum="" data="" values.="" all="" figures="" and="" statistical="" analyses="" were="" completed="" using="" excel="" (microsoft="" 360)="" or="" prism="" v8="" and="" 9="">