Fimm amínósýrueyðing í NKCC2 af C57BL/6 músum hefur áhrif á greiningu á NKCC2 fosfórun en hefur ekki áhrif á nýrnastarfsemi
Feb 19, 2022
KYNNING
Þykkt hækkandi útlim (TAL) spendýrsinsnýruskiptir sköpum fyrir stjórn á rúmmáli utanfrumuvökva, þvagþéttni, kalsíum (Ca 2 plús ) og magnesíum (Mg 2 plús ) jafnvægi, sem og pH jafnvægi. 1 Aðal Na plús flutningsleiðin í TAL er Na plús - K plús - 2Cl − samflutningsefni (NKCC2), sem er sérstaklega hamlað af þvagræsilyfjum. 1 Samflutningur Na plús, K plús og 2Cl − jóna um NKCC2 er rafhlutlaus en fer eftir rafrænni K plús seytingu um apical nýruytri medulla K plús rás ROMK. 2 Samspil NKCC2 og ROMK skapar holrýmis-jákvæðan rafefnafræðilegan halla, sem eykur Na plús endurupptöku og knýr parafrumuflutning Ca 2 plús og Mg 2 plús. 3 Mikilvægi NKCC2 fyrir TAL ognýrnastarfsemiDæmi um er Bartter tegund I heilkenni, erfðasjúkdómur sem orsakast af stökkbreytingum á starfsemi NKCC2, sem kemur fram með alvarlegumnýrusalt- og vökvasóun, blóðkalímísk efnaskiptaalkalosun og ofkalsíumigur. 3
NKCC2 er meðlimur í uppleystu burðarfjölskyldunni 12 (Slc12) af himnuflutningspróteinum sem inniheldur einnig NKCC1 sem er alls staðar tjáð og fjarlægu, flækjupíplar (DCT) sértæka Na plús - Cl - samflutningsefni (NCC). 2 Virkni NKCC2 hefur jákvæða fylgni við fosfórun samflutningsefnisins á nokkrum serín- og þreónínleifum á umfrymis N-enda hala. 4 Amínósýruröðin sem umlykja þessa fosfórunarstað eru mjög varðveitt og sýna mikla líkindi meðal NKCC2, NKCC1 og NCC. 2 Fosfórun NKCC2 er örvuð með nokkrum hormóna- og hormónaleiðum. Hormón eins og arginín vasópressín (AVP) og angíótensín II (ANGII) örva NKCC2 með aukinni cAMP framleiðslu og virkjun próteinkínasa A (PKA). Talið er að 5 PKA fosfórerar NKCC2 beint við Ser126, sem eykur útfrumnafjölgun NKCC2 sem innihalda blöðrur og þar með gnægð flutningsefnisins í apical plasmahimnu. 6 Sömuleiðis stjórna breytingar á innanfrumu klóríðstyrk NKCC2 fosfórun. Lækkuð Cl − styrkur í sneiðfrumum örvar án lýsín(K) kínasa WNK1 og WNK4 til að fosfóra og virkja niðurstreymis kínasa Ste20- tengda prólín alanín ríkan kínasa (SPAK) eða oxunarálagssvarandi kínasa 1 (OXSR1) ). 7- 9 Eftir tengingu við „RFxV“ mótíf í NKCC2, fosfóra þessir kínasar síðan NKCC2 við tvær þreónínleifar (T96 og T101). 2 Affosfórun þessara leifa er miðlað af fosfatasanum calcineurin, sem leggur áherslu á að NKCC2 er skotmark fyrir nokkrar boðleiðir. 10
Til að rannsaka NKCC2 virkni, þróuðu nokkrir hópar, þar á meðal okkar, fosfóformsértæk mótefni gegn Thr96 og/eða Thr101. 11- 17 Mótefnin voru notuð til að meta NKCC2 fosfórun í misleitum tjáningarkerfum 7,11,17,18,19,20 og dýralíkönum þar á meðal rottum 10,21,22,23,24,25 og músum. 14,15,16,17,19,26,27 Hins vegar, þegar við notuðum pT96/101 NKCC2 mótefnið okkar, fengum við ósamkvæmar niðurstöður í mismunandi múslíkönum okkar. Þó að við fundum sterk pNKCC2 merki í nýrum frá músum í 129Sv erfðafræðilegum bakgrunni, fengum við ekki áreiðanleg pNKCC2 merki í nýrum frá C57BL/6 músum en sáum krosshvarfsemi pNKCC2 mótefnanna við pNCC. Aðrar rannsóknarstofur, þar á meðal þær frá JA McCormick og AA McDonough (persónuleg samskipti) gerðu svipaðar athuganir. 18,28,29 Ennfremur hefur sláandi stofnmunur verið lýst í músum fyrirnýruvirkni 30 þar á meðal marktækt minni Ca 2 plús útskilnað í þvagi í C57BL/6 samanborið við 129Sv músum. 31 Þess vegna settum við fram þá tilgátu að C57BL/6 mýs tjái erfðafræðilegt afbrigði af NKCC2 sem hefur áhrif á NKCC2 fosfórun og möguleganýrnastarfsemisem útskýrir þann stofnmun sem sést. Eftirfarandi rannsókn var hönnuð til að prófa þessa tilgátu kerfisbundið.
Leitarorð:jónajafnvægi, nýra, NKCC2, fosfórun, munur á stofni
NIÐURSTÖÐUR
2.1|C57BL/6 mýs hafa fimm amínósýrueyðingu í NKCC2 sem truflar greiningu á fosfórýleruðum NKCC2Í fyrsta lagi samræmdum við fyrir nokkrar tegundir birtu N-enda amínósýruraðirnar (umritunarkenni í töflu S1) NKCC2 og NCC (mynd 1A, B, í sömu röð) sem samsvara epitópunum sem þekkjast af and-pNCC og and-pNKCC mótefnum (Mynd 1C). Jöfnunin staðfesti mikla varðveislu fosfórunarstaða NKCC2 og NCC 7 sem líklega útskýrir krosshvarfsemi pNKCC2 og pNCC mótefnanna sem við höfum séð og aðrir. 18,28,29 Athyglisvert og í samræmi við tilgátu okkar sýndi jöfnunin einnig aftur óþökk fimm amínósýrueyðingu í röð NKCC2 úr C57BL/6 músum (ΔF97- T101) (Mynd 1A) . Raðgreining á DNA úr tveimur mismunandi C57BL/6 músabyggðum sem geymdar eru á Jackson Laboratory í Bandaríkjunum eða Janvier Labs í Frakklandi staðfesti núkleótíðeyðingu í exon 2 á C57BL/6 NKCC2 sem samsvarar ofangreindri eyðingu amínósýra (Mynd S1 , Tafla S2).
Til að lýsa áhrifum af eyðingu amínósýranna fimm á ónæmisgreiningu á heildar- og fosfórýleruðum NKCC2, rannsökuðum við kerfisbundið nýru C57BL/6 og 129Sv músa með ónæmisvefjafræði og ónæmisblettingu. Ónæmisflúrljómun með mótefni gegn heildar-NKCC2 sýndi sterkt flúrljómun í apical plasmahimnu TALs 129Sv og C57BL/6 músa. Hins vegar sýndi áður þróað pT96/T101 NKCC2 mótefni okkar sterka apical merkingu TALs aðeins í 129Sv músum, en TALs af C57BL/6 músum voru með mjög veika ónæmislitun (Mynd 1D). Í samræmi við þetta leiddi Western blot greining í ljós sterkt band fyrir heildar NKCC2 í báðum músastofnum, en pT96/T101 NKCC2 mótefnið fann sterkt band við vænta stærð (170 kDa) aðeins í 129Sv músum (Mynd 1E). Í staðinn sýndu nýru C57BL/6 músa band við 130 kDa sem samsvarar væntanlegri stærð NCC (Mynd 1E). Svipaðar niðurstöður fengust með öðrum mótefnum sem áður voru notuð til að rannsaka NKCC2 fosfórun (Mynd S2). pT212/T217 NKCC1 R5 mótefnið 11 sýndi, auk pNCC merkisins, dauft merki við væntanleg stærð fyrir pNKCC2 (Mynd S2). Ónæmisvirka bandið fyrir pNKCC2 varð ákafari þegar það var nýttnýrulýsöt voru notuð. Notkun lýsispúða með þvottaefnum (RIPA biðminni) batnaði ekki heldur minnkaði merkistyrkinn (Mynd S3).
MYND 1 pT96/T101 NKCC2 mótefnið greinir ekki sýnilegt pNKCC2 merki í C57BL/6 músum. A, NKCC2 amínósýruröð röðun mismunandi tegunda og músastofnanna tveggja 129Sv og C57BL/6. NKCC2 röð auðkenni fyrir mismunandi tegundir eru skráð í töflu S1. Mjög varðveitt svæði sem samsvarar mús Thr96 til mús Thr101 er merkt með gráu. B, Amínósýruröðun NCC í mismunandi tegundum. NCC röð auðkenni fyrir mismunandi tegundir eru skráð í töflu S1. C, Listi yfir einkenni algengra og útgefinna mótefna sem þekkja pT53 eða pT58NCC, sem og pNKCC2 á varðveittum stað í kringum Thr96 til Thr101. D, ónæmislitun á heildar og pT96/T101 NKCC2 í samfelldum frystihlutum af músum með 129Sv og C57BL/6 bakgrunn. Skalastrik=50 µm. E, Immunoblot af heildar og pT96/T101 NKCC2 af músum með 129Sv og C57BL/6 bakgrunn. Gildin eru meðalgildi ± SEM, n=5 mýs í hverjum hóp, grænu örvarnar benda á tilteknu böndin á meðan rauðu örvahausarnir benda á ósértæku böndin. Mólþyngdarmerki eru innifalin. Gert er ráð fyrir samtals og pT96/T101 NKCC2 böndum við 170 kDa. F, Immunoblots fyrir heildar og pT96/T101 NKCC2, samtals og pT53 og pT58 NCC í NCC WT og NCC knockout (KO) músum af mismunandi bakgrunni. Grænu örvarnar benda á tilteknu böndin á meðan rauðu örvarnar benda á ósértæku böndin. Mólþyngdarmerki eru innifalin. Gert er ráð fyrir heildar og pT58 og pT53 NCC böndum við 130 kDa, heildar og pT96/T101 NKCC2 bönd eru væntanleg 170 kDa
Til að prófa hvort pT96/T101 NKCC2 mótefnið okkar raunverulega krosshvarf við fosfórýlerað NCC í C57BL/6 músum, könnuðum viðnýrulýsöt úr 129Sv og C57BL/6 villigerðum músum og C57BL/6 NCC útsláttarmúsum með mótefnum gegn heildar NKCC2, pT96/T101 NKCC2, heildar NCC og fosfórýleruðum NCC (pT53 og pT58 NCC) (Mynd 1F). pT96/T101 NKCC2 mótefnið og mótefni gegn heildar NCC og pNCC greindu ekki bönd við 130- 170 kDa í C57BL/6 NCC útsláttarmúsunum (Mynd 1F). Athyglisvert er að ónæmisblóðin sem og viðbótar ónæmisvefjaefnafræðilegar tilraunir (Mynd S4) benda til þess að pNKCC2 mótefnin víxlist ekki aðeins við NCC í C57BL/6 músum heldur víxlist pNCC mótefnin okkar (pT53 NCC og pT58 NCC) við NKCC2 í 129Sv mýs í þeim styrk sem notuð er.
Útskilnaður kalsíums og magnesíums í þvagi er mismunandi á milli 129Sv og C57BL/6 músa
Til að ákvarða hvort brottfall (F97- T101) í NKCC2 gæti tengst lífeðlisfræðilegum mun á 129Sv og C57BL/6 músum, bárum við saman vatnsneyslu, plasmajónastyrk og útskilnað úr þvagvökva og jónum milli músastofnanna tveggja. Eins og dregið er saman í töflu 1 voru flestar breytur sem metnar voru ekki mismunandi milli stofnanna. Hins vegar sýndu C57BL/6 mýs lægri Ca 2 plús í þvagi og meiri Mg 2 plús útskilnað í þvagi en 129Sv mýs. Plasma Ca 2 plús og Mg 2 plús gildi voru svipuð fyrir báða hópa, sem bendir til þess að mýsnar hafi verið í stöðugu ástandi þar sem jafnvægi jafnvægis á endurupptöku í þörmum, vefjahreyfingu (td úr beinum) ognýruÚtskilnaður Ca 2 plús og Mg 2 plús jóna náðist. Til að kanna hvort mismunandi útskilnaðarhraði Ca 2 plús og Mg 2 plús stafar af mismun á upptöku þessara jóna í þörmum, bárum við saman daglega fæðuinntöku, saurframleiðslu og saur Ca 2 plús og Mg 2 plús útskilnað fyrir þessar tvær músastofnar. Eins og sést á mynd S5, var fæðuinntaka og saur Ca 2 plús útgangur svipaður, en daglegur saur Mg 2 plús útskilnaður var minni í C57BL/6 músum en 129Sv músum sem bendir til þess að C57BL/6 mýs hafi hærra Mg 2 plús endurupptöku í þörmum en 129Sv mýs. Í samræmi við þessa forsendu höfðu C57BL/6 mýs sterkari ristiltjáningu á magnesíumrásinni TRPM6 (Mynd S6), sem og tilhneigingu til hærra Mg 2 plús magns í plasma samanborið við 129Sv mýs, þó munurinn hafi ekki náð tölfræðilegri marktekt. Til að meta hugsanlegt framlag beinsins, greindum við með ör-CT beinþéttni í báðum stofnum. Svipað og fyrri skýrslur höfðu 32 C57BL/6 mýs frekar lágan beinþéttni (Mynd S7), sem gæti útskýrt hvers vegna þessar mýs hafa tilhneigingu til að varðveita Ca 2 plús jónir með minninýruCa 2 plús útskilnaður. Í samræmi við aukið pípulaga Ca 2 plús endurupptökuhraða, nýru C57BL/6 músa
tjáði meira TRPV5 Ca 2 plús rás við próteingildi en nýru 129Sv músa (Mynd 2). C57BL/6 mýs höfðu einnig marktækt meiri NCC mRNA og prótein tjáningu en 129Sv mýs (Mynd 2A). Sömuleiðis var próteinmagn alls NKCC2, heildar og fosfórýleraðs NCC og alls - ENaC hærri í C57BL/6 en í 129Sv músum (Mynd 2B,C). Magn próteinkljúfra og þar af leiðandi virku formanna - og - ENaC var ekki ólíkt sem bendir til þess aðnýruENaC virkni var svipuð fyrir báða stofnana (Mynd 2B, C).
Engar vísbendingar um breytta starfsemi þykkrar útlima í C57BL/6 músum samanborið við 129Sv mús
Hærri gnægð heildar NKCC2, heildar NCC og fosfórýleraðs NCC í nýrum C57BL/6 músa getur verið uppbótasvörun fyrir minni NKCC2 fosfórun. Til að prófa hvort virkni NKCC2 og NCC sé mismunandi milli músastofna, gerðum við búmetaníð- og tíazíð-próf í sömu röð. Ein inndæling með búmetaníði eða hýdróklórtíazíði olli sterkri natriuresis sem var meira áberandi fyrir búmetaníð en hýdróklórtíazíð. Hins vegar voru þvagræsilyfssvörunin algjörlega svipuð í báðum stofnum sem bendir til þess að virkni NKCC2 og NCC hafi ekki verið ólík C57BL/6 og 129Sv músum (mynd 3A-D). Svo virðist sem próteinmagn og fosfórunarmagn passa ekki endilega við starfræna starfseminýrujónaflutningsprótein eins og Hunter og félagar hafa einnig bent á nýlega. 33 Til að meta TAL virkni frekar, gerðum við vatnsskerðingarpróf þar sem mýs höfðu í 24 klst aðgang að blautum mat, en ekki að kranavatni. Við þessar aðstæður hækkuðu báðir músastofnarnir osmólar í þvagi upp í svipað gildi (tafla 1). Ennfremur sýndu C57BL/6 mýs og 129Sv mýs sama þvagútskilnað uromodulin (Tamm- Horsfall prótein) (tafla 1), sem er framleitt og skilst út í þvagið eftir virkni TAL frumanna. 3
Krossræktun 129Sv og C57BL/6 músa bendir til þess að fimm amínósýrueyðingin í NKCC2 aðgreini ekki tiltekna svipgerð
Framlögð gögn benda til þess að stofnmunur á útskilnaði jóna í þvagi ognýruMagn próteina tengist ekki fimm amínósýrueyðingu í C57BL/6 NKCC2, heldur tengist öðrum erfðafræðilegum mun á músastofnunum tveimur. Til að prófa þetta frekar, blönduðum við 129Sv og C57BL/6 músum til F2 kynslóðarinnar þar sem erfðastofnamunur (þar á meðal í NKCC2) ætti að vera af handahófi
dreift til músanna. Við bárum síðan saman F2 mýs sem voru annað hvort arfhreinar fyrir NKCC2 í fullri lengd (f/f), arfhreinar fyrir NKCC2 eyðingu (Δ/Δ), eða arfblendnar fyrir NKCC2 eyðingu (f/Δ). Að undanskildum væntanlegu mismunandi bindismynstri fosfóformsértæku mótefna gegn NKCC2 og NCC (og óljósum mun á ROMK tjáningu á mRNA, en ekki próteinstigi), var enginn af áður greindum muninum á stofnunum tveimur augljós í f/f, Δ/Δ, eða f/Δ mýsnar af F2 kynslóðinni (Mynd 4 og Tafla 2). Sérstaklega var enginn munur á útskilnaði Ca 2 plús eða Mg 2 plús í þvagi, sem og enginn munur á plasmaþéttni Ca 2 plús eða Mg 2 plús, sem bendir til þess að stofnmunur á 129Sv og C57BL/6 músum sé óháður fimm amínósýrueyðingin í NKCC2.
Nýtt pT96 NKCC2 mótefni greinir pNKCC2 í báðum stofnum
Þar sem eyðing fimm amínósýra í NKCC2 hindrar áreiðanlega greiningu á NKCC2 fosfórýleringu í C57BL/6 músum þegar tiltæk mótefni voru notuð, mynduðum við nýtt mótefni sem beinist gegn T96 fosfóstaðnum í C57BL/6 músum. Kanínur voru bólusettar með fosfópeptíð sem samsvaraði amínósýruröð C57BL/6 NKCC2 umhverfis T96 (YYLQ(p)TMDA). Mótserman voru sæknihreinsuð og einkennd af ónæmisblettingu og ónæmisvefjaefnafræði (Mynd 5). Mótefnið greindi eitt band af væntanlegum stærð 170 kDa í nýrum af 129Sv, C57BL/6 villigerð og C57BL/6 NCC útsnúningi
mýs (Mynd 5A). Hljómsveitin var greinilega frábrugðin þeirri sem greindist fyrir NCC við 130 kDa. Affosfórun á 129Svnýrusýni með alkalískum fosfatasa í þörmum (CIAP) útrýmdu algjörlega merkinu sem fékkst með nýja pT96 NKCC2 mótefninu, en merkið með ófosfóformsértæka NKCC2 mótefninu var sýnilegt í viðmiðunarsýnum og affosfórýleruðum sýnum (Mynd 5B). Athyglisvert var að NKCC2 fosfórun var einnig að mestu eytt þegarnýrulysöt voru ræktuð við 37 gráður í 1 klukkustund án CIAP (líklega vegna virkni innræns basísks fosfatasa frá nærpíplum). Affosfórunartilraunir með því að nota lambda fosfatasa á samfelldum paraffín-nýra hluta af C57BL/6 músum staðfestu enn frekar að nýja mótefnið þekkir aðeins fosfórýlerað NKCC2 (mynd 5C). Þar að auki sýndi ónæmisflúrljómun á samfelldum frostskurðum að ný mótefnið litar aðeins apical plasmahimnu NKCC2- jákvæðra TALs en ekki NCC-jákvæðra DCTs í 129Sv og C57BL/6 músum (mynd 5D), sem bendir til þess að nýja pNKCC2 mótefni krosshvarfa ekki við pNCC. Þessi niðurstaða var einnig staðfest með því að nota frumulýsi úr MDCKI frumum sem tjá NKCC2 úr mönnum (hNKCC2) og manna NCC (hNCC). Ónæmisskot af ónæmisútfellingum (IP) og heilfrumulýsum sýndu að hið nýja pT96 NKCC2 mótefni þekkir manna NKCC2 en ekki manna NCC (Mynd S8A). Athyglisvert er að þrátt fyrir að nýja mótefnið hafi verið alið upp gegn pNKCC2 af C57BL/6 músum, greindi nýja mótefnið NKCC2 fosfórýleringu jafnt í nýrum beggja músastofna með bæði ónæmisvefjaefnafræði (Mynd 6A) og ónæmisblotting (Mynd 6B).
Hið nýja pT96 NKCC2 mótefni gerir greiningu á stýrðri NKCC2 fosfórun
Fosfórun og þar með virkni NKCC2 og NCC er stjórnað af utanfrumujónastyrk. Lágt [Cl-] ex eykur fosfórun NKCC2 við Thr96 og Thr101 og NCC við Thr53 og Thr58 með virkjun WNK/SPAK/OSR1 ferilsins. 7,8,18,29,35 Sömuleiðis dregur hátt [K plús] hratt úr fosfórun NCC, en talið er að það hafi lítil sem engin áhrif á NKCC2 fosfórun. 12,36,37,38 Til að prófa hvort nýþróaða pT96 NKCC2 mótefnið geti greint þessa tegund mismunastjórnunar NKCC2 fosfórunar,nýrusneiðar af C57BL/6 músum voru útsettar ex vivo fyrir annað hvort 110 eða 5 mM [Cl - ] ex og 3 eða 10 mM [K plús] ex í sömu röð. Eins og búist var við, jók lágt [Cl-] ex mjög NCC og NKCC2 fosfórun (Mynd 7A, B), á meðan háa [K plús] ex minnkaði aðeins NCC fosfórun en breytti ekki NKCC2 fosfórun (Mynd 7C, D). Sömuleiðis greindist nýja mótefnið jafn vel breytt
MYND 4 Engar marktækar breytingar á mRNA og próteintjáningu meiriháttarnýrujónaflutningsmenn og rásir í blönduðu F2 kynslóðinni. A, Bar plot af hlutfallslegu mRNA tjáningarstigi í þremur hópum músa. Öll gildi voru staðlað til f/f músa. Gildi eru meðaltal ± SEM. B, Próteingnægð í músumnýrulýsöt úr dýrum af F2 kynslóðinni. Hóparnir þrír samsvara NKCC2 í fullri lengd (f/f), NKCC2 sem er arfhreinn fyrir eyðingu (Δ/Δ) eða NKCC2 sem er arfblendinn fyrir eyðingu (f/Δ/). Mólþyngdarmerki eru innifalin. Búist er við NKCC2 og pNKCC2 við 170 kDa, NCC og pNCC við 130 kDa, TRPM6 við 260 kDa, - ENaC við 95 kDa og 34 kDa (klofin), - ENaC við 100 kDa, - ENaC við 100 kDa og (cleved ) , ROMK við 55 kDa (þroskað glýkósýlerað), 43 kDa (kjarna glýkósýlerað) og 34 kDa (óblýkósýlerað). Grænar örvar vísa á tilteknu böndin á meðan rauðu örvahausarnir benda á ósértæku böndin. C, Densitometric greining á magni próteina með samanburði á f/f og Δ/Δ músum. Hljómsveitarstyrkur frá Δ/Δ músum er staðlaður í þá frá f/f. (Gildin eru meðaltal ± SEM; n=5 mýs/hópur; *P <.05, †="" p=""><.01, ‡="" p=""><>
NKCC2 fosfórun sem var framkölluð í MDCKI frumum sem tjáðu NKCC2 úr mönnum (hNKCC2) eða mús NKCC2 (mNKCC2 (C57BL / 6)) með lágt utanfrumuklóríðskilyrðum (Mynd S8B). Ínýrusneiðar ræktaðar við 5 mM [Cl − ] ex, einnig áður lýst mótefni gegn músum pT96/T101 NKCC2 39 og and-manna pT212/T217 NKCC1 R5 11 mótefni greina dauf merki fyrir NKCC2 og NCC, sem verða augljósari þegar fleiri prótein eru hlaðin og ónæmisblettur eru teknar í mynd við auknar stillingar (Mynd S9).
UMRÆÐA
C57BL/6 og 129Sv mýs eru tveir af algengustu músastofnunum til líflæknisfræðilegra rannsókna. Erfðamengi C57BL/6 músa var það fyrsta sem var raðgreint fyrir músina 40 og hefur síðan þjónað sem viðmiðunarerfðamengi fyrir greiningu á erfða- og svipgerða breytileika milli músastofna. 41- 44 Fyrirnýrurannsóknir, einn mikilvægur munur á C57BL/6 og 129Sv músum varðar tjáningu renín gensins. Eins og menn, C57BL/6 mýs hafa aðeins eitt renín gen, en 129Sv mýsnar eiga tvö eintök, sem gæti skýrt meira næmi þessa músastofns fyrir háþrýstingi 45,46 og háþrýstingsskaða. 47 Með þessari rannsókn bætum við öðrum mikilvægum erfðafræðilegum mun sem þarf að hafa í huga. Við lýsum hingað til ómetanlegri fimm amínósýrueyðingu í NKCC2 (ΔF97- T101), sem er til staðar í C57BL/6 en ekki í 129Sv músum, sem truflar greiningu NKCC2 fosfórunar með flestum áður fáanlegum mótefnum, en hefur ekki marktækt áhrifnýrnastarfsemi.
Mús NKCC2 N-enda fosfórunarstaðirnir T96 og T101 eru mjög varðveittir á milli tegunda og á milli NKCC2, NKCC1 og NCC (Mynd 1). 48 Þess vegna kemur það ekki á óvart að mótefni sem beint er gegn þessum fosfórunarstöðum krosshvarfa við hin samflutningsefnin. Fyrri rannsóknir hafa greint frá því að mótefni gegn fosfórýleruðu NCC greini einnig fosfórýlerað NKCC2 7,18,28,29 og að pNKCC1 mótefni leyfir greiningu á fosfórýlerunarstigum bæði NKCC1 og NKCC2. 11 Í samræmi við þetta sáum við krosshvarf pNCC (pT53 og pT58) mótefna okkar með fosfórýleruðu NKCC2 og pT96/pT101 NKCC2 mótefna okkar með fosfórýleruðu NCC. Hins vegar sást krossviðbrögð pNCC mótefnanna við NKCC2 aðeins í nýrum 129Sv músa, en ekki í nýrum C57BL/6 músa. Á hinn bóginn sýndi áður þróað mótefni okkar gegn NKCC2 pT96/pT101 engin eða í besta falli mjög veik merki fyrir pNKCC2 í nýrum C57BL/6 músa og greindi aðallega fosfórýlerað NCC í þessum stofni. Nú tengjum við þessar ruglingslegu athuganir við fimm amínósýrueyðingu í NKCC2 af C57BL6 músum (ΔF97- T101). Reglugerð um NKCC2 fosfórun hefur verið rannsakað-
notað í ýmsum tilraunaaðstæðum og fyrir ýmis áreiti þar á meðal vasópressín, 14,21,24,25,49 uromodulin 19,20,50 og calcineurin hemlar. 10,26 Þó að flestar rannsóknirnar hafi verið gerðar á ólíkum tjáningarkerfum 10,19,20,25,50 eða á rottum 10,24 og músum 19,26 sem tjáðu NKCC2 í fullri lengd, voru sumar rannsóknir einnig gerðar á C57BL/6 músum. 7,18,27,28,29,51 Eins og við greinum frá hér, tjá C57BL/6 mýs NKCC2 afbrigði með fimm amínósýrueyðingu sem truflar rétta greiningu NKCC2 fosfórunar og sem ber hættu á að staðall pT96/T101 NKCC2 mótefni og R5 and fosfó-NKCC1 mótefni krosshvarfa við fosfórýlerað NCC að minnsta kosti við þær aðstæður sem notuð eru í vinnu okkar. Ekki er hægt að dæma áhrif þessarar krossviðbragða á fyrri niðurstöður tilrauna, en samkvæmt athugunum okkar ætti að endurskoða gögn frá C57BL/6 músum og túlka með varúð. Þrátt fyrir þá staðreynd að brottfelling amínósýranna fimm hafði mikil áhrif á greiningu NKCC2 fosfórunar, höfum við engar vísbendingar um að brottfallið hafi marktæk áhrif á virkni samflutningsefnisins. C57BL/6 mýs höfðu í raun meiri Mg 2 plús útskilnað í þvagi og lægri Ca 2 plús útskilnaður í þvagi 31 en 129Sv mýs, en við komumst að því að þessi munur tengist líklega ekki breyttum parafrumuflutningi þessara katjóna meðfram TAL, en er afleiðing af aukinni TRPM6- háð Mg 2 plús upptöku í þörmum og aukinni TRPV5- háð Ca 2 plús endurupptöku í DCT2 og CNT. Hið síðarnefnda veldur jákvæðu Ca 2 plús jafnvægi sem getur hjálpað til við að auka lágan beinþéttni C57BL/6 músa. Niðurstaðan að C57BL/6 og 129Sv mýs sýna það samanýrusvörun við lykkju- og tíazíðþvagræsilyfjum og takmörkun á vatni bendir ennfremur til þess að fimm amínósýrueyðing í NKCC2 skerði ekki marktækt TAL-virkni. Mikilvægast er að mýs af F2 kynslóð krossræktaðra C57BL/6 og 129Sv músa hafa það samanýrusvipgerð óháð því hvort mýs tjái fulla lengd (f/f) NKCC2 eða NKCC2
arfhreinn (Δ/Δ) fyrir eyðinguna. Þessar athuganir á músum eru í samræmi við fyrri virknigögn frá ólíkum tjáningarkerfum. Þó stökkbreytingar á stökum leifum í NKCC1 (T217 í mönnum, T211 í mús) eða NCC (T60 í mönnum, T58 í músum) afnema virkni þessara samflutningsflutninga, þá eru stökkbreytingar á samsvarandi leifum í NKCC2 (T105 í mönnum, T101 í músum) ) hafa frekar lítil eða jafnvel engin áhrif á grunnlínu og örva NKCC2 virkni. 35,52,53 Jafnvel þegar báðar þreónínleifarnar í NKCC2 eru stökkbreyttar í alanín, nær virknivirkni NKCC2 enn ~70 prósent af hámarksvirkni, 35 sem bendir til þess að fosfórun þessara staða sé leiðbeinandi en ekki nauðsynleg fyrir NKCC2 virkni.
Fosfórunarstaðir eru oft einsleitir á milli próteina. Þar af leiðandi er vandamálið við krosshvarf fosfóformsértækra mótefna ekki einstakt fyrir mótefni sem beint er gegn fosfórýleruðum NCC, NKCC2 og NKCC1, heldur var einnig greint frá öðrum próteinum eins og sýklínháðu kínasa 1 og 2 54 og utanfrumu. merkjastýrðir kínasar 1 og 2. 55 Alltaf þegar fosfórýleringarástandssértæk mótefni eru notuð, þarf strangt eftirlit með tilraunum til að staðfesta sérhæfni merkjanna sem greindust. Þetta getur falið í sér (a) staðfestingu á því að notað mótefnið greini próteinið við væntanlega mólmassa (ónæmisblettingu) og/eða við væntanlega frumu- og undirfrumustaðsetningu (ónæmisflúrljómun), (b) sannprófun á því að mótefnið hafi sérstakt samskipti við fosfórýleraða epitope með með því að nota samkeppnisgreiningar með fosfórýleruðu og ófosfórýleruðu peptíðunum og (c) sýna fram á að
mótefnið er fosfóformsértækt með því að bera saman fosfórýleruð og affosfórýleruð vefjasýni. Þessar viðmiðanir gætu verið uppfylltar með erfðafræðilegum viðmiðum sem fela í sér prófun á vefjum úr útsláttardýrum og/eða frumum sem tjá ólíkt próteinið sem vekur áhuga. Í þessari rannsókn notuðum við ofangreindar aðferðir til að lýsa rækilega nýtt pT96 NKCC2 mótefni sem greinir fosfórýlerað NKCC2 ínýrusýni úr C57BL/6 og 129Sv músum jafn vel. Mótefnið er fosfóformsértækt og sýnir enga sýnilega krosshvarf við fosfórýlerað NCC við nein af prófuðu skilyrðunum. Með því að nota þetta mótefni staðfestum við að lítill utanfrumuklóríðstyrkur eykur fosfórýleringu NKCC2 á þessum stað, 7,8 á meðan breytt utanfrumuþéttni kalíums hefur ekki marktækt stjórnunarhlutverk. 24 Að lokum leiðir starf okkar í ljós mikilvægan stofnmun á amínósýruröð NKCC2 músa sem hefur áhrif á uppgötvun og þar af leiðandi greiningu á NKCC2 fosfórun og stjórnun. Nýþróað pT96 NKCC2 mótefni sniðgangar þennan tæknilega fyrirvara og gerir áreiðanlega greiningu á breyttri NKCC2 fosfórun óháð erfðafræðilegum bakgrunni múslíkana. Þar að auki leggur rannsókn okkar aftur áherslu á að munur á erfðafræðilegum bakgrunni verður að hafa í huga þegar múslíkön eru greind.
EFNI OG AÐFERÐIR
Dýr,Karlkyns aldurssamsvörun (6- 8 vikur) mýs voru annaðhvort af innræktuðum stofnum 129S6/SvEvTac, C57BL/6J, hér með vísað til sem 129Sv og C57BL/6, eða blönduðum blendingsstofni 129S/B6 í F2 kynslóð. Allar dýratilraunir voru gerðar samkvæmt svissneskum lögum um velferð dýra og samþykktar af dýralæknayfirvöldum Zürich-kantónunnar í Sviss (Leyfi: 141/2014, 185/2017 og 135/2018). Mýs voru arfgerðargreindar til að eyða 15 basum með því að nota staðlaða PCR með primerum sem gefnir eru upp í töflu S3. Í fullri lengd (f/f) NKCC2 hefur væntanlega PCR afurð upp á 87 bp á meðan eytt er NKCC2 röð (Δ/Δ) er búist við 70 bp.
VefjavinnslaMýs voru svæfðar með blöndu af ísóflúrani (2 prósent - 4 prósent, 0,5 l/mín; Provet; CH) og Temgesic (Buprenorphine; 0.05- 0. 4 mg/kg líkamsþyngdar; Indivor; CH). Til lífefnafræðilegrar greiningar voru mýs svæfðar og þær geymdar í gegnum vinstri slegil hjartans með fosfatjafnaðar saltvatni (PBS). Nýru og fjarlægir ristlir voru teknir, snöggfrystir í fljótandi köfnunarefni og geymdir í -80 gráðum þar til frekari vinnsla. Fyrir ónæmisvefjaefnafræði voru nýrun fest með því að nota paraformaldehýð (PFA) 3 prósent í 0.1 M fosfatbuffi (pH 7,4, 300 mOsm) með bakflæðisflæði djúpsdeyfðu músarinnar í gegnum ósæð í kviðarholi fylgt eftir með stuttri skolun með 0,1 M fosfatbuffi (0,2 M NaH 2 PO 4 x H 2 O, 0,2 M NaH 2 PO 4 x 2H 2 O, 0,1 M CaCl 2 ). Í kjölfarið voru nýru fjarlægð, skorin í bita og fryst í fljótandi própani og geymd við -80 gráður.
Rannsóknir á efnaskiptum búraEftir aðlögun að efnaskiptabúrum (Techniplast) voru músum geymdar í efnaskiptabúrum í fjóra daga samfleytt með ókeypis aðgangi að kranavatni og venjulegu rannsóknarmati (Ssniff, Spezialdiäten GmbH). Líkamsþyngd, fæðu- og vatnsneysla var skráð daglega og 24 klst. þvagi og saur safnað.
Siðareglur um takmörkun vatnsMúsum var haldið í 24 klukkustundir í efnaskiptabúrum (Techniplast) án aðgangs að kranavatni. Hefðbundið rannsóknarkæfuduft (Ssniff, Spezialdiäten GmbH) var blandað saman við vatn 1:1, 24 klst. þvagi og saur var safnað og greind. Eftir 24 klukkustundir voru mýsnar settar aftur í venjuleg búr (T 2L (IVC), LASC, UZH).
Lífefnafræðilegar mælingarÞvagþéttni Na plús , K plús , Ca 2 plús var greindur með logaljósmælingu (EFOX 5053, Eppendorf). Þvag- og plasmaþéttni Mg 2 plús var mæld á Zürich Center for Integrative Nagdýralífeðlisfræði með SYNCHRON LX ® kerfi(um), UniCel ® DxC 800 Synchron ® klínískt kerfi og Synchron ® System Multi Calibrator. Kreatínín í þvagi var mælt með Jaffe aðferð. Blóðgas og jónastyrkur var mældur í heparínuðu heilblóði með því að nota ABL825Flex Blood Gas Analyzer (Radiometer) strax eftir blóðsöfnun frá holæð. Magn aldósteróns í plasma og þvagþéttni uromodulin (UMOD) voru mæld með ELISA settum sem eru fáanlegir í verslun (Aldosterone ELISA setti frá Cayman; #501090 og Mouse Uromodulin ELISA setti frá Abcam; ab245726 í sömu röð).
Rauntíma magn pólýmerasa keðjuverkun (RT-qPCR)
RNA var einangrað úr nýrum og fjarlægum ristli með því að nota SV heildar RNA einangrunarbúnaðinn (PROMEGA). Jafn styrkur af einangruðu RNA (250 ng í 129Sv á móti C57BL/6 eða 500 ng í f/f, Δ/Δ og f/Δ) var öfugt umritað í cDNA með GoScript™ bakritasettinu (PROMEGA). Mynduðu cDNA voru þynnt frekar með DNAse/RNAse-fríu vatni (1:5). Grunnur var hannaður fyrir magngreiningu á heildar Slc12a1, Slc12a3, Trpm6, Trpv5, Scnn1a, Scnn1b, Scnn1g og Kcnj1 (tafla S3). Megindleg PCR greining var framkvæmd með því að nota LightCycler ® 480 (Roche) til að mæla tjáningarstig gena sem vekur áhuga. Hlutfallsleg genatjáning var reiknuð út með því að nota delta Ct aðferðina með því að nota -aktín sem viðmiðunargen.
Western blot greiningNýrun voru gerð einsleit í þvottaefnislausu lýsisbuffi (DFLB) sem innihélt mannitól 200 mM, HEPES [4- (2- hýdroxýletýl)- 1píperasínetansúlfónsýru sýrur] 80 mM, kalíumhýdroxíð 41 mM, próteasahemlar (Complete Ultra, Roche) og fosfatasahemlar (PhosSTOP, Roche) með því að nota 32 Magna Lyser Green Beads (Roche) í Precellys 24 vefjajafnhæfara (Bertin Instruments, Montigny-le- Bretonneux). Perlur voru settar niður með skilvindu í 10 mínútur (1987 rcf) og prótein sem innihélt flotið var geymt í einnota skammtum við -80 gráður. Fyrir Western blot voru 50 µg af próteini eðlislægð í Laemmli Buffer, aðskilin með SDS-PAGE með því að nota 8 prósent - 12 prósent gel og síðan flutt yfir í nítrósellulósahimnur. Ósérhæfðir bindistaðir voru lokaðir með því að nota 1x Odyssey blokkunarlausn (Li-COR Biosciences) áður en himnur voru ræktaðar með frummótefnum (tafla S4) þynnt í 0,2x Odyssey blokkunarlausn við 4 gráður í 12 klukkustundir. Eftir þvott í PBS- 0.1 prósent Tween, voru himnurnar ræktaðar með aukamótefnum (geita-anti-kanínu IRDye 800 eða geita-and-mús IR litarefni 680, 1:10'000, LI - COR Biosciences) þynnt í 0,1x Casein Blocking buffer (Sigma). Uppgötvuð bönd voru sýnd með Odyssey innrauða myndgreiningarkerfinu (Li-COR Biosciences). Til að tryggja jafna próteinhleðslu voru himnur annað hvort samlitaðar með mótefni gegn - aktíni eða heildarprótein var litað með REVERT Total Protein Stain (Li-COR Biosciences) áður en mótefnagreining var gerð. Ónæmisvirkar bönd voru magngreind í Fiji (ImageJ) og staðlað gegn - aktínmerki eða REVERT Total próteinlitun í sömu röð.
ÓnæmisvefjaefnafræðiCryostat hlutar (þykkt 4 µm) voru lokaðir fyrir ósértæka mótefnabindingu með 10 prósent venjulegu geitasermi og síðan ræktaðir með frummótefnum (tafla S4)
yfir nótt við 4 gráður. Eftir þvott með 1X PBS voru skyggnur ræktaðar með aukamótefnum (Cy3 – samtengd geit-anti-kanínu IgG, vörunúmer 111- 165- 144, 1:1000 og FITC – samtengd geit-anti-mús IgG , vörunúmer 115- 095- 068, 1:100 í sömu röð, bæði frá Jackson Immuno Research Laboratories) í 2 klukkustundir við stofuhita. Öll mótefni voru þynnt í 1 prósent BSA/1xPBS. Frumukjarnar voru litaðir með DAPI (4',6- Diamidino- 2- fentýlindóli, Sigma-Aldrich, Co.) í styrkleikanum 0,1 µg/ml. Myndataka var gerð með Leica DM6000 B flúrljómunarsmásjá (Leica Microsystems, 35578) með Leica DFC350 FX flúrljómandi einlita stafræna myndavél (Leica Microsystems, 35578). Myndir voru unnar á Fiji (ImageJ).
Myndun sæknihreinsaðs kanínu- and-músa pT96 NKCC2 mótefnisMótefnaframleiðsla var framkvæmd af Pineda mótefnaþjónustu (Berlín, Þýskalandi). Kanínur voru bólusettar með fosfópeptíð sem samanstendur af amínósýrunum 105- 114 af C57BL/6 mús NKCC2 röðinni (NH2- YYLQ(p) TMDAV-COOH). Einsérhæfð IgG brot var sæknihreinsað gegn fosfópeptíðinu og síðan forsogað með affosfópeptíðinu sem leiddi til fosfóformssértæks mótefnabrots. Mótefnasérhæfni þessa hluta var prófuð með ónæmisvefjaefnafræði og Western blot greiningu (mynd 5 og mynd S4).
FosfatasameðferðPróteinlýsöt voru ræktuð í 1 klukkustund við 37 gráður með basískum fosfatasa í þörmum (CIAP) (1 U/1 µg prótein) til að framkalla vatnsrof á 5'-fosfathópum fosfórýleraðra próteina, sem hindraði sértæka bindingu pT96 NKCC2 mótefni gegn próteinum á Western blot himnu nítrósellulósa (Mynd 5B). Notuð voru geymd paraffíninnfelld nýru frá C57BL6 músum. Meðferð á köflum með því að nota alkalískan fosfatasa í þörmum kálfa (Sigma Aldrich) var framkvæmd eins og áður hefur verið lýst með smávægilegum breytingum. 56 Eftir lokun óbundinna aldehýðhópa voru hlutar skolaðir fimm sinnum í basískum fosfatasa jafnalausn (100 mm Tris, 50 µm CaCl 2, 0,1 mm MgCl 2, 8,4 µm leupeptin, 4 mm Pefablock, pH 9,0). Síðar voru hlutarnir ræktaðir í basískum fosfatasa jafnalausn með eða án basísks fosfatasa í þörmum (~130 einingar/ml) í hitakassa við 35 gráður í 2 klukkustundir. Ónæmisvefjaefnafræði og ljóssmásjárgreiningar voru síðan framkvæmdar eins og lýst er ítarlega. 57
AmínósýruröðunAmínósýruraðir mismunandi tegundir og músastofna voru fengnar úr opna gagnagrunninum „Ensembl Genome Browser“ (www.ensem bl.org, Sanger Institute). 42 Heimildir afritaauðkennanna eru skráðar í töflu S1. Röðin voru samræmd með því að nota Qiagen © CLC Main Workbench 20.
NýrnasneiðarNýrasneiðar af C57BL/6 músum voru notaðar fyrir ex vivo tilraunir eins og áður hefur verið lýst. 12 Í stuttu máli voru mýsnar fastaðar yfir nótt með frjálsan aðgang að vatni til að forðast hugsanleg áhrif jónainntöku í mataræði á fosfórýleringargildi NKCC2 og NCC. Nýru voru fjarlægð úr svæfðum dýrum, skorin í 280 µm þykkar sneiðar með titrandi örsneiðarvél (Vibratome, Microm; Thermo Scientific) og sett í Ringer's lausn (í mM): 98,5 NaCl, 25 NaHCO 3 , 3 KCl, 1 Na 2 HPO 4 , 2,5 CaCl 2 , 1,8 MgCl 2 og 25 glúkósa í 30 mínútur við 30,5 gráður með stöðugri loftbólu með 95 prósent O 2 og 5 prósent CO 2 . Í kjölfarið var Ringer lausninni skipt út fyrir svipaðar lausnir en með mismunandi Cl − (5 mM fyrir lágt Cl − , 110 mM fyrir eðlilegt Cl − ) og K plús styrk (3 mM fyrir eðlilegt K plús, 10 mM fyrir hátt K plús) fyrir 30 mínútur til viðbótar. Að lokum voru sneiðar snöggfrystar í fljótandi köfnunarefni.
TölfræðiUnpaired Student's t próf og Welch's próf ef um ójöfn dreifni var að ræða voru notuð til að bera saman tvo hópa (GraphPad Prism, útgáfa 8.0.2). Fyrir margfeldissamanburð var framkvæmt ein- eða tvíhliða ANOVA, fylgt eftir af Tukey's margfalda samanburði eftir próf (GraphPad Prism, útgáfa 8.0.2). Gögn eru sýnd sem meðaltal ± SEM (í töflum og myndum). Munur var talinn marktækur þegar P <>
VIÐTAKNINGAR Höfundarnir þakka Dr Gary Shull (University of Cincinnati, Cincinnait, OH) fyrir að útvega NCC-KO músunum, Dr Biff Forbush (Yale School of Medicine, New Haven, CT) fyrir "R5" pNKCC1 mótefnið sitt og Dr Henrik Dimke ( University of Southern Denmark, Odense, Danmörk) fyrir mús einstofna heildar NCC mótefni hans. Höfundarnir þakka einnig Monique Carrell og Inger Merete Paulsen fyrir tæknilega aðstoð og Dr Eszter Banki fyrir að veitanýrusýnishorn. Beinþéttnimælingar og hluti af þvagi og plasmagreiningu voru gerðar af Dr Petra Seebeck og Nadine Nägele (Zurich Integrative Nagdýralífeðlisfræði, University of Zurich) í sömu röð. Mjög vel þegið var mjög gagnlegt innlegg frá Dr Alicia McDonough (háskólanum í Suður-Kaliforníu) og dr Olivier Devuyst (háskólanum í Zürich).
HAGSMUNAÁREKSTUR Hópur JL fær þóknanir fyrir leyfisskyld mótefni gegn NCC og fosfórýleruðum Nedd4- 2 frá Milipore og Abcam í sömu röð. Bæði mótefnin voru ekki notuð í þessari rannsókn. Jafnframt hlaut JL árið 2019 heiðurslaun frá VIFOR fyrir munnlegan kynningu á málþingi á vegum VIFOR.